cuối kỳ quang học kỹ thuật

SẮC KÝ
Phương pháp tách trong đó cấu tử ( thành phần hóa học ) được phân bố giữa 2 pha
Pha tĩnh : giữ cấu tử ( rắn, lỏng )
Pha động : kéo cấu tử ra khỏi cột ( lỏng, khí )
Sắc ký phẳng
Tấm phẳng ( thường là thủy tinh ) tráng lớp pha tĩnh
Pha động ( thường là nước ) đựng trong khay
Nhúng tấm phẳng vào khay ( nơi xảy ra tác dụng của lực mao dẫn, nước dính vào tấm phẳng,
trọng lực kéo pha tĩnh đi xuống). Cấu tử có tương tác với mao dẫn sẽ thắng trọng lực và đi
lên, tương tác càng mạnh càng đi lên cao

Sắc ký cột ( pha tĩnh
động được cho chuyển
trọng lực, detector có
được thể hiện trên sắc ký
peak, peak tỷ lệ thuận với

được giữ trong cột và pha
động qua cột bởi áp suất hay
nhiệm vụ phát hiện cấu tử và
đồ, sắc ký đồ thể hiện các
số lượng cấu tử )

Rửa giải : (bơm 1 lần hết )pha động được chế vào với lưu lượng nhất định. A,B,C là các cấu
tử cần tách ,E là dung môi . Trên detector 3 peaks xuất hiện riêng biệt ( độ tinh khiết cao)
Tiền lưu : nhỏ theo thời gian ( pha động được bơm liên tục ) => chỉ có A đầu tiên là tinh
khiết, về sau không còn tinh khiết do các giọt bị trộn lẫn. Nhưng, tiền lưu có ưu điểm : nếu
chỉ lấy độ tinh khiết của A thì sẽ nhanh hơn do đổ liên tục pha động
* định lượng và định tính đều dựa vào detector

* một số trường hợp không cần detector để định lượng, có thể dùng t R ( thời gian lưu : biểu
thị time từ lúc mẫu đưa vào cột cho đến khi có sự nhận biết được chiều cao của peak lớn nhất
trên sắc ký đồ )
* tR thường không chính xác trong việc định tính do nhiều chất có t R gần giống nhau, thông
thường để định tính, kết hợp với Mass spectrometer hay Infrared spectrometer

Cơ chế tách
 Hấp thụ
 Rây ( phân tử ) : phân tử lớn ở lại, phân tử nhỏ rớt xuống
 Trao đổi ion
Trạng thái pha động : Sắc ký lỏng, sắc ký khí
Các hình thành sắc đồ
 Tiền lưu
 Rửa giải
 Đẩy
Thiết bị hình thành sắc đồ : sắc ký cột, sắc ký phẳng
* tách chất màu trong lá có các pp sau : sắc ký cột , sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy
Sắc ký lỏng ( Liquid Chromatography – LC ) :
Có khả năng phân tích những hỗn hợp mẫu cực kỳ phức tạp trong hóa học và trong khoa học
Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC – high performance liquid chromatography) có thể dò tìm
được lượng mẫu nhỏ đến 200 pg
* các loại sắc ký ( tùy thuộc cơ chế lưu)
Sắc ký lỏng – rắn ( sắc ký hấp thụ ) : pha tĩnh là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích.
Hệ số hóa lý là hệ số hấp thụ
Sắc ký trao đổi ion : pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề
mặt gắn những nhóm trao đổi ion


Sắc ký rây phân tử ( size exclusion chromatography ) : pha tĩnh là vật liệu có lỗ xốp. Các
phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lỗ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn. (kích

thước lỗ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách)
Sắc ký lỏng – lỏng (hiệu suất không cao) : pha tĩnh lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp.
Quá trình tách chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha tĩnh và động ( 2 pha đều lỏng).
Hệ số đặc trưng của quá trình là hệ số phân bố
Sơ đồ cấu tạo máy HPLC
Bình chứa dung môi => máy bơm => cột tách và van tiêm mẫu ( chứa trong lò nhiệt)=>
detector => computor
* cột tách (nhồi) đặt trong lò nhiệt => tạo nhiệt độ ổn định, nhiệt độ không ổn định thì t R và
vận tốc đi xuống bị ảnh hưởng
1. Bình chứa dung môi
Bình thủy tinh (trơn) có lỗ trên nắp gắn ống nhựa dẫn dung môi (pha động) từ bình đến bơm
Cần lọc tạp chất trong dung môi qua giấy lọc 0.45 µm trước khi dùng và nên có đầu lọc gắn
vào đầu ống nhựa trong bình chứa
Cần loại bỏ hoặc đuổi các không khí hòa tan hoặc bọt khí trong dung môi để trách nhiễu
đường nền. Loại bỏ bằng siêu âm hoặc sục khí trơ như heli
2. Bơm cao áp : vận chuyển pha động (dung môi) đi qua cột tách với tốc độ nhất định. Các
loại bơm thông dụng :
 Bơm tốc độ dòng hằng định (constant flow pump) : bơm kiểu syringe đẩy dung môi liên
tục, khi hết dung trong ống, bơm dừng lại
 Bơm kiểu piston thì đẩy hút luân phiên
3. Hệ thống tiêm mẫu
Tiêm mẫu bằng tay ( tiêm bằng ống tiêm syringe)
Tiêm mẫu tự động
* Tiêm với liều lượng xác định, nếu mẫu là rắn thì kèm thêm dung môi
4. Cột tách ( được nhồi pha tĩnh )
Được làm bằng vật liệu thép không rỉ ( thép Cr-Ni-Mo) với mặt trong cột được làm nhẵn
Kích thước phổ biến : đường kính ngoài 6.35 mm, đường kính trong 4.6mm và chiều dài
nhiều cỡ đến 25cm
Cột được nhồi các hạt có đường kính cỡ 3, 4, 5, 10 mirco mét. Chất nhồi trong cột thường là
silicagen, nhôm oxit, hạt polime xốp, hạt chất trao đổi ion

5. Detector
Detector UV – VIS (thiên về định lượng) : cho pha động từ cột được chảy qua một ống đo
nhỏ có chùm bức xạ đơn sắc UV/VIS chiếu qua. Đo phổ hấp thụ UV-VIS
Detector huỳnh quang (tốt cho định tính) : dùng cho các hợp chất có vòng liên hợp như các
hợp chất vòng thơm có nhiều nhân. Nhiều hợp chất không có phổ có thể chuyển sang các dẫn
xuất có phổ nhờ xử lý thuốc thử hợp lý


* chất nhuộm phát quang, đo nồng độ chất nhuộm => nồng độ chất không phát quang (do tỉ
lệ thuận với nhau)
Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive index detector) (đo chiết suất không chính xác do
chiết suất dễ bị ảnh hưởng bởi tạp chất) : detector thông dụng nhất do bất kỳ chất hòa tan nào
đều dò tìm được miễn chỉ số khúc xạ khác với dòng chảy của pha động nguyên chất
Detector đo độ dẫn điện (Conductivity detector) : xác định ion vô cơ, hữu cơ
Detector khối phổ ( mass spectrometry) : xác định phần lớn các chất hữu cơ ( hóa hơi
trước thích hợp sắc ký khí )
6. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu
* do phổ hiện thị hẹp nên dùng phân bố Gaussian để xem do nhiễu hay đó là phổ thật sự
Sắc ký khí ( Gas chromatography – GC)
1. Sắc ký khí - lỏng ( GLC)
- Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay
liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột.
- Mẫu phải được hóa hơi và được khí mang đưa đi qua cột, làm tăng khả năng tách các hợp
chất từ trong mẫu ban đầu.
2. Sắc ký khí – rắn (GSC) ( ưu tiên do dễ xử lý )
- Pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí.
- Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hỗn hợp có nhiệt độ sôi thấp
Cấu tạo hệ thống sắc ký khí ( cột nhồi và detector được đặt trong lò )
1. Khí mang( pha động )
- trơ về mặt hóa học như N2, H2, He, Ar, CO2,…

- Khí He và Ar thích hợp cho sắc ký nhiệt độ cao
- Khí N2 rẻ và dễ dàng làm tinh khiết nên được dùng nhiều
- việc chọn khí dựa vào loại detector được sử dụng
Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm các bộ điều chỉnh áp suất (pressure regulators), các
thiết bị đo áp suất (gauges), thiết bị đo tốc độ dòng, hệ thống lọc phân tử để tách nước và các
chất nhiễm bẩn khác
2. Bộ phận tiêm mẫu ( vào cột nhồi )
- Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo thể tích bơm có thể thay đổi từ
một vài đến 20 µl.
- Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công (microsyringe) và tiêm mẫu tự động
(autosamper)
3. Cột phân tích (pha tĩnh)
-Cột thường được làm bằng thép không rỉ, niken, thủy tinh.
- Cột nhồi chứa các hạt chất mang rắn được phủ một lớp pha tĩnh lỏng hoặc bản thân hạt rắn
là pha tĩnh (Al2O3, SiO2, cacbon, polymer, zeolite…). * đường kính cột nhỏ, uốn cong được
- Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản.


Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4 mm
và chiều dài 2-3 m. Giá thành thấp, nạp mẫu đơn giản, hiệu quả thấp.
Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0,2-0,5 µm), cột có
đường kính trong 0,1-0,5 mm và chiều dài 30-100 m. Hiệu quả cao, nhanh, thích hợp cho
hỗn hợp phức tạp.
4. Detector
Detector dẫn nhiệt ( thermal conductivity detector – TCD)
- Sự khác nhau về tính dẫn nhiệt của các khí là do tính linh động, nghĩa là tốc độ khí khuếch
tán tới và đi khỏi sợi đốt.
- Tốc độ của phân tử lại là hàm của trọng lượng phân tử, do đó phân tử càng nhỏ tốc độ
chuyển động càng cao, dẫn nhiệt càng tốt
- Heli là khí mang thông dụng được sử dụng cho detector đo độ dẫn nhiệt TCD. Bất kỳ chất

phân tích nào trộn với dòng khí He cũng làm giảm độ dẫn nhiệt của nó, sợi dây tóc trở nên
nóng hơn nên điện trở của nó tăng lên và thế áp vào sợi dây này thay đổi.

R3 : chứa khí Heli + khí của chất phân tích
R4 : điện trở mẫu dùng để so sánh
* độ chính xác không cao về mặt định lượng
b) Detector ion hóa ngọn lửa (Flame Ioniation Detetor - FID):
- Dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa được tạo bởi hỗn hợp khí H2 và O2 trong
không khí (nguồn ion hóa) và được đặt trong buồng điện cực.
- Khi khí mang đem theo các phân tử mẫu, các phân tử này bị bắn phá bởi các chùm hạt
electron tạo thành các hạt tích điện tạo thành dòng điện giữa hai điện cực. Các tín hiệu
được ghi lại dưới dạng các pic.
- Độ nhạy của detector FID cao hơn độ nhạy của detector TCD khoảng 100 - 1000 lần.
- Thích hợp nhất với hợp chất hữu cơ chứa cacbon. Một số hợp chất không thể phát hiện
bằng detector này như: CO, CO2, axit formic, formaldehit, H2S, H2O …


Columm : đầu ra cột nhồi
Detector cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector)
Detector quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector)
Detector NPD (Nitrogen Phospho Detector)
Detector khối phổ (MS-Mass Spectrometry): được sử dụng rộng rãi nhất nhưng đắt tiền.
Nếu chỉ cần biết những thông tin định tính để nhận diện các chất rửa giải, các detector khối
phổ và hồng ngoại là những chọn lựa tốt. Detector hồng ngoại giống detector đo độ dẫn
nhiệt thường không đủ nhạy cho những cột mao quản mở.
5. Bộ ghi nhận tín hiệu : ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện và hiển thị lên màn hình các thông
số liên quan, sắc ký đồ, các peak, …
Ứng dụng : SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ĐỂ PHÂN TÍCH
CHẤT TRONG THỰC PHẨM
1. Cấu tạo máy

Trong đó:
1: Bình chứa pha động.
2: Bộ phận khử khí
3: Bơm cao áp
4: Bộ phận tiêm mẫu
5: Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6: Đầu dò
7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu.
2 . Chuẩn bị máy
Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết
quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng
đèn ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.
Đặc biệt, cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi
ngờ về khả năng tách, và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký.
Ví dụ: Với sắc ký pha thuận NP-HPLC: Rửa bằng MeOH không rửa bằng nước
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC: Khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước
trước.
Trước khi mở máy phải kiểm tra các bình chứa dung môi pha động, nếu mực dung dịch
trong bình còn ít quá thì cần thêm dung môi. Đồng thời kiểm tra bình nước thải, nếu đầy thì
phải đem đổ.
3. Chuẩn bị pha động
Pha động trong HPLC được đưa liên tục vào hệ thống. Dung môi sử dụng cho
pha động cần phải sạch, có độ tinh khiết nhất định.
Trước khi gắn vào máy HPLC, dung môi phải được khử bọt khí, bởi vì nếu còn
lẫn bọt khí vào trong luồng dung môi đi vào máy sẽ làm cho máy bơm và đầu dò hoạt
động kém hiệu quả. Có thể khử khí bằng cách cho một luồng khí helium xục mạnh vào
bình với vận tốc 300ml/phút trong vài phút, bong bóng khí helium sẽ đuổi bọt khí ra

khỏi bình. Dung môi bão hòa helium không ảnh hưởng gì đến quá trình sắc kí. Cũng
có thể khử khí bằng cách đặt bình đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy hoạt động
trong 5 – 10 phút.
Dung môi và đệm cần lọc thật kỹ (dưới lỗ lọc 0,45 µm) đuổi khí pha động; hạn
chế dùng đệm, nếu có dùng thì dùng đệm acetate tốt hơn là đệm phosphate. Nếu sử


dụng dung môi là nước thì cần phải cẩn thận vì trong môi trường nước vi khuẩn có thể
sinh sản, cần thường xuyên thay nước (phòng tránh các hạt gây ra hỏng máy hay tắc
đầu cột), có thể dùng sodium azid 0,04 làm chất diệt khuẩn trong nước.
Dung môi của Merck có những ưu điểm sau: khi sử dụng không cần phải lọc,
không dùng chất ổn định trong dung môi (vì chất ổn định thường tạo tạp), không chứa
clo trong dung môi (vì nếu có clo dưới tác dụng của ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng làm
hỏng cột). Nếu sử dụng dung môi có chất lượng thấp khi chạy máy sẽ xuất hiện những
peak lạ và có thể làm nghẹt cột hoặc hỏng máy, vì vậy đối với pha động phải sử dụng
dung môi thật sạch và có độ tinh khiết cao.
4. Chuẩn bị mẫu
Xử lí mẫu là quá tình hòa tan và phân hủy, phá hủy cấu trúc mẫu ban đầu lấy từ
đối tượng cần phân tích, để giải phóng và chuyển hóa chất cần xác định về một dạng
đồng thể phù hợp cho một phép đo đã chọn để xác định hàm lượng của chất mà chúng
ta mong muốn.
Xử lí mẫu có hai quá trình xảy ra đồng thời là:
- Phá hủy cấu trúc ban đầu của mẫu.
- Hòa tan giải phóng chất cần xác định.
Lý do phải xử lý mẫu:
Để đưa các chất cần xác định về một trạng thái thích hợp cho phép đo, theo
phương pháp phân tích đã chọn.
-Các kết quả phân tích phải phản ánh và đại diện đúng cho đối tượng cần
nghiên cứu, theo dõi.
-Với bất kì một phương pháp xác định, mỗi chất cần phân tích chỉ có thể được

xác định chính xác khi nó tồn tại ở một trạng thái nhất định và đồng nhất phù hợp
với kĩ thuật phân tích.
-Mẫu phân tích có nhiều chủng loại, đa dạng, có thành phần đơn giản đến loại
có thành phần phức tạp. Chúng có thể tồn tại ở các dạng khác nhau như rắn từng


cục, từng mảnh, hay lỏng, khí, huyền phù. Không thể cho nguyên mẫu như thế
vào máy để đo và xác định được. Phải xử lí để đưa các chất phân tích về trạng
thái phù hợp nhất cho một phưong pháp đã được chon để xác định nó.
-Các chất cần xác định tồn tại ở trạng thái liên kết hóa học khác nhau, trong các
hợp chất vô cơ, hữu cơ khác nhau, có khi rất bền vững, lượng chất ở mỗi vị trí
trong mẫu cũng không đồng đều, nên không thể xác định đúng hàm lượng của nó
trong một tổ hợp phức tạp, bền vững và bị các nguyên tố, các chất liên kết khác
cản trở, do đó cần phải xử lí mẫu để phá vỡ các hợp chất mà chất phân tích đang
tồn tại, đưa chúng sang một dạng phù hợp để định lượng tốt và đúng theo phương
pháp đã chọn.
*1 số kĩ thuật xử lý mẫu:
Kĩ thuật vô cơ hóa khô (xử lí khô).
-Kĩ thuật vô cơ hóa ướt (xử lí ướt).
-Kĩ thuật vô cơ hóa khô – ướt kết hợp.
-Các kĩ thuật chiết (lỏng-lỏng, chiết rắn – lỏng, chiết rắn – khí,...)
-Các kĩ thuật sắc kí,....
Quy trình xử lý:
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường
hợp dung môi pha động được dùng để hòa tan hoạt chất mẫu.
-Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động họăc không rửa giải được bằng
cách chiết, lọc. Phải lọc và li tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45µm.
-Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể
gây ra ngẽn cột.
-Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi,

riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng
nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành
phần.


5. Nguyên tắc hoạt động
-Hệ thống dung môi (1) đóng vai trò dung môi động được trộn với nhau theo tỉ lệ
thích hợp (điều kiển bằng máy tính) và có thể thay đổi thành phần bởi hệ thống xử khí (2)
-Pha động được bơm liên tục qua cột tách bằng hệ thống bơm cao áp (3)
-Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu (4), sau đó được pha
động đẩy vào cột tách (5), quá trình tách xảy ra ở đây.
-Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào detector (6)
thích hợp và được chuyển thành thế hiệu điện rồi được khuếch đại và chuyển đến bộ phận
tự ghi và xử lí kết quả ở (7).
*Cần lưu ý:
-Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.
-Thời gian lưu của mẫu: Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (pic)
hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố:
+ Áp suất đầu vào
+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt)
+ Thành phần dung môi
+ Nhiệt độ cột.
Qúa trình dịch kết quả:
Kết quả ra thường gồm một dãy pic, mỗi pic đại diện cho một hợp chất trong hỗn hợp
đi qua cột hấp phụ và hấp thụ tia UV. Ta có thể điều khiển điều kiện của cột hấp phụ và
thời gian lưu để xác định sự có mặt của các hợp chất. Những tham số điều khiển này đã
được đo trước với các mẫu thử.
Tuy nhiên, từ các peak này ta còn có thể định lượng được các hợp chất. Giả sử có một
hợp chất X. Chúng ta đưa một dung dịch có một lượng hợp chất X đã biết trước vào máy.
Từ đó, có thể xác định được thời gian lưu cũng như sự tương ứng giữa khối lượng chất X

và hình ảnh của peak. Diện tích bên dưới peak ứng với số lượng chất X đi qua máy dò và
diện tích này có thể tính được nhờ máy tính nối với màn hình


Kết hợp với một máy ghi phổ khối: Một máy ghi phổ khối sẽ biến đổi các peak
thành các vạch. Từ đó so sánh với dữ liệu có sẵn, chúng ta sẽ biết được sự có mặt của nhiều
hợp chất mà không cần quan tâm đến thời gian lưu của chất đó khi đi qua cột hấp phụ
PHÂN CỰC ÁNH SÁNG
Sự phân cực (Polarization): hiện tượng vector cường độ điện trường E dao động bị giới hạn
phương dao động.
Ánh sáng không phân cực (ánh sáng tự nhiên): Vector E dao động theo mọi phương.
* phương dao động không cố định và độ dài vector không cố định ( E,B cùng pha)
Ánh sáng phân cực toàn phần (phân cực thẳng): vector E chỉ dao động theo một phương
xác định.
Ánh sáng phân cực một phần: vector E dao động theo mọi phương vuông góc với tia sáng,
nhưng có phương dao động mạnh, có phương dao động yếu (phân cực tròn, elip)
* tròn : E, B lệch pha ¼ T or lệch nhau ± pi/2
* elip : lệch tùy ý
Nguyên nhân : phản xạ, tán xạm khúc xạ, truyền qua
* sự phân cực phụ thuộc vào góc tới của sóng ánh sáng
Khi góc tới bằng 0 hoặc bằng 900: sóng ánh sáng không bị phân cực.
Khi tổng góc tới và góc khúc xạ bằng 900: sóng phản xạ phân cực toàn phần, sóng khúc xạ
phân cực một phần.
Các trường hợp khác: cả hai sóng khúc xạ và phản xạ đều phân cực một phần.
Sóng khúc xạ không bao giờ bị phân cực toàn phần
Định luật MALUS ( tỷ lệ ánh sáng lọt qua)
Khi ánh sáng truyền qua bản phân cực là phân cực hoàn toàn, cường độ I của ánh sáng truyền
qua các bản phân cực sẽ tỉ lệ thuận với bình phương của góc giữa trục truyền của hai bản
phân cực: I = I0cos2θ
Ứng dụng

Phương pháp dùng hệ thống phân cực ánh sáng trong chẩn đoán và theo dõi bệnh tiểu
đường
Cơ sở lý thuyết
- Kỹ thuật phân tích dựa trên phương pháp đo phân cực Stokes và phương pháp phân tách ma
trận Mueller được sử dụng cho việc đo các tính chất quang học ánh sáng của huyết tương
người
- Hệ thống phân cực quang học được thiết lập nhằm đo đạc và phân tích các thông số quang
học của người có pha D-glucose trong huyết tương
Tính chất phân cực của ánh sáng được tán xạ từ môi trường mờ đục
Phương pháp đo


+ Phân tích để xác định đặc tính quang học của mẫu sinh học : lưỡng chiết phẳng, lưỡng sắc
phẳng, lưỡng chiết tròn, lưỡng sắc tròn, khử cực thẳng, khử cực tròn
+ Ánh sáng đầu vào được cung cấp bởi một laser He – Ne 1 kính phân cực và kính ¼ bước
sóng để tạo ra 4 chùm sáng phân cực thẳng 100 450 900 và 1350 và 2 chùm tia sáng phân cực
tròn ( phải và trái )
+ Cuối là 1 bộ lọ cường độ trung lập để đảm bảo mỗi ánh sáng phân cực đầu vào có 1 cường
độ đồng nhất như nhau
+ Thông số đầu ra Stokes tính từ các phép đo
- Hiệu chỉnh máy gồm việc điều chỉnh các trạng thái phân cực của ánh sáng đầu vào và góc
quay ánh sáng. Hiệu chỉnh đảm bảo hệ đo quang học đồng nhất và chính xác, hệ đo thẳng
hàng => mối tương quan giữa nồng độ đường trong nước, thể mờ đục và góc quay quang học
Kết quả
Sự biến thiên của góc quay quang học lưỡng chiết tròn với nồng độ D-glucose trong huyết
tương người => sự tuyến tính xuất hiện giữa 2 đại lượng này


PHƯƠNG PHÁP ĐẾM TẾ BÀO DÒNG CHẢY (FLOW CYTOMETRY)
Phân tích tế bào theo dòng chảy (FCM) được sử dụng để đếm và phân loại tế bào bằng cách

đưa tế bào vào một dòng chất lỏng, sau đó cho đi qua một thiết bị dò điện tử.
FCM cho phép đồng thời phân tích đa thông số các đặc tính hóa lý của tế bào với tốc độ có
thể lên đến hàng ngàn tế bào mỗi giây
1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng
* hệ thống dòng
Dòng dịch bên ngoài (sheath fluid) - dòng bao, có tác dụng nắn chỉnh dòng dịch chứa mẫu
bên trong.
Dòng dịch bên trong (core fluid) - dòng lõi, là dòng hẹp tới mức tế bào trong mẫu chỉ đi qua
khe hẹp theo từng hạt một tạo thành dòng tế bào đơn với tốc độ rất cao lên đến hàng ngàn hạt
một giây
Tiết diện dòng lõi có thể điều chỉnh bằng độ chênh lệch áp suất giữa 2 dòng để phù hợp với
yêu cầu phân tích
Dịch dùng dòng bao phải không làm tan tế bào, không ảnh hưởng độ chiết quang và huỳnh
quang của hệ thống
Một số dòng máy sử dụng ống vi mao thay cho dòng bao
* Tạo dòng chảy ( ultrasonic transducer)
Tạo sóng âm ( siêu âm( sóng cơ học) ), áp suất trong dòng bao tỉ lệ thuận cường độ sóng siêu
âm ( sóng siêu âm làm các phân tử chuyển động gây va chạm sinh ra áp suất )
2. Hệ thống quang học
+ Nguồn sáng: thường là đèn laser 488 nm, 635 nm...
+ Kính lọc: các loại kính lọc khác nhau.




Band pass optical filter
Long pass optical filter
Dichroic Long pass optical filter

+ Hệ thu tín hiệu quang học:

Forward Scatter Chanel: thu nhận ánh sáng tán xạ thẳng  phản ánh kích thước tế bào, tế bào
càng lớn thì chỉ số FSC càng lớn.
Side Scatter Chanel: thu nhận ánh sáng tán xạ góc bên  phản ánh độ phức tạp của nhân và
bào tương tế bào: SSC của quần thể tế bào lympho thấp nhất, của bạch cầu hạt đa nhân cao
nhất.
Fluoressen Light: thu nhận ánh sáng huỳnh quang, nếu tín hiệu huỳnh quang yếu cho đi qua
ống nhân quang Photo Multiplier Tube giúp khuếch đại tín hiệu quang.
* signal FS : kích thước => hồng or bạch cầu


SS : có hay không nhân, đa hay đơn bào
FL : nhuộm màu trước => chế độ ánh sáng phát quang
3. Hệ thống điện tử
Các tín hiệu ánh sáng tán xạ huỳnh quang sau khi được khuếch đại sẽ được hệ thống điện tử
chuyển thành tín hiệu số và biểu diễn dưới các dạng biểu đồ, đồ thị khác nhau.
Nguyên lý hoạt động
- Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng sẽ tương tác với laser và tế bào/vật thể đó
sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ thẳng và tán xạ bên) :
+ Ánh sáng tán xạ góc thẳng sẽ được thu nhận qua các kênh FSC (Forward Scatter Chanel).
Do được thu nhận thẳng góc (song song) với trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc thẳng
phản ánh kích thước tế bào/vật thể phân tích
+ Ánh sáng tán xạ góc bên sẽ được thu nhận qua kênh SSC (Side Scatter Chanel). Do được
thu nhận ở góc bên (90 độ) theo trục ánh sáng nguồn, ánh sáng tán xạ góc bên phản ánh độ
phức tạp nhân và bào tương của tế bào
+ Nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm huỳnh quang, dưới kích thích của nguồn sáng, chất đó
sẽ phát huỳnh quang, các tín hiệu huỳnh quang (FL-Fluoressen Light) từ phức hợp kháng thể
kháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnh quang
và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube).

- Sau đó các tia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc. Với hệ thống kính lọc này các tia sáng

tán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tín hiệu một
cách chính xác
- Các tín hiệu của ánh sáng tán xạ và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT
sẽ được hệ thống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạng
biểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phần mềm chuyển
đổi chuyên dụng theo máy.
CƠ CHẾ NHUỘM KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT
- Trên bề mặt các tế bào đích có các kháng nguyên đặc trưng cho từng quần thể. VD: tế bào
T-CD4 có các kháng nguyên đặc trưng CD3 và CD4.
- Sử dụng các kháng thể đơn dòng có gắn chất phát huỳnh quang có khả năng gắn đặc hiệu
với các kháng nguyên bề mặt tế bào.
- Các tế bào có kháng nguyên bề mặt gắn đặc hiệu với kháng thể có gắn chất phát huỳnh
quang khi đi qua chùm laser sẽ phát quang
 nhận diện tế bào gián tiếp qua việc phân tích mật độ huỳnh quang


ỨNG DỤNG CỦA FLOW CYTOMETRY
 Xác định sự có mặt của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lympho T-CD4,
xác định dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầu lưới, định danh vi
khuẩn…
 Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất kháng thể đơn dòng,
các quần thể tế bào miễn dịch, thu nhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y…
 Phân tích chu kỳ DNA/tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự
bất thường trong bộ NST, tổn thưởng DNA, nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng ung thư
trên tế bào đích
Bài của K16 : Thiết bị soi răng bằng tia hồng ngoại
Cấu tạo

- Khối nguồn : khối hiển thị và lưu trữ hình ảnh
- Khối LED : chọn LED phù hợp với từng phương pháp

+ Phương pháp tán xạ LED bước sóng 850nm, công suất 1W, góc mở 120 0, dòng 500mA, áp
1.5 – 1.8V
+ Phương pháp truyền qua : LED tăng công suất 0.7W/ cụm, áp 12/6 pcs
- Khối điều khiển : Tùy vào hình ảnh muốn nhận chọn mức điện trở tương ứng của Led :
mức 1-5 : 0.1Ω, 100Ω, 300Ω, 500Ω, 1000Ω
- Khối camera : chọn camera có thuộc tính sau
Kích thước : 17cm x 2cm x 1cm
Cảm biến : CMOS
Tiêu cự : auto focus 20 – 30 mm
Độ phân giải : 2M pixels
- Tùy vào phương pháp ta có thể chọn thiết kế
Nguyên lý


- Tương tác giữa răng và ánh sáng IR
Men răng : ít nước, độ khoáng cao => ít hấp thụ ánh sáng hồng ngoại => gần như trong suốt
Ngà răng : nhiều thành phần hữu cơ và nước nhiều hơn men => hấp thụ ánh sáng hồng ngoại
nhiều hơn men => màu đục trên ảnh
Khi răng bị tổn thương :
+ Mảng bám và men đổi màu => bản chất vẫn khỏe => ảnh không tối màu
+ Khi bị mất khoáng => mật độ khoáng giảm, nước len vào => nước hấp thụ ánh sáng hồng
ngoại => tạo thành vùng tối màu
Phương pháp chẩn đoán
+ Phương pháp truyền qua : chụp mặt bên
Tia hồng ngoại xuyên qua răng => phần bị hư tổn có nhiều nước hấp thụ IR => màu tối.
Chọn bước sóng 750 -850 nm vì nó ít ảnh hưởng tới tia IR nhất

+ Phương pháp tán xạ : chụp mặt nhai của răng. Men mất khoáng, khi chiếu tia IR vào =>
nơi mật độ khoáng giảm => ánh sáng bị tán xạ nhiều lần => màu bị tối. Chọn λ = 750 -850
nm

+ Phương pháp phản xạ : chụp mặt nhai. Nước và men hấp thụ mạnh => bước sóng 1400 –
1500 nm

Đánh giá


Ưu điểm : phát hiện được các tổn thương rốn, độ phân giải cao hơn phương pháp chụp Xquang để nhìn thấy các tổn thương nhỏ, không có hại với sức khỏe, ít hạn chế người chụp,
phân biệt được một vài tổn thương chung biểu hiện mặt ngoài, do độ xuyên sâu cao nên tia
X- quang không chụp được mặt nhai nhưng IR có thể
Hạn chế : Bộ phận linh kiện khó tìm kiếm hơn phương pháp lâm sàng. X- Quang thấy rõ các
tổn thương bên trong. Vì là phương pháp chưa được áp dụng phổ biến => ngân hàng dữ liệu
ít => cần đào tạo nguồn nhân lực chẩn đoán hình ảnh