Tóm tắt Luận án tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ

1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

HOÀNG VĂN TRUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ
HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ
LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN – 2019


2

Công trin
̀ h đươ ̣c hoàn thành ta ̣i:
Phòng thí nghiê ̣m Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa ho ̣c,
Trường Đa ̣i ho ̣c Vinh

Người hướng dẫn khoa ho ̣c:
1. GS. TS. Trầ n Đin
̀ h Thắ ng
2. PGS. TS. Đinh Thị Trường Giang
Phản biêṇ 1: PGS.TS. Đặng Ngọc Quang

Phản biêṇ 2: PGS.TS. Đỗ Quang Huy
Phản biêṇ 3: PGS.TS. Hoàng Văn Lựu

Luâ ̣n án đươ ̣c bảo vê ̣ ta ̣i Hô ̣i đồ ng đánh giá luâ ̣n án cấ p Trường ho ̣p ta ̣i: Phòng
bảo vệ, tầng 6, Nhà Công nghệ cao Trường Đại học Vinh
vào hồ i

giờ

phút, ngày tháng

năm 2019

Có thể tìm hiể u luâ ̣n án ta ̣i thư viê ̣n:
1. Thư viê ̣n Quố c gia Viê ̣t Nam
2. Trung tâm Thông tin & Thư viê ̣n Nguyễn Thúc Hào – Trường Đa ̣i ho ̣c
Vinh


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Nấm là sinh vật không thể thiếu trong đời sống, không có nấm, chu trình tuần
hoàn vật chất sẽ bị mất một mắt xích quan trọng trong việc phân hủy chất bã hữu
cơ. Nấm là nguồn thực phẩm giàu protein, đầy đủ các acid amin thiết yếu, hàm
lượng chất béo ít và đó là những axit béo chưa bão hòa, giá trị năng lượng cao,
giàu khoáng chất và các vitamin có tác dụng tốt cho sức khỏe con người. Ngoài
ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần tăng cường hệ
miễn dịch, tăng cường sức khỏe, hỗ trợ phòng và điều trị bệnh cho con người.

Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học của một số loài nấm và phát hiện nhiều hợp chất có hoạt tính
sinh học cao như tăng cường hệ miễn dịch, điều trị viêm gan, ung thư, HIV…
Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao
trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt
đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng
của khu hệ nấm Việt Nam. Đến năm 2015, có hơn 2500 loài nấm đã được ghi
nhận, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn.
Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên, có hơn 50 loài là nấm
ăn như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm
mối, nấm thông (Boletus edulis), nấm chàm (Boletus aff. felleus), nấm bào ngư
(Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius), nấm ngọc châm
(Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) ... Có khoảng
hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý
như: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum),
nấm vân chi (Tramethers versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune),
nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), đông trùng
hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris). Những nghiên cứu bước đầu về
các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng
rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharide,
polysaccharide-peptide, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như:
flavonoid, steroid, terpenoid… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn
dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như: ung thư, tim mạch… Khoảng 50
loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng
trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.
Nghệ An là tỉnh có nhiều vườn quốc gia như: vườn Quốc gia Pù Mát, khu
bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt. Đây là những
vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng
nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể
sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược

phẩm…


2

Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa
nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học. Do vậy, việc nghiên cứu
về nấm là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan
trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm
quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên. Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số
loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ”.
2. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết các loài nấm: Ganoderma
applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum
(Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05),
Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và
Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc Trung Bộ của Việt Nam.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp
chất từ các loài dịch chiết của loài nấm Ganoderma applanatum (Mush 01),
Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma
lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum
(Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08).
- Xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi
lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E.
- Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide.
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ hai quả thể nấm
Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02).
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.

4. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 40 0C.
Việc xử lý các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp
để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực
nghiệm.
- Phân tích thành phần dinh dưỡng: đã sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) với các detector khác nhau và phương pháp phổ khố i
lươ ̣ng plasma cảm ứng (ICP – MS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử
với kỹ thuật nguyên tử hóa hỉđrua (HG - AAS), phương pháp quang phổ hấp thụ
nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F - AAS).
- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng
các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột
nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha thường.
- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất
phân lập, được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại


3

(UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối
lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ
cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ
thuật khác nhau như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC
đã được sử dụng.
- Phương pháp thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và
kháng viêm.
5. Những đóng góp mới của luận án
- Lần đầu tiên ở Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thành phần dinh dưỡng
của 08 loài nấm lớn: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica

(Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04),
Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06),
Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc
Trung Bộ.
- Lần đầu tiên xác định được hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide
trong 08 loài nấm trên
- Từ dịch chiết quả thể nấm Daldinia concentrica thu được 09 hợp chất.
Trong đó, hợp chất DCM1 là [11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E,
16S*,18S*,19R*) là hợp chất mới (daldinin). Ngoài ra 8 hợp chất đã biết là [11]cytochalasa-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18,19-trihydroxy-16,18-dimethyl-10phenyl-(7S*,13E,16S*,18S*, 19R*) (DCM2), [11]-cytochalasa-6 (12),13-diene1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl-(7S*,13E,16S*,18R*)
(DCM3), 8-methyleugenitol (DCM4); eugenitol (DCM5); uracil (DCM6), và Dmannitol (DCM7); ergosterol (DCM8), ergosterol peroxide (DCM9).
- Từ dịch chiết quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum thu được 05
hợp chất bao gồm: Ergosterol (GAM1), 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien3β-ol (GAM2), ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26diol (GAM4), 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5).Trong
đó các hợp chất GAM3, GAM4, GAM5 lần đầu tiên phân lập từ loài nấm này.
- Lần đầu tiên tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với các dòng
tế bào ung thư khác nhau của 5 hợp chất (DCM1, DCM2, DCM3, DCM4,
DCM5). Các hợp chất DCM2 và DCM3 cho thấy độc tính tế bào yếu đối với tất
cả các dòng tế bào khối u được thử nghiệm với các giá trị IC50 nằm trong khoảng
23,0 ± 1,1 và 58,2 ± 2,3 M. Các hợp chất DCM4 và DCM5 cho thấy độc tính tế
bào yếu đối với các tế bào HepG2 và Hep3B với các giá trị IC50 nằm trong
khoảng 21,5 ± 5,1 và 46,9 ± 3,7 μM và chúng không có hoạt tính đáng kể đối với
nồng độ thử nghiệm cao nhất đối với SK-LU-1 và dòng tế bào SW480.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm 120 trang với 23 bảng số liệu, 62 hình và 5 sơ đồ với 130
tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25


4

trang), phương pháp và thực nghiệm (21 trang), kết quả và thảo luận (55 trang),
kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (12

trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 76 phổ của một số hợp chất chọn lọc.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Luận án đã tiến hành tổ ng quan tài liệu các nội dung:
1. Thành phần dinh dưỡng của nấm
- Giới thiệu về hàm lượng chất khô; Protein và acid amin; carbohydrate, Lipid;
Vitamin và Khoáng chất trong nấm.
2. Chi Daldinia
- Giới thiệu đặc điểm chung về hình thái chi Daldinia
- Thành phần hóa học chi Daldinia
3. Nấm than (Daldinia concentrica)
4. Chi linh chi (Ganoderma)
- Giới thiệu về đặc điềm hình thái
- Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
5. Nấm cổ linh chi (
Ganoderma applanatum)
- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Ganoderma applanatum.
- Thành phần hóa học của Ganoderma applanatum.
- Hoạt tính sinh học của Ganoderma applanatum.
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phương pháp lấy mẫu:
Các mẫu nấm bao gồm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia
concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum
(Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush
06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) được thu
hái ở vườn quốc gia Pù Huống, Pù Mát- Nghệ An, Việt Nam vào tháng 08 năm
2015. Mẫu được định danh bởi PGS.TS. Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học
khoa học Huế. Tiêu bản (Vinh-TSWu-20150815) được lưu giữ tại Viện Công
nghệ Hóa, Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh.
2.1.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập

được:
Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC).
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất:
Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), (HRESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-


5

NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương
của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR.
2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học
Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên được thực
hiện theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane.
2.2. Hóa chất và thiết bị
2.2.1. Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết
(pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh
khiết phân tích (PA).
2.2.2. Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS);
phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng
2.3. Nghiên cứu thành phần các chất dinh dưỡng có trong các loài nấm lớn
vùng Bắc Trung Bộ.
2.3.1. Xác định thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng.
2.3.1.1. Xử lý mẫu phân tích.
Các mẫu xác định hàm lượng khoáng, nguyên tố vi lượng được tiến hành theo
quy trình AOAC.
2.3.1.2. Điều kiện đo để định lượng khoáng và các nguyên tố vi lượng
Chúng tôi lựa chọn các điều kiện và thông số máy đo ICP-MS Agilent 7500
để xác định Ge. Selen được xác định bằng phương pháp AAS sử dụng kỹ thuật

nguyên tử hóa bằng hơi hiđrua (HG-AAS). Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn được xác
định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử
hóa bằng ngọn lửa (F-AAS)
2.3.2. Xác định hàm lượng acid amin
2.3.2.1. Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích acid amin
Mẫu nấm xay nhỏ và được bảo quản trong điều kiện thích hợp. Quy trình xử
lý mẫu và phân tích theo Agilent.
2.3.2.2. Tiến hành phân tích trên máy HPLC
− Cột sắc ký: cột C18 150  4,6mm, kích thước hạt 5μm.
− Nhiệt độ cột: 400C.
− Tốc độ dòng: 0,45ml/phút.
− Pha động:
Pha động A: Cân 1,36  0,025 g NaCH3COO.3H2O + 500 ml H2O + 90µl
triethylamine (TEA). Điều chỉnh pH về pH = 7,2  0,05 bằng acid acetic 2%.
Thêm 1,5 ml tetrahydrofuran (THF).
Pha động B: Cân 1,36  0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O. Điều
chỉnh pH về pH = 7,2  0,05 bằng acid acetic 2%. Thêm hỗn hợp gồm 200 ml
acetonitrin và 200 ml methanol.
Detector: huỳnh quang (FLD) từ bước sóng λEx= 340, λEm= 455 nm
2.3.3. Xác định hàm lượng các vitamin A và E


6

2.3.3.1. Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích vitamin A và vitamin E
Quy trình xử lý mẫu xác định vitamin A và vitamin E được thực hiện theo
AOAC.
2.3.3.2. Tiến hành phân tích vitamin A trên máy HPLC
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.

- Pha động: 100% ACN
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Detector: UV bước sóng λ =325 nm.
2.3.3.3. Tiến hành phân tích vitamin E trên máy HPLC
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Pha động: 1,4 dioxan: n-hexan 1,2 : 98,8
- Nhiệt độ cột: 300C
- Detector: Đo huỳnh quang (FLD) bước sóng λEx= 292nm, λEm= 330 nm
2.4. Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide
2.4.1. Chất chuẩn
Các chất chuẩn ergosterol và ergosterol peroxide được phân lập từ loài
Ganoderma lucidum. Cấu trúc của các chất này được xác định bằng các phổ 1H-,
13
C-NMR, HSQC, HMBC, MS, UV và IR.
2.4.2. Chiết các sterol
Phương pháp thử nghiệm được thực hiện theo quy trình được mô tả bởi
Villares et al. với một số thay đổi nhỏ. Bột nấm khô (~ 2 g; độ ẩm 24%) được
chiết với 20 mL hỗn hợp MeOH / MeCN (85:15, v / v) bằng cách khuấy trong bể
siêu âm ở 4°C trong 30 phút. Sau đó, hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 3500 vòng /
phút trong 10 phút. Phần còn lại được chiết hai lần, và các chất chiết được gộp
lại. Các mẫu được lưu trữ (4°C trong bóng tối) cho đến khi phân tích HPLC.
Trước khi phân tích HPLC, các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 μm.
2.4.3. Phân tích bằng sắc ký (HPLC)
2.4.3.1. Tiến hành phân tích ergosterol
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18
- Dung dịch pha động MeOH : ACN (85 : 15 v/v )
- Nhiệt độ cột : 300C
- Detector: UV bước sóng λ = 290 nm
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/phút

2.4.3.2. Tiến hành phân tích ergosterol peroxide
- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18
- Pha động: Me0H 100%
- Nhiệt độ cột: 35cC
- Detector: UV bước sóng λ = 290 nm
- Tốc độ dòng: 1ml/ phút


7

2.5. Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D. concentrica)
2.5.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Quả thể nấm than (D. concentrica) (8,6 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm
chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch
chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao
methanol (180g). Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố với
dung môi ethylacetate, chưng cất chân không thu được hai phần: cao ethylacetate
(105g) và dịch chiết nước.
Cao ethylacetate được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexaneacetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 7:1; 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0;
6:1; 3:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ đồ 2.1).
Phân đoạn F1 (8,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5
cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1), mỗi
hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7).
Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã được sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) với
hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1, mỗi hệ dung
môi sử dụng 250 ml) thu được hợp chất DCM7 (153 mg). Phân đoạn F1.6 (0,3g)
được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1;
15:1; 10:1; 4:1) thu được hợp chất DCM3 (5mg). Phân đoạn F1.7 (0,5 g) được
tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 (100 gam, 60x3cm) với hệ dung môi giải hấp
CH3OH:H2O thu được DCM1 (134 mg).

Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ
dung môi rủa giải hexane:acetone (9:1 ; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml)
thu được sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6). Phân đoạn F2.6 (0,5 g)
được tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) được giải hấp với
hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM6 (41 mg).
Phân đoạn F3 (2,7 g) được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) được
rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (9:1; 6:1; 4:1; 1:1, mỗi hệ dung sử
dụng 250ml) để thu được bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4). Phân
đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x 3 cm)
giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM2 (31 mg).
Phân đoạn F4 (4,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60
x 5cm) được rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1,
mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5). Phân
đoạn F4.1 tiếp tục được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng
hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1; 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu
được hợp chất DCM4 (10 mg) và hợp chất DCM8 (21 mg).
Phân đoạn F5 (1,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60
x 3cm) được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ dung
môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM9 (43 mg).


8

Phân đoạn F6 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm)
rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu
được hợp chất DCM6 (13 mg).

Sơ đồ 2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (D. concentrica)
2.5.2. Các dữ liệu vật lý
2.5.2.1. Hợp chất DCM1

Tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c.216-217 °C; HR-ESI-MS m/z 546.2834
[M+Na]+ (C31H41O6NNa, cal. m/z 546.2832); 1H-NMR (700MHz, Pyridine-d5)
Bảng 3.14
2.5.2.2. Hợp chất DCM 2
Tinh thể không màu, (CHCl3), đ.n.c.216-217°C; HR-ESI-MS m/z 467.2669
+
[M] (C28H37O5N, cal. m/z 467.2672); bảng 3.15.
2.5.2.3. Hợp chất DCM 3
Tinh thể không màu,(CHCl3), đ.n.c.120-121°C; HR-ESI-MS m/z 451.2717
+
[M] (C28H37O4N, cal.m/z 451.2712);
2.5.2.4. Hợp chất DCM4
Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.182-184oC; EI-MS m/z (%): 220 (M+,
C12H12O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,20 (1H, s, H-3), 2,40 (3H, s, 2-


9

CH3), 2,22 (3H, s, 6-CH3), 2,13 (3H, s, 8-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3)
(ppm). Bảng 3.16.
2.5.2.5. Hợp chất DCM5
Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.227-229oC; EI-MS m/z (%): 206 (M+,
C11H10O4); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) (ppm): 6,38 (1H, s, H-8), 6,00 (1H, s,
H-3), 2,34 (3H, s, 2-CH3), 2,09 (3H, s, 6-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3)
(ppm).
2.5.2.6. Hợp chất DCM6
Chất bột màu nâu nhạt, đ.n.c. 310-3110C ;
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 10,98 (1H, br s), 10,81 (1H, br s),
7,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5).

2.5.2.7. Hợp chất DCM7
Chất bột không màu, đ.n.c. 166-1680C;
1
H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 4,40 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2,5-OH),
4,31 (2H, t, J = 5,5 Hz, 1,6-OH), 4,12 (2H, d, J = 7,0 Hz, 3,5-OH), 3,61 (2H, m,
H-1b, -6b), 3,53 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-3,-4), 3,45 (1H, m, H-2,-5), 3,37 (2H, dd, J
= 6,0, 11,5 Hz, H-1a, -6a);
2.5.2.8. Hợp chất Ergosterol DCM8
Chất bột màu trắng; đ.n.c: 165-1670C; Phổ UV (MeOH) max nm: 211, 285;
IR (KBr) max (cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; EI-MS m/z 396 [M]+; Phổ 1H-NMR
(500MHz, CDCl3) ( ppm); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): bảng 3.17
2.5.2.9. Hợp chất Ergosterol peroxide DCM9
Bột màu trắng (CHCl3); đ.n.c: 172-174°C ; [α]D25 -14.4 (c = 0.08, CHCl3);
EI-MS (rel. int.): m/z 396 ([M]+, 100); IR (KBr) νmax: 3417, 2954, 1458 cm-1; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm); bảng 3.18
2.6. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum)
2.6.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất
Quả thể nấm linh chi (G. applanatum) (3,0 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ,
ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10Lx3) ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc
và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao
methanol (128,0g). Sau đó cao thô được hòa tan trong nước và chiết phân bố với
dung môi, chưng cất chân không thu được: ethyl acetate (32g), butanol (33g) và
dịch chiết nước (55g).
Cao chiết ethyl acetate được tiến hành trên sắc ký cột silica gel rửa giải
gradient với hệ dung môi hexane và acetone tăng dần độ phân cực (từ 100:0 đến
2:1) thu được các phân đoạn nhỏ, sử dụng TLC gộp được 10 phân đoạn (Frs. G1G10). Tinh chế phân đoạn G1 (1.2g) bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hexane
và acetone (15:1) thu được hợp chất 1 (123 mg). Phân đoạn G3 (2.6g) cũng được
tiến hành trên silica gel với hệ dung môi hexane và ethyl acetate (15:1) thu được
chất 4 (38 mg). Phân đoạn G4 (2,5g) đã được sắc ký cột silica gel rửa giải với hỗn
hợp hexane và acetone (9: 1) thu được hợp chất 2 (10 mg) và 3 (31 mg). G6
(2,9g) đã được sắc ký cột silica gel giải hấp với cloroform và hỗn hợp dung môi

methanol (10: 1) và tiếp tục kết tinh lại để thu được hợp chất 5 (30 mg).


10

Sơ đồ 2.2. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (G. applanatum)
2.6.2. Các dữ kiện vật lý và phổ
2.6.2.1. Ergosterol (GAM1)
Hợp chất GAM1 có cấu trúc giống với hợp chất DCM8 số liệu phổ và biện
luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.8 đã chứng minh được đây là ergosterol.
2.6.2.2 Ergosterol peroxide (GAM2)
Hợp chất GAM2 có cấu trúc giống với hợp chất DCM9 số liệu phổ và biện
luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.9 đã chứng minh được đây là ergosterol
peroxide .
2.6.2.3 Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3)
Tinh thể không màu; (CHCl3); [α]D20 -5 (c = 0.85, CHCl3); đ.n.c.185.5-187°C
; EI-MS (rel. int.): m/z 398([M]+, 4), 217(8), 255(9), 107(15), 69(24), 43(100); IR
(KBr) νmax: 3341, 2951, 2928, 2870, 1663, 1458, 1377, 1044, 970 cm -1 ; 1H-NMR
(CDCl3, 500 MHz) (δ ppm), 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (δ ppm)
2.6.2.4. Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol (GAM4)
Tinh thể không màu; đ.n.c. 171-1720C. EI-MS m/z 440 [M]+; EI-MS m/z 412
[M-H2O]+ (13), 397(6), 394(19), 383(10), 379(21), 376(15), 269(15), 251(57),
69(100); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm),13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (δ
ppm). bảng 3.22
2.6.2.5. Acid 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic (GAM5)
Tinh thể hình kim; đ.n.c 243-244oC;
ESI-MS m/z 453 [M-H]- ; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) (δ ppm): 13C-NMR
(125 MHz, CDCl3) (δ ppm). Bảng 3.23.
2.7. Phương pháp thử hoạt tính
Thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào với SW480: Ung thư đại tràng ở người

(human colon adenocarcinoma), SK-LU-1: ung thư phổi ở người (human lung
carcinoma); Hep3B: ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular


11

carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular
carcinoma); MCF7: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma).
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng của một số loài nấm
3.1.1. Thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng
3.1.1.1. Xây dựng đường chuẩn
Để định lượng các thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng, chúng tôi
đã sử dụng phương pháp ICP – MS để đo Ge, phương pháp AAS-HG để đo Se,
phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng
ngọn lửa (F-AAS) để đo Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn. Các thông số của máy ICP –
MS, AAS thể hiện trong bảng 2.2 và 2.3.
Các phương trình đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa tín hiệu
đo với nồng độ các ion kim loại đã được xây dựng. Kết quả thể hiện trong bảng
3.1.
Bảng 3.1. Phương trình đường chuẩn
Chất chuẩn
Ge (ppb)
Na (ppm)
K (ppm)
Ca (ppm)
Mg (ppm)
Se (ppb)
Fe (ppm)
Cu (ppm)

Zn (ppm)

Phương trình hồi quy
Y = 3,685.103X + 1,719.103
Y = 1,15002X + 0,1600
Y = 0,60203X + 0,0085
Y = 0,5192X + 0,0129
Y = 0,22055X + 0,00048
Y = 0,0085X - 0,0018
Y = 0,0669X + 0,0086
Y = 0,1079X + 0,0031
Y = 0,4624X + 0,0005

R2
1,00
0,99943
1,00
0,9998
0,9998
0,9996
0,9978
0,9999
0,9996

3.1.1.2. Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong các mẫu nấm lớn
Sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu như mục 2.3.1.1, các điều kiện ghi đo thể
hiện trong bảng 2.2, bảng 2.3 và đường chuẩn xây dựng được trong mục 3.1.1.1,
chúng tôi tiến hành định lượng các nguyên tố nghiên cứu trong 08 mẫu nấm lớn.
Kết quả phân tích và tính toán được thể hiện trong bảng 3.2, bảng 3.3
Bảng 3.2. Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong 08 mẫu nấm

ST
T

Mẫu nấm
(kí hiệu)

1
2
3
4
5
6
7
8

Mush 01
Mush 02
Mush 03
Mush 04
Mush 05
Mush 06
Mush 07
Mush 08

Hàm
lượng Ge
(µg/g)
ICP-MS
0,020
0,031

0,070
0,077
0,074
0,048
0,029
0,035

Hàm lượng Na, K, Ca, Mg (µg/g) theo
phương pháp AAS
Na

K

Ca

Mg

36,892
41,225
32,644
29,156
39,726
21,721
16,894
45,265

1324,173
162,142
2932,645
1452,548

101,879
18,371
572,571
128,783

354,284
317,375
436,423
400,111
2226,421
341,513
1246,247
634,675

382,762
128,559
352,374
260,836
790,324
386,358
347,515
1372,692


12

Bảng 3.3. Kết quả xác định Se, Fe, Cu, Zn trong trong 08 mẫu nấm lớn
ST
T
1

2
3
4
5
6
7
8

Mẫu nấm
(kí hiệu)
Mush 01
Mush 02
Mush 03
Mush 04
Mush 05
Mush 06
Mush 07
Mush 08

Hàm lượng Se, Fe, Cu, Zn (µg/g) theo
phương pháp AAS
Se
0,885
1,014
0,187
3,982
0,348
1,025
0,716
0,883

Fe
12,916
79,173
106,847
18,341
148,447
14,423
249,962
84,576

Cu
18,221
69,657
24,502
28,516
2,983
4,604
16,102
23,254

Zn
18,702
49,126
46,246
61,237
17,701
20,863
45,572
37,016

3.1.2. Hàm lượng các acid amin trong các mẫu nấm
3.1.2.1. Xây dựng đường chuẩn
Để tiến hành xây dựng đường chuẩn chúng tôi chuẩn bị một dãy dung dịch
chuẩn của acid amin nồng độ: 10pmol, 25pmol, 100pmol. Kết quả đo trên máy sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như bảng 3.4.
Bảng 3.4. Phương trình đường chuẩn xác định acic amin
TT

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

Phương trình đường
chuẩn
( Y = aX +b)

Aspatic
Y = 50,892x + 268,560
Glutamic
Y = 0,760x + 5,416
Serin
Y = 0,869x – 0,972
Histidin
Y = 0,575x + 0,115
Glycin
Y = 0,872x - 5,387
Threonin
Y = 0,845x – 1,787
Alanin
Y = 0,884x – 0,590
Arginin
Y = 0,882x + 4,068
Tyrosin
Y = 0,825x + 2,598
Cys-ss-cys Y = 1,036x – 3,803
Valin
Y = 0,946x – 5,502
Methionin Y = 0,947x – 5,071
Phenillalanin Y = 0,844x – 1,449
Isoleucin
Y = 0,913x – 3,033
Leucin
Y = 0,911x – 0,4
Lysin
Y = 1,614x – 7,681
Prolin

Y = 0,547x – 0,774
Axit amin

Hệ số tương
quan (R2)
0,9991
0,9990
1
1
0,9992
1
1
1
0,9997
0,9990
1
1
1
1
1
1
0.9995

3.1.2.2. Kết quả hàm lượng các acid amin thủy phân trong các mẫu nấm
Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu cho quá trình xử lý mẫu phân tích acid
amin trong mẫu nấm. Đánh giá thống kê quy trình phân tích acid amin đều đạt
trong giới hạn cho phép, chúng tôi tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm 8
mẫu nấm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02),

13

Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma
philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius
(Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08).
Mẫu nghiên cứu gồm 08 loại nấm được xử lý theo mục 2.3.2.1. Quy trình
phân tích thể hiện ở mục 2.3.2.2. Kết quả phân tích cụ thể hàm lượng các acid
amin trong 1,00g mẫu nấm được chỉ ra ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hàm lượng acid amin thủy phân trong nấm nghiên cứu (μg/g)
Mẫu nấm (ký hiệu)
Mush 01 Mush 02 Mush 03 Mush 04 Mush 05 Mush 06 Mush 07
1 Threonin 123,53 50,34
40,47 110,32 323,15 34,64
51,11
2
Valin
KPH
54,83
42,47 139,15 249,20 24,18
55,30
3 Methionin 119,84 13,37
8,74
64,41
110,9
KPH
12,75
4 Isoleucin 103,84 KPH
24,43
3,41
381,90 KPH

KPH
5
Leucin
253,34 74,47
47,00 187,35 320,65 40,17
74,98
Phenyllal
6
272,43 96,66
6,39
346,02
KPH
43,50
98,65
anin
7
Lysin
324,95 57,00
64,18 253,32 276,10 22,30
70,21
8
Histidin
KPH
19,98 235,13 35,00
4,35
KPH
19,28
Tổng axit
amin thiết yếu 1197,93 468,81 366,65 1138,98 1666,25 164,79 382,28
(EAA)

9
Aspatic 276,29 112,09 69,14 274,20
KPH
46,99 119,15
10 Glutamic 398,70 209,81 96,26 533,97 766,75 56,30 213,08
11
Serin
114,63 55,99
54,52 113,49 203,90 27,88
58,54
12
Glycin
213,56 63,03
KPH 181,36 27,30
57,47
80,23
Cys – ss –
13
296,19 75,88
96,17 271,74 276,20 72,64
88,48
Cys
14
Alanin
226,89 116,26 64,54 226,73 290,80 118,08 65,22
15
Arginin 190,09 86,078 69,55 212,58 368,50 26,65
98,89
16
Tyrosin 116,61 27,69

24,56
87,81 115,75
8,43
25,35
17
Prolin
146,42 134,10 513,78 135,20 378,60 88,28 117,79
Tổng acid amin
không thiết 1979,38 988,52 881,26 2037,08 2427,8 502,72 866,73
yếu(NEAA)
Tổng (TAA) 3177,31 1457,33 1247,91 3176,06 4094,05 667,51 1249,01
%(EAA/TAA) 37,70% 32,17% 29,38% 35,86% 40,70% 24,69% 30,61%
TT Acid amin

Mush 08
156,98
200,35
156,95
39,19
315,36
630,49
602,31
51,20
2152,83
298,33
450,94
126,18
235,11
637,38
248,67

271,10
222,21
163,55
2653,47
4806,30
44,79%

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, trong 08 loại nấm thì nấm Mush 08 có tổng
hàm lượng các acid amin cao nhất (4806,30 μg/g), sau đó là nấm Mush 05
(4094,05 μg/g) thấp nhất là Mush 06 (667,51 μg/g).
Hiệu suất thu hồi phản ánh độ đúng của các kết quả định lượng. Hiệu suất
thu hồi được xác định bằng thực nghiệm, khi sử dụng mẫu thêm chuẩn, tiến hành
phân tích như mẫu thật.


14

Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi của acid amin trong nấm cổ linh chi (G. applanatum)
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

12
13
14
15
16
17

Acid amin
Asp
Glu
Ser
His
Gly
Thr
Ala
Arg
Tyr
Cys – ss – Cys
Val
Met
Phe
Ile
Leu
Lys
Pro

Cso+mẫu (ppm)
KPH
16,593
5,048

1,435
1,224
7,648
6,699
9,157
4,011
6,661
6,137
3,513
1,560
8,890
7,689
6,934
8,659

Cmẫu (ppm)
KPH
15,335
4,078
0,087
0,546
6,463
5,816
7,370
2,315
5,524
4,984
2,218
KPH
7,638

6,413
5,522
7,572

Cso (ppm)
1,33
1,47
1,05
1,55
0,75
1,19
0,89
1,74
1,81
1,21
1,17
1,49
1,65
1,31
1,31
1,46
1,15

H (%)
85,60
92,38
86,97
90,40
99,58
99,21

102,70
93,74
93,97
98,55
86,92
94,55
95,57
97,40
96,71
94,52

3.1.3. Hàm lượng các vitamin trong các mẫu nấm
3.1.3.1 Vitamin A
3.1.3.1.1. Xây dựng đường chuẩn vitamin A
Dãy dung dịch chuẩn vitamin A được khảo sát có nồng độ: 1ppm; 5ppm; 10
ppm; 100ppm. Phân tích các chuẩn nói trên và xác định phương trình đường
chuẩn dựa vào diện tích các peak bảng 3.7.
Bảng 3.7. Diện tích peak của vitamin A tương ứng với từng nồng độ chuẩn
Nồng độ
chuẩn
(ppm), x
1
5
10
100

Diện tích peak
Lần 1

Lần 2

Lần 3

192,126
976,267
2053,859
15180,6

192,119
976,204
2053,883
15180,44

192,497
976,296
2053,794
15180,76

m

b

R2

150,202 195,87 0,9994

3.1.3.1.2. Kết quả phân tích
Chúng tôi tiến hành xử lý 08 mẫu nấm, đồng thời để đánh giá độ đúng của
kết quả chúng tôi khảo sát 01 mẫu thêm chuẩn 10 ppm theo sơ đồ 2.2 và định
lượng theo điều kiện chạy máy HPLC tại mục 2.3.2.2. Kết quả hàm lượng

vitamin A trong các mẫu nấm được trình bày trong bảng 3.8.


15

Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong nấm
TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Mẫu (ký
hiệu)
Mush 01
Mush 02
Mush 03
Mush 04
Mush 05
Mush 06
Mush 07
Mush 08

Thể tích mẫu
(ml)
3,0

3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0

C(μg/g)
1,093
0,361
0,446
0,927
0.541
0,285
0,738
1,208

Kết quả bảng 3.8 cho thấy hàm lượng vitamin A của 08 mẫu nghiên cứu dao
động từ 0,285 – 1,208 μg /g. Hiệu suất thu hồi của phương pháp được thực
hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn là 98,71%. Kết quả hiệu suất thu hồi
cao phản ánh độ đúng cao của các kết quả định lượng vitamin A trong các mẫu
nấm.
3.1.3.2. Vitamin E
3.1.3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của vitamin E
Dãy dung dịch chuẩn vitamin E được khảo sát có nồng độ như sau: 10ppm;
20ppm; 50 ppm. Đo các chuẩn nói trên và xác định phương trình đường chuẩn
dựa vào diện tích các peak bảng 3.9.
Bảng 3.9. Diện tích peak của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn
Nồng

độ
chuẩn
(ppm)
10
20
50

Diện tích peak
Lần 1

Lần 2

Lần 3

120,31485
223,86580
535,42377

120,29823
223,66126
535,19625

120,30126
223,86985
535,42485

m

b

R2

10,61397 7,62161 0,9996

3.1.3.2.2. Kết quả phân tích
Chúng tôi tiến hành xử lý các mẫu nấm theo sơ đồ 2.2 và định lượng theo
điều kiện chạy máy HPLC tại mục 2.3.2.3. Kết quả hàm lượng vitamin E trong
các mẫu nấm được trình bày trong bảng 3.10
1 Bảng 3.10. Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm
TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Mẫu (ký
hiệu)
Mush 01
Mush 02
Mush 03
Mush 04
Mush 05
Mush 06
Mush 07
Mush 08

Thể tích mẫu
(ml)
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0

C(μg/g)
70,565
16,959
14,881
35,544
23.772
45,613
36,704
49,331


16

Kết quả bảng 3.10 cho thấy hàm lượng vitamin E của 08 mẫu nghiên cứu dao
động từ 14,881 – 70,565 μg /g. Hiệu suất thu hồi của phương pháp được thực
hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn là 97,85%. Kết quả hiệu suất thu hồi cao
phản ánh độ đúng cao của các kết quả định lượng vitamin E trong các mẫu nấm.
3.2. Hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn của ergosterol và ergosterol peroxide

Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol được khảo sát có nồng độ như sau: 25ppm;
50ppm; 1000 ppm
Chuẩn bị dãy chuẩn ergosterol peroxide được khảo sát có các nồng độ như
sau: 2.5ppm; 5ppm; 10ppm.
Tiến hành đo trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với điều kiện đo
của ergosterol theo mục 2.4.3.2, và ergosterol peroxide theo mục 2.4.3.1. Kết quả
thu được trong bảng 3.11 và hình 3.20, hình 3.21.
Bảng 3.11. Diện tích peak của ergosterol và ergosterol peroxide ứng với từng
nồng độ chuẩn
Nồng độ
chuẩn
Ergosterol
(ppm)
50
100
1000

Diện tích
peak
127,12099
283,43860
2531,40381

Nồng độ
chuẩn
Ergosterol
(ppm)
2,5
5,0
10,0

Diện tích
peak
23,05513
46,45211
91,85735

3.2.3. Kết quả phân tích
Bảng 3.12. Hàm lượng của ergosterol trong 8 mẫu nấm (μg/kg)
TT
1
2
3
4
5
6
7
8

Mẫu (ký hiệu)
Mush 01
Mush 02
Mush 03
Mush 04
Mush 05
Mush 06
Mush 07
Mush 08

ergosterol

7,01
1,86
7,73
7,11
4,71
5,45
30,61
4,49

ergosterol peroxide
0,03
0,14
0,17
0,04
0,04
0,07
2,37
0,03

Kết quả phân tích trên cho thấy ergosterol và ergosterol peroxide được xác
định có hàm lượng cao trong mẫu (Fomitopsis dochmius) . Hàm lượng của
ergosterol và ergosterol peroxide trong mẫu (Fomitopsis dochmius) có sự khác
biệt đáng kể. Hiệu suất thu hồi được thực hiện với mẫu nấm Mush 01 thêm chuẩn
là 98,02% đối với ergosterol và 97,52% đối với ergosterol peroxide. Hiệu suất
thu hồi cao đối với phép xác định hàm lượng ergostero và ergosterol peroxide
chứng tỏ các kết quả định lượng 2 chất này trong các mẫu nấm cho thấy phương
pháp có độ tin cậy cao, độ đúng đảm bảo.


17

3.3. Nấm than (D. concentrica)
3.3.1. Kết quả phân lập hợp chất.
Bảng 3.13. Các hợp chất được tách ra từ nấm than (D. concentrica)
Ký hiệu
hợp chất

Tên chất

DCM1

[11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21dione-7,18-dihydroxy-16,18-dimethyl-19methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*)
[11]-cytochalasa-6(12),13-diene-1,21-dione7,18,19-trihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl(7S*,13E,16S*,18S*, 19R*)
[11]-cytochalasa-6 (12),13-diene-1,21-dione-7,18dihydroxy-16,18-dimethyl-10-phenyl(7S*,13E,16S*,18R*)
8-Methyleugenitol
Eugenitol
Uracil
D-mannitol
Ergosterol
Ergosterol peroxide

DCM2
DCM3
DCM4
DCM5
DCM6
DCM7
DCM8
DCM9

Khối
lượng
(mg)
134
31
5
10
13
153
41
21
43

3.3.2. Xác định cấu trúc
3.3.2.1. Hợp chất DCM1
([11]-cytochalasa-18-acetoxy-6(12),13-diene-1,21-dione-7,18-dihydroxy-16,18dimethyl-19-methoxy-10-phenyl-(7S*,13E, 16S*,18S*,19R*)
DCM1 là chất rắn vô định hình, nhiệt độ nóng chảy 217-219°C. Phổ khối
lượng HRMS: m/z 546,2834 [M+Na]+ ứng với công thức phân tử C31H41O6N:
523,2933.
Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton H-2 của amid NH (δH 4,89); tín hiệu
proton của nhóm benzyl H-2’,6’(7,19), H-3’,5’(7,28) và H-4’(7,25); proton của
ancol bậc hai H-7 (δH 4,74). Ngoài ra còn có hai proton exomethylen (δH 5,12,
5,45), hai tín hiệu proton olefin (δH 6,57, 5.12), ba proton methyl (δH 0,94, 0,89,
1,51) (Bảng 3.14).
Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT (Bảng 3.14), cho thấy tín hiệu của của
28 nguyên tử cacbon : ba cacbon cacbonyl C-21(δC 213,2), C-1(175,5), OCO
(177.4) ; sáu cacbon thơm (δC 137,6, 130,1, 129,0, 127,1); bốn carbon olefin C13(δC 131,7), C-14(δC 133,8), C-12(δC 113,0), C-6(δC 151,8); ba cacbon bậc hai
gắn oxy C-7(δC 72,1), C-19(δC 80,9), C-18 (δC 76,0); hai cacbon bậc bốn C-9(δC
64.8), C-18 (δC 76.0); năm cacbon nhóm metin C-3(53,3), C-4 (47,6), C-5(32,8),
C-8 (52,8), C-16 (30,0); bốn cacbon nhóm methylen C-10 (43,8), C-15 (43,1), C17 (45,6), C-20 (29,7) và năm cacbon nhóm methyl C-22 (25,1), C-23 (24,3), C11 (13,1), CH3COO (24,0) và CH3O (58,8).

Phổ HMBC của hợp chất DCM1 cho thấy sự tương tác H-10, H-3’ với C-1’,
C-2’,6’ cho thấy phần phenyl gắn trực tiếp với C-10; H-23 tương tác với C-18, C-


18

19 và C-17; proton của nhóm OCH3 tương tác trực tiếp với C-19; H-22 tương tác
với C-15 và C-16.
Kết hợp phổ MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY
và so sánh với tài liệu tham khảo [26] cho phép xác định cấu trúc của DCE62-2 là
[11]-Cytochalasa-18-axeto- 6(12), 13-diene- 1, 21-dione-7, 18- dihydroxy-16,18dimethyl-19-metoxy-10-phenyl-(7S*, 13E, 16S*, 18S*, 19R*). Hợp chất này là
hợp chất mới.

Hình 3.1. Phổ khối lượng của hợp chất DCM1

Hình 3.2. Phổ IR của hợp chất của hợp chất DCM1


19

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất DCM1

Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất DCM1

Hình 3.5. Phổ DEPT của hợp chất DCM1


20

Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất DCM1

Hình 3.7. Phổ HSQC của hợp chất DCM1

Hình 3.8. Hợp chất DCM1


21

Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H, 13C-NMR và DEPT của hợp chất DCM1
δC (ppm)
175,5
53,3
47,6
32,8
151,8
72,1
52,8
64,8
43,8
13,1
113,0

Cacbon DEPT
1
C
2
3
CH
4
CH

5
CH
6
C
7
CH
8
CH
9
C
10
CH2
11
CH3
12
CH2
13
14
15

CH
CH
CH2

131,7
133,8
43,1

16
17

18
19
20
21
22
23
1'
2', 6'
3', 5'
4'
OCH3
OCO
COCH3

CH
CH2
C
CH
CH2
C
CH3
CH3
C
CH
CH
CH

30,0
45,6
76,0

80,9
29,7
213,2
25,1
24,3
137,6
130,1
129,0
127,1
58,8
177,4
24,0

δH (J= Hz)
4,89 (d, 19,6)
3,63 (m)
3,15 (t, 6,3)
3,11 (d, 6,3)
4,74 (d, 11,2)
3,21 (t, 9,8)
2,69 (d, 6,3)
0,89 (d, 7,0)
5,45 (m)
5,12 (m)
6,57 (m)
5,12 (m)
1,93 (m)
1,67 (m)
1,17 (m)
2,92 (m); 1,41 (m)

3,66 (d, 5,6)
1,20 (m)
0,94 (d, 7,0)
1,51 (s)
7,19 (m)
7,28 (m)
7,25 (m)
3,75 (s)
2,26 (s)

CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ QUẢ THỂ NẤM THAN
(Daldinia concentrica )
12
11

6

5

OH
7

10

3

1'

N

1

H

15

8
21

2

O O

22

14

13

9

4

16

19
20

18
17

MeO

4'

23

O
O

DCM1


22
12
11

12

6

5

OH
7

3

9

4

10
4'

O O HO

H

15

21 20 19 18

2 1

N

1'

13

8

11

23

6

5

3

16
10

OH

2 1

N

1'

17

9

4

H

4'

HO

8

7

8a

5

4a

OH

4

15

23

16
17

OH

1

8

HO

7

8a

O

CH3

2

CH3

2
3

H3C

5

OH

O

(DCM4) 8-Methyleugenitol

(DCM6) Uracil

(DCM8) Ergosterol

22

14

21 20 19 18

6

6

H3C

13

DCM3

1

O

8

O O

DCM 2
CH3

OH
7

22

14

4a

4

3

O

(DCM5) Eugenitol

(DCM7) D-mannitol

(DCM9) 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol

3.3.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học
Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Mẫu
DCM1
DCM2
DCM3
DCM4
DCM5
Ellipticine b

SK-LU-1
IC50 (μM)a
11.4 ± 0.5
23.4 ± 2.1
40.2 ± 2.6
>50
>50
0.4 ± 0.1

HepG2
IC50 (μM)a
13.5 ± 1.3
32.8 ± 1.4
55.7 ± 4.0
21.5 ± 5.1
46.9 ± 3.7
0.4 ± 0.1

Hep3B
IC50 (μM)a
13.3 ± 1.4
41.5 ± 2.3
53.1 ± 5.1
21.7 ± 2.8
35.2 ± 3.4
0.4 ± 0.1

SW480
IC50 (μM)a
13.1 ± 0.9
23.0 ± 1.1
58.2 ± 2.3
>100
>100
0.5 ± 0.1

MCF7
IC50 (μM)a

13.5 ± 1.2
31.7 ± 3.6
35.2 ± 1.5
43.6 ± 5.1
>100
0.4 ± 0.1

Thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào với SW480: Ung thư đại tràng ở
người (human colon adenocarcinoma), SK-LU-1: ung thư phổi ở người (human
lung carcinoma); Hep3B: ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular
carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular
carcinoma); MCF7: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma). Các chất


23

DCM1 và DCM2 thể hiện hoạt tính với IC50 = 11.4-41.1 µg/ml trên các dòng tế
bào khác nhau.
3.4. Nấm linh chi (Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. )
3.4.1. Phân lập một số hợp chất
Quả thể nấm linh chi (G. applanatum) được ngâm chiết bằng dung môi
metanol. Cất thu hồi dung môi dịch chiết thu được cao thô metanol. Hòa tan cao
metanol vào trong nước và chiết phân bố với dung môi clorofom thu được cao
clorofom và dịch nước.
Từ cao cloroform của nấm linh chi (G. applanatum), bằng các phương pháp
sắc ký cột trên silica gel đã phân lập được 5 hợp chất và xác định các hợp chất
này bằng các phương pháp phổ (Bảng 3.21).
Bảng 3.21. Các hợp chất được tách ra từ nấm linh chi (G. applanatum)
Ký hiệu
hợp chất

GAM1
GAM2
GAM3
GAM4
GAM5

Tên hợp chất
Ergosterol
5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol
ergosta-7,22-dien-3β-ol
lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol
3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid

Khối lượng
(mg)
123
10
31
38
30

3.4.2. Xác định cấu trúc

(1) Ergosterol (GAM1)

(2) 5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol
(GAM2)

(3) Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3) (4) Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol
(GAM4)

(5) 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5)