Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam
viÖn c«ng nghÖ sinh häc

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH
CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum
cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA
HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG Streptomyces cavourensis YBQ59

Chuyên ngành : Vi sinh vật học
Mã số

: 9 42 01 07

tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

hµ néi - 2019


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Phí Quyết Tiến
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS. TS. Chu Kỳ Sơn
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính
thức tại Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội
Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Viện Công nghệ sinh học
- Trang web của Bộ GD&ĐT


1
MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và
kháng vi sinh vật (VSV). Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan
trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra. Tuy nhiên việc lạm dụng
thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây
bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012). Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và
đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị
nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Vì vậy, hướng
nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà khoa
học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007). Theo Bérdy (2012),
khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng
được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn. Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có
nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho
thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất. Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự
nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và
ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều
lĩnh vực của đời sống. Ngoài ra, nhiều chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ
xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và
nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên việc nghiên cứu những gen pks, nrps

liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng
sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005). Cho đến nay,
rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và
cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa.
Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã được
chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư
(Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế
chưa được công bố nhiều. Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các
môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh
học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền. Các chủng XKNS có
hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế bào ung thư phổi, mang các gen
chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc. Từ đó, nghiên cứu xác định điều kiện
nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp chất và giải trình tự, lắp ráp de
novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được tuyển chọn để tìm kiếm thông tin
về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh. Từ những lý do trên
nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng
sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam
và đặc tính sinh học của hoạt chất từ chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”


2
1. Mục tiêu
Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên
cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh sạch
được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các gen liên
quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59.
2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và nghiên cứu sự đa dạng sinh học của các chủng XKNS trên cây quế
(C. cassia Presl) thu thập tại các điểm thuộc tỉnh Hòa Bình, Yên Bái và Lai Châu.
- Tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh hoạt tính cao và xác định một số gen

liên quan đến tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn.
- Nghiên cứu đặc điểm di truyền, lên men, tách chiết và xác định một số cấu trúc
kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces cavourensis YBQ59.
3. Những đóng góp mới của luận án
- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh
của XKNS trên cây quế (C. cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam.
- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ
rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2),
nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6),
prelactone B (7), daucosterol (8), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện lần đầu
từ loài S. cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng kháng sinh
cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF,
Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM).
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 150 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (32
trang, 3 bảng, 6 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (11 trang);
Chương 3: Kết quả nghiên cứu (37 trang, 10 bảng, 20 hình); Chương 4: Bàn luận kết
quả (28 trang, 8 hình); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình công
bố (2 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (28 trang
với 7 tài liệu tiếng Việt, 243 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (63 trang).
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Thuật ngữ nội sinh “endophytic” được đưa ra bởi de Bary (1866), theo định nghĩa
của ông, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác
biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật”. Các hợp
chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng
và hoạt tính sinh học như các chất kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh,
kháng nấm, tiêu diệt tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất
diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng... (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011). Cho

3
đến nay rất nhiều kháng sinh mới được tìm ra như munumbicin A-D (Castillo và cs.,
2002), celastramycin A-B (Pullen và cs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003)
và demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) từ XKNS hiện đang có các ứng dụng trong
nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Golinska và cs., 2015).
XKNS là một trong những nhóm VSV rất đa dạng và còn ít được nghiên cứu, có
khả năng sinh ra những chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015; Nalini và
Prakash, 2017). Theo quan niệm đó, sự đa dạng sinh học của XKNS là sự đa dạng về
thành phần loài, chi về các taxon, nhưng đồng thời cũng là một sự đa dạng về các hợp
chất tự nhiên có hoạt tính do chúng sinh ra. XKNS rất đa dạng và mức độ đa dạng có
thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau. Sự đa dạng về chi
và số lượng xạ khuẩn nội sinh phần lớn phụ thuộc vào phương pháp và môi trường
phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash, 2017). Nghiên cứu này không những
mở ra hướng nghiên cứu mới về VSV học ứng dụng ở Việt Nam, mà còn góp phần
quan trọng trong việc xác định được mức độ đa dạng sinh học nguồn tài nguyên
XKNS trên một số cây dược liệu của Việt Nam. Việc phát hiện được các nguồn gen
xạ khuẩn mới, tiềm năng nhằm ứng dụng và phát triển các sản phẩm chuyển hóa thứ
cấp do chúng sản sinh trong lĩnh vực nông nghiệp, y dược và thực phẩm một cách
bền vững, không dẫn đến việc huỷ hoại cây chủ, bảo vệ sự đa dạng tài nguyên thực
vật cũng như VSV của Việt Nam là cấp thiết.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
- Mẫu nghiên cứu: 9 mẫu (rễ, thân, lá) cây quế thu thập từ xã Thung Nai, Cao
Phong, Hòa Bình (20°47’21”N;105°21’20”E) ở độ cao 399 m, tháng 12/2013; 9 mẫu
từ xã Tân Hợp, Văn Yên, Yên Bái (21°53’14”B;104°35’9”Đ) ở độ cao 700 m, tháng
02/2014 và 9 mẫu từ xã Phăng Sô Lin, Sìn Hồ, Lai Châu (22°21’41”B;103°16’4”Đ) ở
độ cao 800 m, tháng 02/2014. Mẫu thực vật Cinnamomum cassia Presl được lưu trữ
tiêu bản và phân loại vào tháng 01/2106 bởi TS. Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh
thái và Tài nguyên sinh vật, Viện HL KH&CN VN.

- Các chủng VSV kiểm định: Salmonella enterica subsp. enterica serovar
Typhimurium ATCC 14028 (viết rút gọn Salmonella Typhimurium ATCC 14028),
Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea ATCC 9341, Bacillus cereus ATCC
11778, Proteus vulgaris ATCC 49132, Pseudomonas auroginosa ATCC 9027,
Candida albicans ATCC 10231, Enterobacter aerogenes ATCC 13048,
Staphylococcus epidermidis kháng methicilin (MRSE) ATCC 35984 và
Staphylococcus aureus kháng methicilin (MRSA) ATCC 33591 nhận từ Bộ sưu tập


4
giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Các dòng tế bào ung thư: Hep3B (tế bào ung thư gan ở người); MCF7 (tế bào
ung thư vú người) và A549 (ung thư phổi ở người) được cung cấp bởi GS. JeongHyung Lee, trường ĐHQG Kangwon, Hàn Quốc.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
1. Xử lý bề mặt mẫu thực vật và phân lập XKNS theo Qin và cs. (2009).
2. Đánh giá sự đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR (Nurjasmi và cs.,
2009).
3. Xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định theo phương pháp của Saadoun và
Muhana (2008) và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC50) theo Andrews (2001).
4. Đánh giá khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline của các chủng xạ
khuẩn bằng phép thử màu theo Trease và Evans (1996).
5. Xác định gen mã hóa PKS-I, PKS-II và NRPS được khuếch đại bằng phản ứng
PCR dựa trên 3 bộ mồi suy biến K1F ⁄M6R, KSaF ⁄KSaR, A3F ⁄A7R theo Li và
cs. (2008).
6. Xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp so mầu MTT (3-(4,5dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) theo Cree (2011).
7. Phân loại VSV bằng phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA theo Sambrook và
cs. (2001); so sánh độ tương đồng bằng phần mềm Clustal W (Thompson và cs.,
1997); cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum-likelihood, thuật toán
gamma và Kimura 2 với giá trị bootstrap 1000 (Felsenstein, 1985; Tamura và cs.,

2013).
8. Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn và định tên xạ khuẩn theo Sổ tay phân
loại VSV của Bergey (Holtet và cs., 1989) và Chương trình xạ khuẩn quốc tế
(ISP) (Shirling và Gottlieb, 1966).
9. Tách chiết và giải trình tự hệ gen xạ khuẩn bằng máy giải trình tự gen thế hệ mới
IonTorrent PGM; hệ gen được lắp ráp phần mềm VelvetOptimiser (Gladman và
Seemann, 2012); dự đoán gen theo phần mềm Prodigal (Hyatt và cs., 2010),
GeneMarkS (Besemer và cs., 2001) và antiSMASH (Blin và cs., 2013; Weber và
cs., 2015).
10. Xác định cấu trúc của các CKS từ dịch lên men xạ khuẩn theo các phương pháp
đo phổ, phân tích cấu trúc bằng các phổ ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT,
HSQC, HMBC theo Nguyễn Đình Triệu (2005).
11. Xử lý thống kê: dùng toán thống kê, phần mềm Excel 2010 và phần mền
XLSTAT 2016 để phân tích độ sai lệch một chiều (ANOVA) được thực hiện để
phân tích những khác biệt đáng kể (P=0,05).


5
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Sự đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế
(C. cassia Presl)
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl)
Từ 27 mẫu cây quế (C. cassia Presl) thu thập được từ vùng Tây Bắc, Việt Nam,
sau khi xử lý bề mặt và nuôi cấy trên các môi trường phân lập đặc hiệu (TWYE,
STA, HV, TA, SA, CA, SPA, RA và ISP5), trong 6-8 tuần ở 28°Ccho thấy tỷ lệ các
chủng XKNS phân bố không đều (Hình 3.1).

Hình 3.1. Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh tại Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên
Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy.

Nhìn chung, các chủng xạ khuẩn phát triển khá chậm trên 9 loại môi trường với số
lượng đạt 2-3 chủng/mẫu. Sau thời gian nuôi cấy từ 4-6 tuần, 297 chủng XKNS đã
phân lập và thuần khiết từ các bộ phận của cây, trên môi trường phân lập đặc hiệu
khác nhau (Phụ lục 5). Trong đó, 111 chủng từ các mẫu quế Hòa Bình, chiếm 37,3%;
81 chủng từ Lai Châu, chiếm 27,3% và 105 chủng từ Yên Bái, chiếm 35,4%. Đặc
điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc XKNS đĩa thạch trên môi trường YIM38 cho
thấy, số lượng xạ khuẩn khác nhau tùy thuộc vào khu vực lấy mẫu.
3.1.2. Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl)
3.1.2.1. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây quế (C. cassia Presl)
Trong số 297 chủng xạ khuẩn được phân lập ở Hòa Bình số lượng xạ khuẩn thu
được từ thân, rễ, lá lần lượt đạt 60,4% (n=67), 26,1% (n=29) và 13,5% (n=15) trên


6
tổng 111 chủng XKNS; ở Yên Bái số lượng xạ khuẩn thu được từ thân cao nhất
38,2% (n=40), rễ 35,2% (n=37) và lá thấp nhất 26,7% (n=28) trên tổng 105 chủng
XKNS (Hình 3.2A). Ngược lại số lượng xạ khuẩn phân lập từ quế tại Lai Châu đạt
cao nhất ở rễ 43,2% (n=35), tiếp đến là thân 34,6% (n=28) và thấp nhất ở lá 22,2%
(n=18) trên tổng 81 chủng XKNS. Tuy nhiên, theo số liệu tổng hợp tại 3 khu vực cho
thấy, số lượng XKNS cao nhất ở thân 45,5% (n=135) tiếp theo rễ 34,0% (n=101) và
thấp nhất ở lá 20,5% (n=61) (Hình 3.2B).

Hình 3.2. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế: số liệu tổng hợp tại ba
vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B).

3.1.2.2. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) theo môi trường
phân lập
Theo các nghiên cứu về XKNS, phương pháp xử lý mẫu và thành phần môi
trường là yếu tố chính quyết định đến kết quả phân lập, đánh giá sự đa dạng của
XKNS và tìm ra các loài xạ khuẩn mới (Okazaki, 2003). Kết quả đánh giá đa dạng xạ

khuẩn phân lập trên 9 loại môi trường được thể hiện trên Hình 3.3. Số lượng XKNS
tại 3 vùng lấy mẫu đạt cao nhất trên các môi trường CA, STA lần lượt đạt 20,5% và
19,2%, số lượng XKNS trên các môi trường còn lại chỉ đạt từ 3,0-16,5% trên tổng số
chủng xạ khuẩn phân lập được (n=297).
TA

19.2%

SA

16.5%

CA

7.7%

12.8%

SPA
HV

12.1%
3.0%
4.0%
4.0%

ISP5

20.5%

TWYE
RA

A

STA

Hình 3.3. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu tổng
hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B).

B


7
3.1.2.3. Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C. cassia Presl) theo nhóm
mầu khuẩn ty
Mầu khuẩn ty được coi là tiêu chí cơ bản để chọn lọc các chủng xạ khuẩn trên các
môi trường phân lập, tránh chọn lọc các chủng có cùng đặc điểm hình thái, màu sắc
giống nhau. Sự khác biệt về màu sắc hệ khuẩn ty xạ khuẩn được hình thành do nhiều
nguyên nhân khác nhau như: khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm, chất dinh dưỡng, pH,...
(Shirling và Gottlieb, 1966). Số lượng xạ khuẩn phân lập trên cả 3 khu vực có màu
sắc hệ khuẩn ty thuộc 6/7 nhóm mầu xuất hiện với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, tỷ lệ
các chủng xạ khuẩn phân lập thuộc nhóm màu xám là cao nhất (42,1%; n=125), tiếp
theo là vàng (22,6%; n=67), trắng (17,8%; n=53), đỏ (14,5%; n=43), xanh (2,00%;
n=6)và tím(1,00%; n=3) trên tổng số chủng xạ khuẩn (n=297) (Hình 3.4).
Xám
Đỏ

Trắng
Xanh

Vàng
Tím

2.0%
1.0%
14.5% 0.0%
42.1%
22.6%

17.8%

A

B

Hình 3.4. Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba vùng
lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B).

3.1.2.4. Sự đa dạng di truyền DNA của một số chủng xạ khuẩn nội sinh
Trên cơ sở 297 chủng XKNS chọn ngẫu nhiên 16 chủng XKNS phân lập trên cây
quế HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40;
HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 được lựa chọn để đánh
giá đa dạng di truyền DNA bằng phản ứng BOX-PCR. Phân tích sản phẩm phản ứng
BOX-PCR của 16 chủng xạ khuẩn được lựa chọn cho 15 băng có kích thước khác
nhau trên bản điện di tương ứng với 15 vùng gen khác nhau trên hệ gen của các
chủng xạ khuẩn (Hình 3.5). Xác định quan hệ di truyền cho thấy đa số các chủng xạ
khuẩn có độ tương đồng di truyền <90%, chỉ có hai cặp xạ khuẩn (HBQ46 và
HBQ47) và (HBQ9 và HBQ33) có hệ độ tương đồng di truyền >90%, chứng tỏ các
chủng XKNS nghiên cứu có độ sai khác về di truyền trong hệ gen của XKNS. Kết

quả nghiên cứu trên bước đầu đánh giá đa dạng XKNS, cho thấy các chủng XKNS
phân lập từ cây quế có độ đa dạng di truyền cao hay tần suất phân lập các chủng trùng


8
lặp về di truyền thấp. Ngoài ra, đặc điểm hình thái của 16 xạ khuẩn trên cũng cho
thấy tính đa dạng về mầu sắc khuẩn lạc, hình dạng tế bào.

Hình 3.5. Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa hình
sản phẩm phản ứng BOX-PCR. Băng M: Thang DNA chuẩn (100 bp).

3.1.3. Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh
Kết quả nghiên cứu hoạt tính kháng 09 VSV kiểm định của 297 chủng XKNS
được tổng hợp trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ
khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế

Chủng vi sinh vật kiểm định

Vi khuẩn Gram âm
E. coli ATCC 11105
P. vulgaris ATCC 49132
S. TyphimuriumATCC 14028
E. aerogenes ATCC 13048
P. aeruginosa ATCC 9027
Vi khuẩn Gram dương
S. lutea ATCC 9341
MRSE ATCC 35984
B. cereus ATCC 11778
Nấm men

C. albicans ATCC 10231

Số chủng xạ khuẩn kháng
vi sinh vật kiểm định
Hòa
Lai
Yên
Bình
Châu
Bái
(111)
(81)
(105)

Tỷ lệ (%)
Hòa
Bình

Lai
Châu

Yên
Bái

Tổng
số

25
29
1

28
0

6
5
6
4
6

9
20
19
8
16

22,5
26,1
0,9
25,2
0,0

7,4
6,2
7,4
4,9
7,4

8,6
19,0
18,1

7,6
15,2

13,5
18,2
8,8
13,5
7,4

28
28
28

4
10
8

4
22
15

25,2
25,2
25,2

4,9
12,3
9,9

3,8

21,0
14,3

12,1
20,2
17,2

10

2

13

9,0

3,7

12,4

8,4


9
Trong số 297 chủng xạ khuẩn được thử nghiệm, có 96 chủng (chiếm 32,3%)
kháng ít nhất một VSV kiểm định, chiếm đa số là các chủng xạ khuẩn Hòa Bình
(n=40; 41,7%), tiếp đến Yên Bái (n=36; 37,5%) và Lai Châu (n=20; 20,8%). Tổng số
96 chủng xạ khuẩn có 37 chủng thể hiện phổ kháng khuẩn rộng (cùng kháng nhiều
hơn 6 loại vi sinh vật kiểm định). Trong số 96 chủng phân lập, tác dụng ức chế tác
nhân gây bệnh cao nhất đối với MRSE (n = 60, 62,5%), P. vulgaris (n = 54, 56,3%),
tiếp đến là B. cereus (n = 51, 53,1%), E. coli và E. aerogenes (n = 40, 41,7%), S.

lutea (n = 36, 37,5%), S. Typhimurium (n = 26, 27,1%), C. albicans (n = 25, 26,0%)
và P. aeruginosa (n = 22, 22,9%).
3.1.4. Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh
Trong khuôn khổ của luận án đã phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA của
82/96 chủng XKNS sinh kháng sinh và xác định được trình tự của 82 chủng XKNS
có độ tương đồng cao (97,9 - 100%) so với các trình tự tương ứng trên GenBank
(NCBI). 82/96 chủng XKNS đã được phân loại tới loài và đã được đăng ký trên
GenBank (NCBI).
Kết quả phân loại các chủng được tập hợp theo các chi, họ thuộc ngành xạ khuẩn
(Actinobacteria) trên Bảng 3.2 cho thấy, 82 chủng XKNS được phân thành 6 chi
thuộc 6 họ khác biệt: Streptomyces thuộc họ Streptomycetaceae, Microbacterium
thuộc họ Microbacteriaceae, Brevibacterium thuộc họ Brevibacteriaceae,
Micromonospora thuộc họ Micromonosporaceae, Saccharothrix thuộc họ
Actinosynnemataceae và Nocardia thuộc họ Nocardiaceae. Trong đó, số chủng thuộc
chi Streptomyces chiếm tỷ lệ cao nhất (92,7%), tiếp theo là chi Microbacterium
(2,5%), còn các chi Micromonospora, Nocardia và Saccharothrix chiểm tỷ lệ thấp
nhất (mỗi loại chiếm 1,2%).
Bảng 3.2. Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu
và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rDNA
STT

Họ

Chi

Số lượng chủng

Tỷ lệ (%)

1

Brevibacteriaceae

Brevibacterium

1

1,2

2
3
4
5

Microbacteriaceae
Micromonosporaceae
Nocardiaceae
Actinosynnemataceae

Microbacterium
Micromonospora
Nocardia
Saccharothrix

2
1
1
1

2,5

1,2
1.2
1,2

6

Streptomycetaceae

Streptomyces

76

92,7

82

100

Tổng số

XKNS trên cây quế có sự đa dạng mức độ loài tương đối cao, chi Streptomyces là
chi phổ biến nhất tại Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái, chi Microbacterium xuất hiện


10
tại ở tại hai khu vực Hòa Bình và Lai Châu, còn chi Nocardia chỉ xuất hiện ở Hòa
Bình. Tuy nhiên, một số chủng thuộc các chi hiếm Saccharothrix chỉ phân lập được
từ Lai Châu (Bảng 3.2). Điều này cho thấy, số lượng XKNS khác nhau giữa các vị trí
lấy mẫu có khả năng bị ảnh hưởng bởi điều kiện khí hậu khác nhau.
3.1.5. Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh
Theo nhiều tài liệu trên thế giới công bố, một số sản phẩm trao đổi chất bậc hai có
hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư… của xạ khuẩn được tổng hợp bởi 3 nhóm
enzyme chính là PKS-I, PKS-II và NRPS. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh ba gen
pks-I, pks-II và nrps mã hóa enzyme có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp kháng
sinh (Minotti và cs., 2004).
Số lượng chủng xạ khuẩn

Hòa Bình

Lai Châu

Tổng số

Yên Bái
59

60
50
37

35

40
30

23

23

20
10

5

17 19

9

11 11 13

0
PKS-I

PKS-II

NRPS

Gen mã hóa

Hình 3.6. Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96 chủng xạ
khuẩn nội sinh cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái

Trong nghiên cứu này, xác định sự có mặt của các gen liên quan đến tổng hợp
kháng sinh là một trong những đặc điểm sinh học của XKNS sinh kháng sinh. Kết
quả cho thấy, sản phẩm PCR khuếch đại các gen của 96 chủng xạ khuẩn cho băng
DNA có kích thước khoảng 1400 bp (đối với gen pks-I), 600 bp (pks-II) và 750 bp
(nrps), tương ứng với kích thước mồi sử dụng khuếch đại gen pks-I, pks-II, nrps đã
đưa ra. Điều đó cho thấy, 03 cặp mồi suy biến (K1F/M6R; A3F/A7R; KSαF/KSαR)
sử dụng trong thí nghiệm là phù hợp. Tỷ lệ mang gen pks-I, pks-II và nrps lần lượt là

38,5% (n=37/96), 61,5% (n=59/96) và 36,5% (n=35/96) (Hình 3.6). Hoạt tính kháng
VSV kiểm định và khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học (PKS-I, PKS-II và
NRPS) là khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính sinh học của các chủng
XKNS có thể liên quan trực tiếp tới sự có mặt của các gen mã hóa PKS-I, PKS-II và
NRPS và các chủng XKNS trên cây quế có thể là nguồn sinh các chất kháng sinh và
kháng ung thư quan trọng.


11
3.1.6. Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline
Kháng sinh thuộc nhóm anthracycline sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn phần lớn cho
thấy độc tính đối với các khối u ở người hoặc các dòng tế bào ung thư (Minotti và cs.,
2004; Nakashima và cs., 2013). Ngoài ra, nhóm chất anthracycline từ xạ khuẩn là một
trong nhóm chất có hiệu quả nhất được sử dụng phổ biến trong điều trị nhiều loại ung
thư (McGowan và cs., 2017). Trong số 96 chủng XKNS tuyển chọn có 70 chủng
(72,9%) có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline (chuyển màu cam với
môi trường acid và tím trong môi trường kiềm). Trong đó, các chủng phân lập được
từ cây quế ở Yên Bái sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline chiếm tỷ lệ cao nhất
(31,3%), tiếp theo là Hòa Bình (28,1%), Lai Châu (13,5%). Đặc biệt, 14/96 chủng
XKNS không có khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline, nhưng 14
chủng này lại có hoạt tính kháng khuẩn chống lại ít nhất 3 VSV kiểm định, do các
hợp chất được tạo ra bởi các xạ khuẩn có thể không thuộc nhóm anthracycline.
3.2. Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của
chủng Streptomyces cavourensis YBQ59
Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSV kiểm định cũng như khả năng mang
các gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp kháng sinh và sinh kháng sinh thuộc
nhóm anthracyclin, trong luận án này nghiên cứu sinh đã lựa chọn chủng S.
cavourensis YBQ59 thể hiện phổ kháng rộng, kháng mạnh với 8/9 chủng VSV kiểm
định cho các nghiên cứu tiếp theo. Đồng thời, chủng YBQ59 mang gen mã hóa PKSI, PKS-II, NRPS và sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Trong đó các vi
khuẩn gây bệnh như E. coli, P. vulgaris, S. Typhimurium và P. aeruginosa là những

tác nhân gây bệnh cần ưu tiên kiểm soát và phát triển kháng sinh điều trị theo khuyến
cáo của tổ chức y tế thế giới (WHO) công bố vào tháng 2/2017. Ngoài ra, chủng
YBQ59 thể hiện tính kháng khuẩn mạnh với S. epidermidis kháng methicillin gây
bệnh cơ hội phổ biến ở người khó điều trị (Otto, 2009). Vì vậy, chủng YBQ59 được
tuyển chọn cho những nghiên cứu về đặc điểm sinh học, khai thác hệ gen, điều kiện
lên men, thu hồi và tách chiết các chất có hoạt tính sinh học.
3.2.1. Đặc điểm sinh học của chủng S. cavourensis YBQ59
Chủng YBQ59 phát triển tốt trên môi trường ISP2 ở pH 7,0, nhiệt độ 30°C với
nồng độ NaCl là 2%. Nhiệt độ, pH, nồng độ muối là đặc điểm có ý nghĩa quan trọng
đối với việc ứng dụng xạ khuẩn trong lên men thu nhận các hợp chất có hoạt tính
kháng khuẩn. Kết quả nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn carbon, nitơ của chủng
YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 sử dụng được hầu hết các nguồn carbon (11/13) thử
nghiệm ngoại trừ D-glucosamine, D-sorbitol, nhưng chỉ sử dụng được 6/13 nguồn
nitơ thử nghiệm (L-asparagin monohydrat, L-arginin, L-valin, L-methionin, Lthreonin, L-cystein) và chủng YBQ59 còn có khả năng sinh một số enzyme ngoại bào


12
như urease, gelatinase, amylase, cellulase và xylanase. Dựa trên đặc điểm hình thái,
sinh lý-sinh hóa của chủng YBQ59 cho thấy, chủng YBQ59 có đặc diểm hình thái và
sinh lý-sinh hóa giống loài S. cavourensis (El-Naggar và cs., 2016). Dựa vào so sánh
đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rRNA chủng
YBQ59 được định danh là Streptomyces cavourensis YBQ59 với mã số GenBank
MF950891.
3.2.2. Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh
của chủng S. cavourensis YBQ59
Dữ liệu được giải trình tự trên máy giải trình tự gen thế hệ mới IonTorrent PGM
chủng YBQ59 thu được 2.856.000 đoạn DNA ngắn (read, từ 25-373 bp) với tổng
dung lượng dữ liệu là 512.914.080 bp. Tiền xử lý được bộ dữ liệu tinh sạch với
2.042.979 (71,5%) đoạn trình tự có điểm chất lượng trên 20 và độ dài từ 36 đến 211.
Lắp ráp de novo dữ liệu tinh sạch của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm

VelvetOptimser với kích thước k-mer = 87, ghép nối dữ liệu cho thấy kích thước
genome được dự đoán là 10.232.294 bp, bao gồm 4.428 đoạn ghép nối (contig), chỉ
số N50=12.307 bp, contig dài nhất: 161.472 bp với độ bao phủ trung bình 26X và tỷ
lệ GC trong hệ gen là 64%.
Dự đoán và chú thích gene nhờ kết hợp ba phần mềm Prodigal, GeneMarkS
(Besemer và cs., 2001) và NCBI Prokaryotic genome annotation pipeline (PGAP)
version 4.5 (Tatusova và cs., 2016). Đã chú giải được 8.958 trình tự gen mã hoá
protein (protein-coding), 76 gen tRNA, 4 operons rRNA và 3.145 gen giả định
(pseudogene). Trong số các gen chú giải bằng NCBI có 6758 gen có kết quả chú giải
trên cơ sở dữ liệu Gene Ontology (GO) chiếm 73% số lượng gen thu được chia thành
03 nhóm: nhóm Biological Process (các quá trình sinh học) chứa thông tin các quá
trình mà các gen chú giải tham gia, nhóm Cellular component (thành phần trong tế
bào hoặc bào quan) cung cấp thông tin vị trí hoạt động của các gen và nhóm
Molecular Function (chức năng phân tử) cho biết chức năng của mỗi gen. Thống kê
kết quả thu được từ Blast2GO PRO (Conesa và cs., 2005), cho thấy nhóm Biological
Process có số lượng gen thực hiện quá trình chuyển hóa nhiều nhất với 6292 gen,
nhóm Cellular component có nhiều gen hoạt động trong tế bào hơn so với các vị trí
khác với 3083 gen và nhóm Molecular Function cho biết số lượng gen thực hiên chức
năng chuyển hóa chiếm phần lớn với 5961 gen.
Ngoài ra, chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis YBQ59 sử dụng cơ sở dữ liệu
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) (Kanehisa và Goto, 2000) chỉ
ra có 140 con đường chuyển hóa (pathway) liên quan đến sinh tổng hợp các chất
chuyển hóa thứ cấp. Bên cạnh đó, tổng cộng 717 enzyme liên quan đến quá trình sinh
tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó 158 enzyme trực tiếp liên quan đến


13
quá trình tổng hợp kháng sinh như macrolide, ketolide (12, 14, 16 macrolide), các cấu
trúc peptide nonrobosomal, cấu trúc polyketide loại I và loại II và dự đoán khả năng
sinh kháng sinh của chủng S. cavourensis YBQ59 bao gồm penicillin, cephamycin C,

nocardicin A, clavaminate, erythromycin A/B, oleandomycin, picromycin,
methymycin,
neomethymycin,
avermectin,
tetracycline,
oxytetracycline,
chlortetracycline, mithramycin, tetracenomycin C, elloamycin, rebeccamycin,
vancomycin và validamycin A.

A
A

B

Hình 3.7. Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư
bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide
(ctg1114_1) (B)
Ghi chú: Màu tím đậm chỉ ORF, mũi tên chỉ chiều tổng hợp protein. A: Nhóm gen bao gồm 2 gen
chính ctg328_1 và ctg328_2 được dự đoán mang chức năng tổng hợp beta-ketoacyl, ngoài ra còn có 2
NRPS/PKS motif tên PKSI-KS_m6 và PKSI-KS_m3, 1 domain và 1 vùng hoạt động cysteine. B: gen
ctg1114_1 mã hóa cho 3-oxoacyl synthase III, gen ctg1114_2 theo blast hiện chưa xác định được chức
năng

Hơn nữa, phân tích hệ gene của chủng S. cavourensis YBQ59 bằng phần mềm
antiSMASH v3.0 (Weber và cs., 2015) cho thấy, hệ gene của chủng S. cavourensis
YBQ59 chứa 37 nhóm gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất trao
đổi thứ cấp, trong đó 14 con đường sinh tổng hợp liên quan tới sinh tổng hợp chất có
hoạt tính sinh học như NRPS, PKS-II, hybrid PKS-NRPS, PKS-III, Beta-ketoacyl
synthase và những hoạt chất dự đoán được từ hệ gene của chủng S. cavourensis
YBQ59 bao gồm bacteriocin, bleomycin, calyculin, coelimycin, colonic acid,

chlorizidine A, desferrioxamine B, ectoine, arylpolyene, macrotetrolides, naringenin,
landepoxcin, terpene và svaricin. Dữ liệu chú giải hệ gen của chủng S. cavourensis
YBQ59 đã được đăng ký trên NCBI dưới mã số QLNH00000000.


14
Trong số các nhóm gen có gen ctg328_1 tham gia vào con đường sinh tổng hợp
chất kháng ung thư bleomycin có độ tương đồng 59% với gen bleom_AAG02357_H
nguồn gốc từ Streptomyces verticillus ATCC 15003 (Du và cs., 2000) và ctg328_2
tham gia vào con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh jamaicamide với ctg328_1 có
độ tương đồng 51% với gen JamM_AAS98784_H nguồn gốc từ Lyngbya majuscula
(Edwards và cs., 2004) (Hình 3.7A). Hai gen ctg1114_1 và ctg1114_2 khác tham gia
vào con đường sinh tổng hợp kháng sinh macrotetrolide (Hình 3.7B).
3.2.3. Lựa chọn môi trường cơ sở và điều kiện lên men thích hợp sinh kháng sinh
của chủng S. cavourensis YBQ59
Chủng S. cavourensis YBQ59 sinh tổng hợp chất kháng khuẩn cao nhất trên môi
trường lên men MT6 với đường kính vòng vô khuẩn kháng S. Typhimurium ATCC
14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt đạt 25,6 mm và 27,1 mm. MT6 (g/l): CaCO3
1,0; tinh bột tan 10,0; bột đậu tương 10,0; nước cất 1000 ml được lựa chọn làm môi
trường lên men chủng YBQ59 trong các nghiên cứu tiếp theo. Điều kiện lên men
thích hợp nhất cho sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng S. cavourensis YBQ59
nuôi ở 25-37°C, pH 6,0-8,0; tỷ lệ tiếp giống 5%, độ thông khí bề mặt (surface
aeration) 20%, chủng cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. Khi khảo sát độ thái lên
men chủng S.cavourensis YBQ59 trên bình lên men Bioflo 110 5 lít kết quả cho thấy
thời điểm thích hợp thu hồi kháng sinh ở 72-78 giờ lên men với đường kính VVK
trên VSV kiểm định S. Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984 lần lượt
đạt 34,0 và 41,2 mm.
3.2.4.

Hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào ung thư của chủng S. cavourensis

YBQ59

Chủng S. cavourensis YBQ59 có khả năng kháng 7/8 chủng vi khuẩn thử nghiệm
với đường kính VVK trên 20 mm và hoạt tính kháng sinh mạnh nhất đối với chủng
MRSE ATCC 35984 (đường kính VVK đạt 41,2 mm), tiếp theo là S. Typhimurium
ATCC 14028 có hoạt tính kháng khuẩn với đường kính VVK 34,0 mm. Chủng S.
cavourensis YBQ59 có hoạt tính kháng nấm men C. albicans ATCC 10231 cao
(đường kính VVK đạt 21,5 mm) (Bảng 3.3). Kết quả trên cho thấy chủng S.
cavourensis YBQ59 rất có tiềm năng sinh các hợp chất kháng sinh ứng dụng trong
điều trị nhiễm khuẩn ở người.
Chủng S. cavourensis YBQ59 có hoạt tính ức chế đối với cả 3 dòng tế bào ung
thư ở mức độ khác nhau (Bảng 3.4). Hoạt tính gây độc tế bào được thể hiện thông
qua phần trăm tế bào sống sót, ở cả hai nồng độ 30 µg/ml và 100 µg/ml lượng tế bào
ung thư còn sống nhỏ hơn 50% trên dòng tế bào A549 và Hep3B, riêng với dòng tế
bào ung thư vú MCF7 chủng S. cavourensis YBQ59 ức chế được ở nồng độ 30


15
µg/ml. Từ đó, ta có thể nghiên cứu các ứng dụng để sản xuất các loại thuốc có khả
năng ức chế hoạt động của các dòng tế bào ung thư gan Hep3B, ung thư phổi A549
và ung thư vú MCF7. Trong khuôn khổ luận án các hợp chất tách được bước đầu
sàng lọc khả năng kháng tế bào ung thư. Việc đánh giá khả năng gây độc đối với tế
bào thường sẽ được nghiên cứu sâu khi các hoạt chất được lựa chọn trong phát triển
nghiên cứu lâm sàng tiếp theo.
Bảng 3.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch lên men chủng S.
cavourensis YBQ59
Chủng vi sinh vật kiểm
định
Vi khuẩn Gram âm
E. coli ATCC 11105

Đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm)*
25,3e ± 0.12

P. vulgarisATCC 49132

27,5d ± 0.11

S. Typhimurium ATCC 14028

34,0c ± 0.08

P. aeruginosa ATCC 9027

23,6f ± 0,21

E. aerogenes ATCC 13048

25,5e ± 0.09

Vi khuẩn Gram dương
S. lutea ATCC 9341

0h

MRSAATCC 35984

41,2a ± 0.14

B. cereus ATCC 11778

30,2b ± 0.17

Nấm men
21,5g ± 0.13

C.albicans ATCC 10231

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f, g, h trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý
nghĩa thống kê theo đánh giá của Fisher (p <0,05).
Bảng 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của dịch lên men chủng S. cavourensis
YBQ59
Dòng tế bào
ung thư

Tỷ lệ tế bào sống sót (%)
Nồng độ 30 (µg/ml)

Nồng độ 100 (µg/ml)

A459

38,2 ±2,54

32,0b±1,01

Hep3B

39,8b±1,71

30,3b±1,58

MCF7

b

a

50,2 ±2,04

41,3a±1,91

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
theo đánh giá của Fisher (p <0,05).


16
3.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S.
cavourensisYBQ59
3.3.1. Tách chiết và tinh sạch các hoạt chất thứ cấp
Sơ đồ quy trình phân tích các hoạt chất thứ cấp từ dịch lên men của chủng S.
cavourensis YBQ59 được trình bày trên Hình 3.8.

Hình 3.8. Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S. cavourensis YBQ59

Cặn chiết ethyl acetat từ dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59 được
phân đoạn bằng các cột sắc ký lặp lại nhiều lần bằng cột pha đảo gel thường và cột
pha đảo silica gel C18 đã đưa ra các thông số vật lý và dữ liệu phổ MS, NMR của các
hợp chất của chủng S. cavourensis YBQ59 để thu được 8 hợp chất sinh học: 1monolinolein – M2B5.1 (1), bafilomycin D - M2B5.0 (2), nonactic acid - M2B9.8
(3), daidzein - M2B8.3 (4), 3′-hydroxydaidzein - M2B7.5 (5), 5,11-epoxy-10cadinanol - M2B3.8 (6), prelactone B - M2B3.8 (7) và daucosterol - M2B6.17 (8) đã

được phân lập (Hình 3.8).
* Hợp chất 1-monolinolein – M2B5.1 (1)
O
3
HO

O

7'

5'

3'

1
2

9'

12'

10'

13'

15'

17'

1'

2'

4'

6'

8'

11'

14'

16'

OH

Hình 3.9. Cấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein B (1) (C21H38O4)

18'


17
Hợp chất M2B5.1 thu được dưới dạng chất dạng dầu vàng. Phổ 1H NMR trên
vùng trường mạnh xuất hiện tín hiệu của một nhóm methyl tại δH 1,37 (3H, t, J = 1,5
Hz, H-18′), dịch về vùng trường yếu hơn xuất hiện 5 tín hiệu proton của các nhóm
oxymethine và oxy methylene tại δH 3,70 (1H, m, Hb-3); 3,83 (1H, d, J = 7,5 Hz, Ha3); 3,93 (1H, t, J = 4,0 Hz, Ha-1); 4,15 (1H, dd, J = 6,0; 11,5 Hz, H-2); 4,21 (1H, dd,
J = 4,5; 11,5 Hz, Hb-1). Trên vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của 4 proton olefin
trong khoảng 5,32 → 5,38 (4H, m, H-9′, H-10′, H-12′, H-13′). Trên phổ 13C NMR kết
hợp phổ DEPT cho thấy hợp chất chứa 21 nguyên tử carbon trong đó trên vùng
trường trung bình xuất hiện 3 tín hiệu δC 65,1 (C-1); 70,2 (C-2); 63,3 (C-3) gợi ý cho

thấy hợp chất chứa dẫn xuất một phân tử glycerol. Còn lại là 18 nguyên tử carbon
gồm 1 nhóm carbonyl, 4 nhóm methine, 12 nhóm methylene và 1 nhóm methyl. Kết
quả phân tích ESI-MS của hợp chất cho thấy có một ion phân tử tại m/z = 377,2 [M +
Na]+. Hợp chất này được đặc trưng bởi một ester của glycerol và acid béo không no
nhiều nối đôi bằng cách so sánh dữ liệu của MS và NMR với các công bố khác. Từ
những phân tích này và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo kết luận được hợp chất
M2B5.1 là glyxerilin linoleate hoặc 1-monolinolein (1) (Hình 3.9)
(Tuntiwachwuttikul và cs., 2004). Hợp chất 1-monolinolein trước đây đã được tìm
thấy ở một loài Streptomyces khác và nó có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sự nhân
lên của virut gây bệnh dịch tả ở lợn (Sola và cs., 1986).
* Hợp chất bafilomycin D - M2B5.0 (2)
HO

O

O

OH

O

8
9

11
10

O

OH

14

O

15

H

16

18
17

20
19

O

8

21

13
12

O
1

1

3

5

HO

O

2
4

6
7

23

OH

O

OH
25

15

25

22

24

24

O

H

Hình 3.10. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2)
(C35H56O8)

Hợp chất M2B5.0 thu được dưới dạng bột màu vàng. Ở phổ 1H NMR (500 MHz,
CDCl3) cho 29 tín hiệu, trong đó vùng trường yếu xuất hiện 7 tín hiệu của proton
olefin tại δH 5,18 (1H, dd, J = 9,0; 15,0 Hz, H-13); 5,74 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5);
5,81 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11); 6,28 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-20); 6,48 (1H, dd, J =
10,5; 15,0 Hz, H-12); 6,64 (1H, s, H-3) và 6,91 (1H, dd, J = 9,0; 15,5 Hz, H-21), dịch
chuyển về vùng trường mạnh hơn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm oxymethine tại δH
3,18 (1H, t, J = 6,0 Hz, H-23); 3,30 (1H, m, H-7); 3,76 (1H, m, H-17); 3,81 (1H, t, J
= 8,0 Hz, H-14), bên cạnh xuất hiện 2 tín hiệu singlet đặc trưng cho nhóm oxymethyl
tại δH 3,22 (3H, s, 14-OCH3) và 3,67 (3H, s, 2-OCH3).


18
Kết hợp trên phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) và phổ HSQC cho thấy hợp chất
cho 35 tín hiệu của carbon. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác chính: 4-CH3
trương tác với C-3; C-4 và C-5; 6-CH3 với C-5; 6 và 7; 8-CH3 với C-8; 10-CH3 với
C-9; C-10 và 11; H-15; 16 với 16-CH3; 18-CH3 với C-17; C-18 và C-19; 22-CH3 với
C-21; C-22 và C-23; 24-CH3 với C-23; C-24 và C-25. Từ những dữ kiện này cho thấy
các nhóm methyl được thế vào các vị trí tại C-4; C-6; C-8; C-10; C-16; C-18; C-22 và
C-24. Ngoài ra còn có các tương tác 2-OCH3 với C-2; 14-OCH3 với C-14 kết luận
được có hai nhóm oxymethyl được thế vào vị trí C-2 và C-14 của hợp chất. Phân tích

phổ ESI-MS cho một ion phân tử tại m/z = 605,2 [M + H]+. Từ những phân phân tích
trên và so sánh với tài liệu tham khảo đã công bố xác định được hợp chất M2B5.0 là
bafilomycin D (2) với công thức phân tử C35H56O8 và khối lượng phân tử M = 604
(Hình 3.10) (Kim và cs., 1993). Như đã đề cập, hợp chất phân lập trước đây từ loài S.
cavourensis cho thấy hoạt tính chống nấm (Xu và cs., 2013; Pan và cs., 2015).
* Hợp chất nonactic acid - M2B9.8 (3)
5

4

HO

1

O

2

6

3

H

O

H

7
8

OH

9

HO
O

H

O

H

OH

Hình 3.11. Cấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4)

Hợp chất M2B9.8 thu được dưới dạng dầu không màu. Phổ 1H NMR (500 MHz,
CD 3 OD) cho 11 tín hiệu vùng trường mạnh xuất hiện hai tín hiệu nhóm methyl tại
δH 1,13 (1H, d, J = 6,5 Hz, 2-CH3); 1,18 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-9), dịch về vùng
trường yếu hơn từ δH 1,57 → 2,47 là những tín hiệu của nhóm methine và nhóm
methylene. Bên cạnh đó xuất hiện 3 tín hiệu của nhóm oxymethine tại δH 3,92 (1H,
m, H-8), 4,01 (1H, m, H-3) và 4,04 (1H, m, H-6). Kết hợp trên phổ 13C NMR và phổ
DEPT cho thấy hợp chất có 10 nguyên tử carbon, trong đó gồm các nhóm: 2 nhóm
methyl, 3 nhóm methylene, 4 nhóm methine và 1 nhóm carboxyl. Trên phổ HMBC
xuất hiện những tương tác chính: 2-CH3 tương tác với C-1; 2 và 3; H-9 với C-7; 8; H8 với C-6; H-5 với C-4; 7. ESI-MS (âm) phân tích xác định một ion phân tử tại m/z =
201,2 [M - H]’. Đồng thời đối chiếu những dữ liệu phổ với tài liệu tham khảo xác
định được hợp chất M2B9.8 là nonactic acid (3) (Hình 3.11) (Huang và cs., 2015).
* Hợp chất daidzein – M2B8.3 (4) (4’,7-dihydroxyisoflavone)

Hợp chất M2B8.3 thu được dưới dạng chất kết tinh màu vàng nhạt. Trên phổ 1H
NMR tại vùng trường yếu xuất hiện tín hiệu của 3 proton vòng thơm tại δH 6,85 (1H,
d, J = 2,0 Hz, H-8); 6,93 (1H, dd, J = 2,0; 9,0 Hz, H-6); 7,97 (1H, d, J = 9,0 Hz , H5) đặc trưng cho hệ vòng thơm ABX, các tín hiệu tại δH 6,81 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz,
H-3′, H-5′); 7,38 (2H, dd, J = 2,0; 6,5 Hz, H-2′, H-6′) đặc trưng cho hệ vòng thơm


19
A2B2. Ngoài ra còn một tín hiệu proton xuất hiện ở vùng trường yếu hơn tại δH 8,27
(1H, s, H-2).
HO

HO

O
8
7

4a

6
5

O

2

8a

4

2'

3
1'

3'

6'

O

4'

5'

O
OH

OH

Hình 3.12. Cấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4)) (C15H10O4)

Trên phổ 13C NMR và phổ HSQC cho thấy hợp chất có tín hiệu của 15 nguyên tử
carbon bao gồm các nhóm: 7 nhóm nguyên tử carbon không chứa hydro (một nhóm
carbonyl tại δC 174,6 (C-4), 8 nhóm methine thơm. Trên phổ HMBC xuất hiện một
số tương tác chính: H-8 tương tác với C-6; C-7; 8a; H-5 với C-7; 8a; H-2 với C-1′; C4; 8a; H-2′ với C-1′; C-4′; C-6′. phân tích hợp chất này ở ESI-MS (cực dương) cho
thấy có một ion phân tử tại m/z = 255,1 [M + H]+. Sự liên kết giữa các dữ liệu 1H
NMR, 13C NMR và ESI-MS và so sánh tài liệu phổ với tài liệu đã công bố cho phép
xác định được hợp chất M2B8.3 là daidzein (4) với công thức phân tử C15H10O4 và
khối lượng phân tử M = 254 (Hình 3.12) (Kanakubo và cs., 2001).

* Hợp chất 3′-hydroxydaidzein - M2B7.5 (5) (3',4',7-Trihydroxyisoflavone)
HO

O
8
7

2

8a
4a

6
5

4

O

2'

3
1'

3'

6'

5'

OH

4'

OH

Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-Hydroxydaidzein (5) (3',4',7Trihydroxyisoflavone) (C15H10O5)

Hợp chất M2B7.5 thu được dưới dạng chất kết tinh màu vàng nhạt. So sánh số
liệu phổ với hợp chất M2B8.3 cho thấy sự giống nhu hầu hết các vị trí trừ sự khác
nhau ở vị trị 3′. Tại vị trí này proton bị thế bởi nhóm OH nên vòng B có hệ vòng
thơm là ABX. Số liệu phổ khối cũng cho thấy M2B7.5 có khối lượng phân tử lớn hơn
M2B8.3 16 đơn vị, tương ứng với sự thêm 1 nhóm OH. Tương tự, phân tích 1H
NMR (500 MHz, CDCl3 OD), 13C NMR (125 MHz, CDCl3 OD) và dữ liệu ESI-MS
(tích cực) của hợp chất 5 cho thấy có một ion phân tử ở m/z = 271,0 [M + H]+, cấu
trúc hợp chất M2B7.5 là 3',4',7-trihydroxyisoflavone, hay còn gọi là 3'hydroxydaidzein (5) (Hình 3.13) (Lee và cs., 2014).


20
* Hợp chất 5,11-epoxy-10-cadinanol - M2B3.8 (6)
H

HO

2
1

3
4

HO

10
8

6
7

5

H
11

O

O

12
13

Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2)

Hợp chất M2B3.8 là một dạng chất rắn không màu. Trên phổ 1H NMR tại vùng
trường mạnh xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm methyl tại δH 0,93 (3H, d, J = 7,0 Hz, H14); 1,08 (3H, s, H-13); 1,18 (3H, s, H-15); 1,33 (3H, s, H-12), vùng trường yếu hơn
xuất hiện tín hiệu proton của nhóm oxymethine tại δH 3,49 (1H, dd, J = 5,0, 10,0 Hz,
H-5). Ngoài ra trong vùng trường từ δH 1,24 – 2,17 của các nhóm methine và
methylene. Trên phổ 13C NMR và phổ HSQC cho thấy hợp chất có tín hiệu của 15
nguyên tử carbon bao gồm các nhóm: 2 nhóm nguyên tử carbon không chứa hydro, 5
nhóm methine, 4 nhóm methylene và 4 nhóm methyl. Từ những phân tích trên cho dự
đoạn hợp chất này có khung cadinane. Trên phổ HMBC xuất hiện những tương tác

chính: 4-CH3 tương tác với C-3; C-4; C-5 nên nhóm CH3 được thế vào vị trí C-4; 10CH3 với C-1; C-9; C-10 nên nhóm CH3 được thế vào vị trí C-10; H-12 và H-13 đều
tương tác với C-7; C-11 nên hai nhóm methyl được thế vào vị trí C-11. Trên phổ
ESI-MS xuất hiện tín hiệu ion tại m/z 261,1 [M + Na]+ cho phép dự đoán M2B3.8 có
khối lượng phân tử 238. Hợp chất này được đặc trưng bởi sesquiterpene so với các dữ
liệu quang phổ của nó với các dữ liệu được công bố hợp chất M2B3.8 là 5,11-Epoxy10-cadinanol (6) (Hình 3.14) (Hashimoto và cs., 2003).
* Hợp chất prelactone B - M2B4.3 (7)
Hợp chất M2B4.3 là dạng chất rắn không màu. Trên phổ 1H NMR xuất hiện tín
hiệu 2 nhóm oxymethine tại δH 3,75 (1H, m, H-4); 3,89 (1H, dd, J = 3,0, 10,0 Hz, H6), trên vùng trường mạnh cuất hiện tín hiệu 3 nhóm methyl tại δHH 0,95 (1H, d, J =
7,0 Hz, H-8); 1,08 (1H, d, J = 6,5 Hz , 5-CH3); 1,11 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-9).
8

9
7

10
6

HO

5

1O

4

2
3

O

O

HO

O

Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3)


21
Trên phổ 13C NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất có tín hiệu của 9 nguyên tử
carbon bao gồm các nhóm: 1 nhóm nguyên tử carbon không chứa hydro (nhóm
carbonyl), 4 nhóm methine, 1 nhóm methylene và 3 nhóm methyl. Trên phổ HMBC
xuất hiện các tương tác chính 5-CH3 tương tác với C-4, C-5 và C-6 nên nhóm CH3
thế vào vị trí C-4 của khung lactone, H-8 và H-9 tương tác lên C-6 và C-7 nên nhóm
vị trí C-6 của vòng lactone chứa nhóm thế iso-propyl. So sánh dữ liệu phổ với tài liệu
tham khảo đã công bố cho thấy sự trùng với hợp chất (+)-prelactone B. Trên phổ
ESI-MS xuất hiện tín hiệu ion tại m/z 170.9 [M - H]- cũng khẳng định M2B4.3 có
khối lượng phân tử 172.Vậy xác định được hợp chất M2B4.3 là (+)-prelactone B với
công thức phân tử (+)-prelactone B (7) và khối lượng phân tử M = 172 (Hình 3.15)
(Yadav và cs., 2004). Hợp chất này được biết đến là một chất chuyển hóa sớm trong
quá trình tổng hợp các kháng sinh polyketide và đã được phân lập từ S. griseus,
chủng này được biết đến là sinh tổng hợp nên bafilomycin (Droese và cs., 1993;
Yadav và cs., 2004).
* Hợp chất daucosterol –M2B6.17 (8)
21
22

28

29

18
20

HO

23
12

6'

H

5'

26
16

27

1

O

2

1'

3'

25

17

13
14

9
4'

HO

11

19

HO

24

10

3

2'

O

H

8

15

H

5
7

4
6

OH

Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất M2B6.17: Daucosterol (8) (C35H60O6)

Hợp chất 8 thuộc dạng bột màu trắng. Trên phổ 1H NMR trên vùng trường mạnh
xuất hiện tín hiệu 6 nhóm methyl tại δH 0,66 (3H, s, H-18); 0,81 (6H, d, J = 7,2 Hz,
H-26, H-27); 0,86 (3H, t, J = 6,3 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J = 7,2 Hz, H-21); 0,98 (3H,
s, H-19). Dịch chuyển về vùng trường yếu hơn xuất hiện tín hiệu của các proton phân
tử đường tại δH 3,21 (3H, m, H-2′, H-4′, H-5′); 4,19 (1H, dd, J = 11,5, 6,0 Hz, Ha-6′);
4,42 (1H, d, J = 11,5 Hz, Hb-6′); 4 87 (1H, d, J = 7,8 Hz, H-1′), bên cạnh đó một tín
hiệu proton nhóm oxymethine tại δH 3,55 (1H, m, H-3). Trong khoảng vùng trường
mạnh xuất hiện tín hiệu proton olefin tại δH 5,3 (1H, m, H-6). Từ những phân tích trên
và so sánh với tài liệu tham khảo khẳng định được hợp chất M2B6.17 là βdaucosterol (8), một hợp chất rất phổ biến trong thiên nhiên (Hình 3.16). Hợp chất
này là một glucoside sterol được tìm thấy rộng rãi trong các nguồn tự nhiên (Luo và
cs., 2009). Do thành phần môi trường lên men có chứa bột đậu tương, hoạt chất βdaucosterol được tách chiết là từ thành phần môi trường và không được tách chiết từ
dịch lên men của chủng S. cavourensis YBQ59. Đặc biệt trong nghiên cứu này là các
hợp chất 1-monolinolein (1), nonactic acid (3), daidzein (4), 3′-hydroxydaidzein (5),

5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7) and daucosterol (8) đ được phân lập


22
lần đầu tiên từ loài S. cavourensis. Vì vậy, sự hiện diện của các chất chuyển hóa sinh
học thứ cấp sinh ra bởi S. cavourensis YBQ59 cho thấy chủng S. cavourensis YBQ59
có phổ hoạt động kháng khuẩn rộng.
3.3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tách được từ chủng S. cavourensis
YBQ59

• Hoạt tính kháng VSV kiểm định
Hợp chất daucosterol khá phổ biến trong tự nhiên và đồng thời không thể hiện tác
dụng gây kháng khuẩn và độc tế bào theo các công bố trước đây. Do đó hợp chất này
không được thử tác dụng kháng khuẩn và gây độc tế trong nghiên cứu này. Hợp chất
daucosterol (8) có thể được tách chiết từ thành phần môi trường lên men xạ khuẩn
hoặc từ dịch lên men của chủng xạ khuẩn YBQ59. Do vậy, muốn xác định hợp chất 8
từ nguồn nào thì cần phải có thêm thí nghiệm tách chiết chất từ thành phần lên men
xạ khuẩn có hợp chất này hay là được sinh tổng hợp từ dịch lên men.
Bảng 3.5. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất tinh sạch từ dịch men chủng S.
cavourensis YBQ59
Giá trị MIC50 (µg/mL)
Các hợp chất tinh sạch
MRSA

MRSE

1-Monolinolein (1)

8,5 ± 0,02

14,7e ± 0,05

Bafilomycin D (2)

11,2d,e ± 0,04

30,3c ± 0,08

Nonactic acid (3)

18,6c ± 0,03

23,9d ± 0,07

Daidzein (4)

24,8b ± 0,01

35,2b ± 0,04

3′-Hydroxydaidzein (5)

36,1a ± 0,08

54,2a ± 0,11

5,11-Epoxy-10-cadinanol (6)

0f

0g

Prelactone B (7)

0f

0g

13,3d ± 0,12

11,7f ± 0,21

Azithromycin (đối chứng dương)

e

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c, d, e, f trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
theo đánh giá của Fisher (p <0,05).

Các hợp chất 1-7 được đánh giá về hoạt tính kháng khuẩn trên chủng MRSE và
MRSA bằng phương pháp MIC50 và kháng sinh azithromycin được sử dụng làm đối
chứng dương. Kết quả thể hiện trong Bảng 3.5 trong số các hợp chất tinh sạch từ dịch
lên men chủng S. cavourensis YBQ59 được kiểm tra, 5,11-epoxy-10-cadinanol (6),
prelactone B (7) không có hoạt tính kháng 2 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh
MRSA và MRSE. Các hợp chất 1-5 thể hiện khả năng kháng cả MRSA và MRSE,
trong đó hợp chất 1-monolinolein (1) tác động mạnh đến hai chủng gây bệnh MRSA,


23
MRSE với giá trị MIC50 lần lượt là 8,5 µg/ml, cao hơn so với nồng độ ức chế tối thiểu

của azithromycin (13,33 µg/ml) và 14,7 µg/ml, thấp hơn so với azithromycin (11,7
µg/ml). Bafilomycin D (2) chỉ thể hiện khả năng kháng lại MRSA mạnh với giá trị
MIC50 đạt 11,2 µg/ml. Các chất còn lại, 3’-hydroxydaidzein (5), daidzein (4),
nonactic acid (3) đều có khả năng kháng khuẩn nhưng không cao.

• Hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 1-7 đối với ung thư phổi ở tế bào A549,
dòng tế bào ung thư gan Hep3B và vú MCF7 ở người đã được đánh giá bằng phương
pháp MTT (Bảng 3.6).
Bảng 3.6. Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ chủng S.
cavourensis YBQ59 (IC50, μM)
Giá trị IC50 (µM)
STT

Ký hiệu
Phân đoạn

Hợp chất tinh sạch
Đối chứng

A549

MCF7

Hep3B

100,0b ± 2,83

100,0a ± 2,85

100,0a ± 2,36

1

M2B5.1

1-Monolinolein (1)

3,6b ± 1,05

19,4c ± 2,16

24,7b ± 1,35

2

M2B5.0

Bafilomycin D (2)

6,7b ± 0,31

18,5d ± 1,33

15,6c ± 0,71

3

M2B9.8

Nonactic acid (3)

>100a

>100a

>100a

4

M2B8.3

Daidzein (4)

30,8b ± 1,91

>100a

>100a

5

M2B7.5

3′-Hydroxydaidzein (5)

7,8b ± 1,23

>100a

>100a

M2B3.8

5,11-Epoxy-10cadinanol (6)

65,1a ± 2,12

>100a

>100a

M2B4.3

Prelactone B (7)

15,6b ± 1,02

>100a

>100a

Camtothecin (Đối
chứng dương)

2,4b ± 0,56

36,1b ± 2,94

6

7

18,3c ± 2,32

Ghi chú: Các chữ cái a, b, c trên cùng một cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê
theo đánh giá của Fisher (p <0,05).

Hợp chất 1-monolinolein (1), bafilomycin D (2) và 3'-hydroxydaidzein (5) có hoạt
tính ức chế với dòng tế bào ung thư thử nghiệm A549 với giá trị lần lượt là IC50 là
3,6; 6,7; 7,8 μM. Hoạt tính này có ý nghĩa so với tác nhân chống ung thư là
camptothecin. Hai hợp chất 5,11-epoxy-10-cadinanol (6) và prelactone B (7) chỉ ức
chế dòng tế bào ung thư A549. Hợp chất nonactic acid (3) hoàn toàn không có tác
dụng trên dòng A549 khi thử nghiệm. Trên 2 dòng MCF7 và Hep3B chỉ có hợp chất
bafilomycin D (2) và 1-monolinolein (1) là có tác dụng trung bình với giá trị IC50
trong khoảng 15,6-24,7 μM.