Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ph đến quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường dịch dưa chuột (cucumis sativus l 1753)

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

======

LÊ THU THUỶ

ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐỘ pH ĐẾN
QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT
(CUCUMIS SATIVUS L.1753)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI - 2019


TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN

======

LÊ THU THUỶ

ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ ĐỘ pH ĐẾN
QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG BIOCELLULOSE
TRÊN MÔI TRƢỜNG DỊCH DƢA CHUỘT
(CUCUMIS SATIVUS L.1753)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

ThS. Nguyễn Thị Kim Ngoan

HÀ NỘI - 2019


LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu
sắc nhất tới cô giáo, ThS. Nguyễn Thị Kim Ngoan, ngƣời đã tận tình chỉ bảo
và giúp đỡ em thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn
Di truyền – Công nghệ sinh học, Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ
phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều
kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm
khoa Sinh - KTNN, Trung tâm thông tin thƣ viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh
vật Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời thân, những
ngƣời luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học
tập, tiến hành và hoàn thiện đề tài.
Hà Nội, Ngày

tháng

năm 2019

Sinh viên thực hiện

Lê Thu Thủy


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất cả
những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn
toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt. Đề tài nghiên cứu này không trùng
với công trình nghiên cứu của các tác giả khác.
Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em xin
phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.
Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.
Hà Nội, Ngày

tháng

năm 2019

Sinh viên thực hiện

Lê Thu Thủy


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ................................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................. 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn............................................................................... 2
5. Tính mới của đề tài................................................................................................ 3
NỘI DUNG ............................................................................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 4
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới...................... 4
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới ................................. 4
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter .................................................. 4
1.2. Biocellulose (BC) ............................................................................................... 6
1.2.1. Cấu trúc ........................................................................................................... 6
1.2.2. Một số tính chất ............................................................................................... 7
1.2.3. Cơ chế tổng hợp .............................................................................................. 8
1.2.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ...................... 9
1.3. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................... 10
1.3.1. Nhiệt độ ......................................................................................................... 10
1.3.2. Độ pH ............................................................................................................ 10
1.3.3. Độ thông khí .................................................................................................. 10
1.4. Ứng dụng của màng Biocellulose .................................................................... 10
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay....................... 11
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới................................................................ 11
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................... 11
1.6. Dƣa chuột Cucumis sativus .............................................................................. 12


1.6.1. Thành phần dinh dưỡng ................................................................................ 12
1.6.2. Ứng dụng ....................................................................................................... 12
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất ................................................................... 14
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 14
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu .................................................................... 14
2.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 15

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................. 16
2.3.1. Phương pháp vi sinh ..................................................................................... 16
2.3.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phương pháp
truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) ............................ 16
2.3.1.2. Quan sát đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản
nhuộm kép. .................................................................................................. 17
2.3.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng ...... 17
2.3.1.5. Phương pháp lên men tạo màng Biocellulose ........................................... 18
2.3.2. Phương pháp hóa sinh .................................................................................. 18
2.3.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase....................................................................... 18
2.3.2.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxi hóa ethanol thành acid acetic ......... 18
2.3.2.3. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic .................................................... 18
2.3.2.4. Xác định khả năng tổng hợp cellulose ....................................................... 19
2.3.3. Phương pháp cảm quan ................................................................................ 19
2.3.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose ................. 19
2.3.5. Phương pháp toán học .................................................................................. 19


CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 21
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột................................................................... 21
3.1.1. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter từ môi trường dịch dưa chuột ......... 21
3.1.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu ......................................................................... 21
3.1.1.2. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng
Biocellulose ................................................................................................. 21
3.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose dai,
mỏng ............................................................................................................ 24
3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và độ pH tới khả năng tạo màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột................................................................... 27
3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose ........ 27

3.2.2. Ảnh hưởng của độ pH tới khả năng lên men tạo màng Biocellulose ........... 29
3.2.3. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã chọn
(MT4) .......................................................................................................... 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 33
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Sợi cellulose của màng Biocellulose ...................................................... 7
Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp cellulose ở Gluconaccetobacter ................... 9
Hình 3.1. Chủng giống vi khuẩn Gluconacetobacter .......................................... 22
Hình 3.2. Khả năng oxi hóa acid acetic của vi khuẩn Gluconacetobacter .......... 24
Hình 3.3. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram ở độ
phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học.......................................... 25
Hình 3.4. Màng Biocellulose do chủng vi khuẩn T6 và T9 tạo ra ........................ 26
Hình 3.5. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men tạo
màng Biocellulose. ................................................................................ 28
Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng của độ pH tới quá trình lên men tạo
màng Biocellulose ................................................................................. 30
Hình 3.7. Màng Biocellulose thu đƣợc ở môi trƣờng chọn lọc MT4 .................. 31


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ................. 6
Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng Biocellulose ............................................... 25
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới sự hình thành màng Biocellulose ........... 28
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của độ pH tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose .. 30

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nhƣ chúng ta đã biết hiện nay công nghệ sinh học đang dần dần trở thành một
ngành kĩ thuật chiếm giữ vị trí chủ đạo của nhiều quốc gia phát triển trên toàn
thế giới. Là một bộ phận của công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang
phát triển mạnh mẽ với những thành tựu to lớn và có ý nghĩa trong đời sống đặc
biệt trong các ngành nhƣ: công nghiệp, nông nghiệp, y học. Một trong những
nguồn nguyên liệu đã và đang đƣợc quan tâm hiện nay đó là cellulose vi khuẩn
hay Bacterial cellulose (BC). Màng sinh học Biocellulose do vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực
vật, nhƣng không chứa các hợp chất cao phân tử nhƣ: ligin, peptin,
hemicellulose, và sáp nến. Do đó chúng có các đặc tính vƣợt trội hơn về độ dẻo
dai, độ bền, độ chắc khỏe và độ đàn hồi. Bởi những đặc tính ƣu việt đó nên màng
Biocellulose đƣợc xem nhƣ là một nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng, đƣợc
ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau nhƣ: trong công nghiệp sản xuất
giấy, màng Biocellulose đƣợc dùng để sản xuất giấy điện tử chất lƣợng cao;
trong công nghệ môi trƣờng màng Biocellulose đƣợc sử dụng làm màng phân
tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown,1989; Jonas và
Fonah,1998). Trong y học, màng Biocellulose đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời
trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mặt nạ dƣỡng da cho con ngƣời; Ngoài
ra, màng Biocellulose còn đƣợc ứng dụng trong công nghệ sản xuất pin, làm môi
trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm.
Để nuôi Gluconacetobacter ngƣời ta thƣờng dùng: nƣớc vo gạo, nƣớc dừa già,
nƣớc mía, rỉ đƣờng. Các loại môi trƣờng này đã đƣợc nghiên cứu khá nhiều.Gần
đây, phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà
Nội 2 đang tiến hành lên men tạo màng Biocellulose trên môi trƣờng dịch dƣa
chuột Cucumis sativus để ứng dụng vào việc làm mặt nạ dƣỡng da cho con
ngƣời. Đối với chị em phụ nữ thì việc đắp mặt nạ tự nhiên và mặt nạ từ trái cây

là cách dƣỡng da khá đơn giản, ít tốn kém mà lại rất hiệu quả. Từ lâu nay, đắp

1


mặt nạ bằng dƣa chuột Cucumis sativus đã trở thành một công thức dƣỡng trắng
đƣợc khá nhiều bạn gái yêu thích và áp dụng với nhiều lí do:khá dễ tìm, giá
thành rẻ và có chứa vitamin A, B1, B2, C, và các chất vi lƣợng nhƣ sắt, mangan,
iod cung cấp chất dinh dƣỡng cho da khi dùng làm mặt nạ đắp mặt.
Quá trình lên men tạo màng trên môi trƣờng dịch dƣa chuột cũng chịu ảnh
hƣởng của rất nhiều nhân tố sinh thái nhƣ: nguồn Cacbon, Nitơ, nhiệt độ, pH
môi trƣờng. Các nhân tố này ảnh hƣởng trực tiếp đến thời gian tạo màng của vi
khuẩn cũng nhƣ chất lƣợng và tính thẩm mỹ của màng. Chính vì vậy, chúng tôi
quyết định lựa chọn đề tài “Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ pH đến quá trình tạo
màng Biocellulose trên môi trường dịch dưa chuột (Cucumis sativus L.1753)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Xác định đƣợc nhiệt độ, độ pH thích hợp cho quá trình tạo màng Biocellulose
trên môi trƣờng dịch dƣa chuột.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose
trên môi trường dịch dưa chuột.
3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus T6.
3.3. Ảnh hưởng của độ pH tới khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter xylinus T6.
3.4. Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã chọn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Điều kiện môi trƣờng có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của vi
khuẩn Gluconacetobacter. Điều kiện về nhiệt độ, độ pH quyết định đến khả năng

hình thành màng Biocellulose. Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung

2


cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter trong
đời sống.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nghiên cứu góp phần tìm hiểu quá trình làm mặt nạ dƣỡng da, từ đó đƣa
các chủng vi sinh vật có đặc tính cho màng Biocellulose dai, mỏng tuyển chọn
đƣợc vào sản xuất mặt nạ dƣỡng da, đáp ứng nhu cầu làm đẹp của con ngƣời.
5. Tính mới của đề tài
Tìm ra điều kiện thích hợp của môi trƣờng lên men tạo màng Biocellulose của
chủng vi khuẩn Gluconacetobacter: nhiệt độ là 30oC và pH = 5 là điều kiện thích
hợp nhất cho quá trình lên men tạo màng.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Đã từ lâu vi khuẩn acetic nói chung và đặc biệt là Gluconacetobacter nói riêng
đã và đang thu hút đƣợc sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergrey thì Gluconacetobacter thuộc
chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonasdales, lớp
Schizomycetes. Gluconacertobacter thuộc nhóm vi khuẩn acetic, có khả năng tạo
ra nhiều cellulose tự nhiên nhất, mỗi tế bào có thể chuyển hóa 108 phân tử
glucose thành cellulose trong vòng 1 giờ. Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn

acetic nói chung và vi khuẩn Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan
điểm khác nhau. Vì vậy cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này.
1.1.2. Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter
Đặc điểm hình thái, tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thƣớc
khoảng 2 μm đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, không có bào tử, không có
khả năng di động. Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí,
dị dƣỡng. Các tế bào đƣợc bao bọc bởi màng nhày có chứa hemicellulose nên
khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iod sẽ bắt màu xanh và khi nhuộm fucshin thì
bắt màu hồng (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid
acetic trong môi trƣờng. Khi nồng độ acid acetic cao vƣợt giới hạn cho phép, nó
ức chế hoạt động của vi khuẩn.
Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trƣờng thạch đĩa, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc

4


trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trƣờng. Vi khuẩn
Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trƣờng dịch thể ở điều kiện tĩnh,
chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào
vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose.
Ngƣợc lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ với kích
thƣớc không đều nhau và phân tán trong môi trƣờng dinh dƣỡng tạo ra những
đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh.
Đặc điểm sinh lý - sinh hóa
Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 – 35oC, pH = 4 - 6.
Nhiệt độ và pH tối ƣu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn

ngay cả trong môi trƣờng tối ƣu.
Gluconacetobacter có khả năng chịu đƣợc pH thấp, vì thế thƣờng bổ sung
thêm acid acetic và môi trƣờng nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
Đặc điểm sinh hóa
Năm 1950, Frateur đã chính thức đƣa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào
các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính
catalase,…; Theo quan điểm này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes.
Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi đƣợc trình bảng dƣới
đây:

5


Bảng 1.1: Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Hiện tƣợng

Kết
quả

STT

Đặc điểm

1

Oxy hóa ethanol thành
acid acetic

Chuyển hóa môi trƣờng chứa

Bromphenol Blue 0,04% từ màu
xanh sang màu vàng.

+

2

Hoạt tính catalase

Hiện tƣợng sủi bọt khí.

+

3

Sinh trƣởng trên môi
trƣờng Hoyer

Sinh khối không phát triển

4

Chuyển hóa glycerol
Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau
thành dihydroxyaceton lên men.
Chuyển hóa glucose
thành acid

Có vòng sáng xuất hiện xung
quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng

thạch đĩa có chứa CaCO3.

6

Kiểm tra khả năng
sinh sắc tố nâu

Sắc tố nâu không đƣợc hình thành.

7

Kiểm tra khả năng
tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất hiện có màu
lam.

5

-

+

+

-

+

1.2. Biocellulose (BC)

1.2.1. Cấu trúc
So với cellulose thực vật (PC - Plant Cellulose) thì Biocellulose có đƣờng kính
rất nhỏ chỉ bằng 1/100 màng Biocellulose đƣợc cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng. Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose
thực vật, nhƣng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau.

6


Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo
thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thƣớc 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn
hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo
dải lớn. Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải
lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc Van Der Waals tạo thành cấu trúc
mạng lƣới hay một lớp màng mỏng. Kích thƣớc bên của màng tăng lên khi quần
thể vi khuẩn sinh trƣởng [8], [9], [23].

Hình 1.1.Sợi cellulose của màng Biocellulose
1.2.2. Một số tính chất
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác
mà đƣợc cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song cấu thành
mạng lƣới cellulose [1].
Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:
+ Độ bền cơ học: có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lƣợng lớn, ổn định
về kích thƣớc.

7

+ Tính hút nƣớc: màng Biocellulose có khả năng giữ nƣớc tốt lên đến 99%, có
tính tơi xốp, độ ẩm cao.
+ Độ tinh sạch: độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với cellulose khác, có thể phân
hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
+ Có thể kiểm soát đƣợc kích thƣớc, cấu trúc và chất lƣợng của cellulose (kiểm
soát đƣợc cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose.
Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp mà không gắn
lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật. Vì vậy, cellulose vi
khuẩn đƣợc xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ƣu thế trong tƣơng lai [8], [12].
1.2.3. Cơ chế tổng hợp
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bƣớc đƣợc
điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại
enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [15], [17]. Theo tác giả
Alina Krystynowics và cộng sự có 4 ennzyme tham gia xúc tác tổng hợp
cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase, Phosphoglucomutase,
Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay
UGP), Cellulose synthase (CS). Trong đó UGP là enzyme có vai trò quan trọng
nhất.
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn đó là: Giai đoạn polymer
hóa và giai đoạn kết tinh.

8


Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconaccetobacter
1.2.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Lớp màng đƣợc tạo ra bởi vi khuẩn Gluconacetobacter có bản chất là
cellulose, hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trƣờng nên đã ngăn cản sự
cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện cho quá trình đấu
tranh sinh tồn của Gluconacetobacter. Với khả năng giữ nƣớc tốt lên đến 99%

nên màng cellulose có thể giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dƣỡng để sử
dụng và làm cho tế bào có thể chống lại những ảnh hƣởng không tốt của tia tử
ngoại. Cùng các tính chất đặc trƣng về độ dẻo dai và tính thấm nƣớc, màng
cellulose đã giúp các tế bào vi khuẩn kháng lại đƣợc những thay đổi không thuận
lợi trong môi trƣờng sống nhƣ: độ ẩm giảm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc
hại,…Từ đó, các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể sinh trƣởng và phát triển tốt
bên trong lớp vỏ bao.
Một số thực nghiệm đã chỉ ra cho chúng ta thấy khá rõ về chức năng của màng
cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter khỏi các tia cực tím nhƣ sau: Có
khoảng 23% số tế bào vi khuẩn đƣợc bao bọc bởi cellulose sống sót sau 1 giờ xử
lý tia cực tím. Khi tách lớp cellulose ra khỏi tế bào thì khả năng sống sót của
chúng giảm xuống còn 3% [30].

9


Hơn nữa, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn
Gluconacetobacter có thể tồn tại ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trƣờng lỏng và môi
trƣờng không khí. Nhờ vào mạng lƣới này mà các tế bào vi khuẩn có thể bám
chặt và thu nhận các chất dinh dƣỡng dễ dàng hơn là khi không có mạng lƣới
cellulose.
1.3. Điều kiện nuôi cấy
1.3.1. Nhiệt độ
Theo Beyger, trong ngƣỡng điều kiện nhiệt độ thích hợp của vi khuẩn
Gluconacectobacter vào khoảng 25 - 35oC thì vi khuẩn sẽ sinh trƣởng phát triển
tốt. Còn ở mức nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến một mức nào đó sẽ kìm
hãm sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ không đƣợc cao.
1.3.2. Độ pH
Môi trƣờng có độ pH thấp chính là môi trƣờng thuận lợi nhất để vi khuẩn
Gluconacectobacter phát triển, sinh sôi nảy nở. Do đó trong môi trƣờng nuôi cấy

cần bổ sung acid axetic, nhằm acid hóa môi trƣờng, đồng thời acid axetic còn có
tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của các vi khuẩn có hại.
1.3.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacectobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do đó, điều
kiện tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế độ
thông khí quyết định đến năng suất tổng hợp Biocellulose.
1.4. Ứng dụng của màng Biocellulose
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học thì màng Biocellulose
ngày càng gây đƣợc sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới và
tại Việt Nam. Do đặc tính vƣợt trội về độ dẻo dai, độ bền chắc, độ đàn hồi nên
màng Biocellulose đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực nhƣ: công
nghiệp, y học, thực phẩm. Đặc biệt gần đây, màng Biocellulose còn đƣợc dùng
làm da nhân tạo, mặt nạ dƣỡng da.

10


Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)
Với cuộc sống hiện đại ngày nay thì việc làm đẹp đang là mối quan tâm rất
lớn của chị em phụ nữ. Xu hƣớng làm đẹp an toàn từ các sản phẩm có nguồn gốc
thiên nhiên đặc biệt đƣợc ƣu tiên hơn cả. Từ đó đã có hàng loạt các hãng mỹ
phẩm lớn nghiên cứu và cho ra các dòng sản phẩm dƣỡng da có nguồn gốc tự
nhiên đảm bảo tính an toàn và thân thiện với ngƣời tiêu dùng trong đó có mặt nạ
dƣỡng da Biocellulose mask. Mặt nạ dƣỡng da Biocellulose mask đƣợc sản xuất
dựa trên công nghệ vi sinh, lấy nguồn nguyên liệu chính đó là nƣớc dừa tự nhiên.
Màng sau khi thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý và bổ sung thêm các hoạt chất cần thiết
phục vụ cho nhu cầu dƣỡng da nhƣ: làm trắng, trị mụn, trị nám tàn nhang.
1.5. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Vi khuẩn Gluconacetobacter và màng Biocellulose đã và đang gây đƣợc sự

chú ý của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới, đƣợc xem nhƣ một nguồn
nguyên liệu mới và có tính tiềm năng, đã đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Trong công nghiệp sản xuất giấy, màng Biocellulose đƣợc dùng để sản xuất giấy
điện tử chất lƣợng cao; trong công nghệ môi trƣờng màng Biocellulose đƣợc sử
dụng làm màng phân tách để xử lý nƣớc và biến đổi độ nhớt của nƣớc (Brown,
1989; Jonas và Fonah, 1998). Trong y học, màng Biocellulose đã đƣợc ứng dụng
làm da tạm thời trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mặt nạ dƣỡng da cho
con ngƣời; ngoài ra, màng Biocellulose còn đƣợc ứng dụng trong công nghệ sản
xuất pin, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực
phẩm.
1.5.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam
Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn Gluconacetobacter
và màng Biocellulose ngày càng thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả. Đã có
nhiều nghiên cứu và công bố liên quan đến Gluconacetobacter, sự hình thành
màng Biocellulose và ứng dụng của chúng trong thực tiễn cuộc sống. Tuy nhiên

11


chƣa có nghiên cứu nào đi sâu vào tìm ra một công thức môi trƣờng tối ƣu hoá
cho quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trƣờng dịch
dƣa chuột Cucumis sativus.
1.6. Dƣa chuột Cucumis sativus
1.6.1. Thành phần dinh dưỡng
Giá trị dinh dƣỡng trong 100g dƣa chuột: protein 0,6g; lipid 0,1g; năng lƣợng
10kcal; 95g nƣớc; đƣờng 1,2g; 0,8g protide; 3g glucid; 0,7g xenlulose; tƣơng
đƣơng với nhiều loại rau tƣơi khác nhƣ cải sen, cải cúc, cải xoong, cải thìa.
Ngoài ra trong dƣa chuột còn có nhiều loại vitamin và muối khoáng cần thiết cho
cơ thể nhƣ caroten 0,3 mg trong 100g, vitamin B1 0,03 mg, vitamin B2 0,04mg,
vitamin PP 0,1 mg, canxi 23 mg, photpho 27 mg, sắt 1 mg, kali (150mg/100g),

photpho (23mg/100g), canxi (19mg/100g), natri (13mg/100g), sắt (1mg/100g),
vitamin B, C, tiền vitamin A (có trong vỏ dƣa), vitamin E (có trong vỏ dƣa). Là
một trong những loại rau rất ít calo, 100g dƣa chuột chỉ cung cấp 10 calo. Dƣa
chuột không chứa chất béo no hoặc cholesterol. Vỏ dƣa chuột là nguồn chất xơ
tốt giúp giảm béo, giảm táo bón và có tác dụng bảo vệ chống ung thƣ đại tràng
nhờ loại bỏ những hợp chất độc trong ruột.
Nƣớc chiếm đến 90% thành phần trong một trái dƣa chuột. Bên cạnh đó, các
vitamin và khoáng chất trong dƣa chuột cũng mang lại những lợi ích sức khỏe
mà không phải bất cứ loại củ quả hay trái cây nào cũng có.
1.6.2. Ứng dụng
Dƣa chuột có thể chế biến ra rất nhiều món ăn hấp dẫn khác nhau nhƣ: dƣa
chuột muối, kim chi dƣa chuột, dƣa chuột chua ngọt, nộm dƣa chuột, thịt xào
dƣa chuột, canh dƣa chuột, salad. Do đó, thƣờng xuyên ăn dƣa chuột có thể giảm
béo. Trong quả dƣa chuột tƣơi còn chứa một số loại men (enzyme) hoạt tính sinh
lý cao, có tác dụng xúc tiến quá trình trao đổi chất. Ngoài ra nƣớc ép dƣa chuột
có tác dụng da ẩm nhuận, làm cho các nếp nhăn nhỏ giãn rộng ra và làm các vết

12


đen trên mặt mờ dần, nên dƣa chuột còn đƣợc sử dụng để chế ra một số mỹ
phẩm.
Trong dƣa chuột cũng có vitamin E. Vitamin này chính là chất chống oxy
hóa, dù không mạnh bằng curcumin trong nghệ thì nó cũng có tác dụng tốt trong
việc loại bỏ gốc tự do (nguyên nhân gây ra lão hóa). Bốn chất chống oxy hóa rõ
nhất là beta-caroten, vitamin E, C và selen đƣợc chứng minh chắc chắn có tác
dụng khử gốc tự do bằng thực nghiệm trên ngƣời. Trong dƣa chuột ngoài
vitamin E còn có β-caroten, một chất chống oxy hóa mạnh. Nhƣ vậy dƣa chuột là
một loại rau củ rất tốt để làm đẹp. Làm mặt nạ dƣa chuột, chăm sóc da mặt bằng
mặt nạ dƣa chuột có 5 loại: dƣa chuột với mật ong, dƣa chuột với sữa chua, dƣa

chuột với sữa tƣơi, dƣa chuột với chanh và dƣa chuột – lòng trắng trứng.

13


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và hóa chất
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose phân lập từ môi
trƣờng dịch dƣa chuột.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc khoa Sinh – KTNN, trƣờng
Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.
* Hóa chất
- Nguồn cacbon: Glucose, fluctose, maltose, acid lactic...
- Nguồn nitơ: Nấm men, pepton, (NH4)2SO4, dd NH3..
- Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4...
- Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol...
- H2SO4, CaCO3, Agar.
* Thiết bị nghiên cứu
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)
- Nồi hấp Tommy (Nhật)
- Box vô trùng (Haraeus)
- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)
- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)
- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl - 10ml
- Cân (Precisa XT 320M - Thụy Sĩ)

14

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)
- Tủ lạnh Daewoo tủ lạnh sau, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác,
que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Phạm vi nghiên cứu: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và độ pH đến khả năng tạo
màng Biocellulose của chủng vi sinh vật đã phân lập, ứng dụng làm mặt nạ
dƣỡng da.
Các loại môi trường
1. Môi trường giữ giống (MT1)
Glucose:

20 g

Pepton:

5g

(NH4)2SO4 : 3 g
Agar:

MgSO4.7H2O: 2 g

KH2PO4:

20 g
2g

Nƣớc cất : 1000 ml
2. Môi trường nhân giống (MT2)

Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic : 2 %

Nƣớc dừa: 1000 ml
3. Môi trường lên men (MT3)
Glucose: 20 g

(NH4)2SO4: 3 g

KH2PO4: 2 g

MgSO4.7H2O: 2 g

pH: 5,0 - 6,0

Acid acetic : 2%

Dịch dƣa chuột: 1000 ml

15

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp vi sinh
2.3.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng Gluconacetobacter theo phương pháp truyền
thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)
Nguồn nguyên liệu: từ dịch dƣa chuột Cucumis sativus cho lên men tự nhiên
từ 8 đến 10 ngày tạo thành một lớp màng trắng, mỏng trên bề mặt dịch nuôi cấy.
Từ các màng thu đƣợc, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng vớt màng, lấy một lƣợng
nhỏ màng, rửa qua bằng nƣớc cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa nƣớc cất
thanh trùng, vontex đều, thu đƣợc ống nghiệm chứa mẫu màng gốc.
Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông, đã đƣợc sấy vô trùng, cho vào mỗi
ống nghiệm 9 ml nƣớc cất, đậy nút bông, hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở
1210C, 1atm trong thời gian 15 phút. Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet
vô trùng hút 1 ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm
thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu đƣợc ống nghiệm chứa dịch pha
loãng mức 10-1. Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống
nghiệm thứ hai, thu đƣợc dịch pha loãng ở mức 10 -2. Tiếp tục pha loãng ở các độ
pha loãng 10-3 , 10-4 → 10-7 . Căn cứ vào số lƣợng vi khuẩn có ở trong mẫu,
chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để tiến hành các bƣớc tiếp
theo.
Phƣơng pháp phân lập trên môi trƣờng thạch đĩa: chuẩn bị môi trƣờng 1 đã
hấp khử trùng, đổ môi trƣờng thạch đĩa. Dùng piped vô trùng hút 0,1ml dịch
màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10 -4 - 10-7) nhỏ vào các hộp lồng
đã chứa môi trƣờng thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên khắp bề mặt
thạch. Đặt ngƣợc các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm 30 0C, sau 3 – 4
ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thƣớc, màu sắc, độ trơn bóng,
viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3.
Chuẩn bị môi trƣờng thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), tách các khuẩn
lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trƣờng thạch
16