Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Thu thập, tuyển chọn và nghiên cứu quy trình nuôi trồng hai loại nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Mã ngành: 94 20 201
HỒ THỊ THU BA

THU THẬP TU N CHỌN V N HI N C U
QU TR NH NU I TRỒN HAI LOẠI NẤM N
V NẤM D
C LI U HOAN DẠI
TỪ V N THẤT S N AN IAN

Cần Thơ 2019


CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI
HỌC CẦN THƠ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS TS TRẦN NH N D NG
TS B I TH MINH DI U

Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp
trƣờng
Họp tại:……………………………, Trƣờng Đại học Cần Thơ
Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:
1 Trung tâm Học liệu, Trƣờng Đại học Cần Thơ

2. Thƣ viện Quốc gia Việt Nam


DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Hồ Thị Thu Ba, Trần Nhân Dũng, Trịnh Tam Kiệt và
Trƣơng Trần Thuận, 2017 Kết quả nuôi trồng nấm Linh Chi
Tầng Ganoderma applanatum phát hiện ở Tịnh Biên An
Giang Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam,
Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 102-105.
2. Hồ Thị Thu Ba, Trần Nhân Dũng, và Trƣơng Trần
Thuận, 2018 Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn của cao chiết
từ nấm Thƣợng Hoàng (phellinus sp ) hoang dại trên chuột
nhắt trắng Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt
Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 50-53.


CH

N

1

MỞ ĐẦU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Trong các vi sinh vật có ích đƣợc s dụng nhi u, gần
gũi với con ngƣời nhất phải kể đến nấm Nấm là một loài sinh
vật nhân thật không có chất diệp lục, dị dƣ ng Trong hệ thống
phân loại năm giới nấm ếp hàng th ba ngang với th c vật và
động vật Trần Văn M o, 2004) Công nghệ sản uất giống,
nuôi trồng và chế biến nấm hiện nay đƣợc du nhập từ Nhật

Bản, Đài Loan và các nƣớc Châu u Trong quá trình nghiên
c u và triển khai sản uất có s thay đổi để phù hợp với đi u
kiện t nhiên của Việt Nam Nguyễn Hữu Đống và ctv, 2000)
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp, đồng thời có nhi u
đi u kiện cho việc phát triển ngh trồng nấm, đặc biệt là các
tỉnh phía Nam Với yếu tố nguyên liệu, lao động dồi dào và
thời tiết, khí hậu gần nhƣ ổn định quanh năm, nấm có thể đƣợc
cung cấp suốt bốn mùa Trung tâm Unesco phổ biến kiến th c
văn hóa giáo dục cộng đồng, 2004). Ngoài ra, Việt Nam còn là
đất nƣớc nhi u rừng núi với nguồn tài nguyên sinh học đa
dạng Vùng Thất Sơn, An Giang khí hậu mát mẻ quanh năm
với rất nhi u loại nấm ăn và nấm dƣợc liệu có giá trị nhƣng
chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng Đ ng trƣớc việc thay đổi khí
hậu toàn cầu việc bảo tồn nguồn tài nguyên quí giá này là việc
cần phải làm ngay Xuất phát từ những lý do trên, luận án “Thu
thập, tuyển chọn và nghiên c u quy trình nuôi trồng hai loại
nấm ăn và nấm dƣợc liệu hoang dại ở vùng Thất Sơn, An
Giang” đƣợc th c hiện

1


1.2 Mục tiêu
1.2.1 Mục tiêu chung:
Đƣa vào nuôi trồng một loài nấm ăn và một loài nấm
dƣợc liệu thu thập hoang dại ở vùng Thất Sơn, An Giang
1.2.2 Mục tiêu cụ thể:
1) Sƣu tầm một số loài nấm lớn ở vùng Thất Sơn An
Giang, đi u tra mẫu nấm s dụng đƣợc từ ngƣời dân địa
phƣơng, định danh mẫu nấm đƣợc chọn theo hình thái bên ngoài;

(2) Xác định độc tính cấp, phân lập giữ giống nấm trên môi
trƣờng PDA, định danh phân t các loài nấm không ch a độc tính;
(3) Xác định thành phần dinh dƣ ng, dƣợc tính quan
trọng các loài nấm Xác định một số thành phần dƣợc tính quan
trọng trong nấm dƣợc liệu, th nghiệm độc tính bán trƣờng
diễn và tác dụng kháng ung thƣ trên tế bào ung thƣ máu và ung
thƣ đại tr c tràng của loại nấm dƣợc liệu;
4) Nghiên c u quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn
chỉnh một loại nấm ăn và một loại nấm dƣợc liệu đƣợc chọn
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Các loài nấm ăn và nấm dƣợc liệu hoang dại đ đƣợc
ngƣời dân s dụng nhƣng chƣa đƣợc nghiên c u nuôi trồng thu
từ vùng rừng núi Thất Sơn, An Giang.
1.4 Thời gian và địa điểm thí nghiệm
Th c hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 tại
Trƣờng Đại học Cần Thơ
1.5 Những đóng góp mới của luận án
Luận án mang tính mới là nghiên c u v hai loài nấm
hoang dại hiện diện ở địa phƣơng là nấm dai Lentinus
Squarosolus và nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp Trong đó
2


nấm dai là loài nấm ăn mới đƣợc nhân giống nuôi trồng thành
công từ loài nấm hoang dại ngoài thiên nhiên đi u này hƣớng
đến việc từng bƣớc ây d ng thƣơng hiệu nấm ăn thuần chủng
Việt Nam Luận án cũng nuôi trồng thành công nấm Thƣợng
Hoàng là loài nấm dƣợc liệu có giá trị cao không gây độc tính
bán trƣờng diễn trên chuột th nghiệm Đây là loài nấm hoang
dại mới đƣợc thu thập, phân lập và nghiên c u Đặc biệt nấm

Thƣợng Hoàng có khả năng gây c chế s tăng sinh và gây
chết đối với dòng tế bào ung thƣ đại tr c tràng Đi u này h a
hẹn một ý nghĩa to lớn trong việc đi u trị bệnh ung thƣ nói
chung và bệnh ung thƣ đại tr c tràng nói riêng
1.6 Bố cục của luận án
Luận án dài 192 trang, gồm các phần giới thiệu, tổng
quan tài liệu, phƣơng pháp nghiên c u, kết quả thảo luận, kết
luận đ nghị và phụ lục Luận án có 56 bảng, 36 hình và 178 tài
liệu tham khảo

3


Chương 3
PH

N

PHÁP N HI N C U

3.1 Vật liệu thí nghiệm
Giống nấm hoang dại thu thập từ thiên nhiên vùng Thất
Sơn, An Giang.
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Luận án th c hiện 4 nội dung nghiên c u tổng quát
Trong từng nội dung nghiên c u lớn này có các nội dung th c
hiện nhỏ, tƣơng ng với các nội dung chi tiết sẽ đi kèm phƣơng
pháp th c hiện Cụ thể đƣợc trình bày trong phần dƣới đây
3.2.1 Thu thập một số loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất
Sơn An iang. Sau đó tiến hành điều tra khảo sát người

dân địa phương tìm ra các loài nấm sử dụng được và định
danh các loài nấm này
3.2.1.1 Thu thập mẫu nấm lớn
Mục đích: Sƣu tầm trên 20 loài nấm lớn ở vùng rừng
núi Thất Sơn An Giang, lập bộ sƣu tập giống
Định danh sơ bộ d a vào hình thái bên ngoài, với quy
trình cơ bản dành cho đi u tra nấm ngoài thiên nhiên theo
chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam Kiệt, 2012;
Trịnh Tam Kiệt, 2013)
* Chỉ tiêu theo dõi: hình ảnh giá thể nơi phát hiện nấm
lớn; phân loại nhóm nấm thu thập đƣợc (nấm đƣợc ếp vào
một trong bốn nhóm: Nấm ăn, nấm dƣợc liệu, nấm độc và chƣa
biết ếp vào đâu)
3.2.1.2 Điều tra khảo sát các loài nấm người dân đã
từng sử dụng

4


Mục đích: Sơ tuyển các loại nấm mới đ đƣợc ngƣời
dân địa phƣơng s dụng nhƣng chƣa đƣợc nuôi trồng ở Việt
Nam.
3.2.1.3 Định danh theo hình thái các mẫu nấm
Các mẫu nấm thu thập đƣợc định danh hình thái bên
ngoài, với quy trình cơ bản dành cho đi u tra nấm ngoài thiên
nhiên theo chuẩn quốc tế Trịnh Tam Kiệt, 2011; Trịnh Tam
Kiệt, 2012; Trịnh Tam Kiệt, 2013)
3.2.2 Xác định độc tính cấp phân lập và giải trình tự ITS
các loài nấm ăn và nấm dược liệu hoang dại không chứa
độc tính

3.2.2.1 Xác định độc tính cấp các mẫu nấm ăn được
hoặc có giá trị dược liệu được chọn từ người dân địa phương
Quá trình ác định độc tính cấp đƣợc th c hiện theo quy
trình xác định độc tính cấp theo Viện Dƣợc liệu, Bộ Y tế:
Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý của thuốc từ dƣợc
thảo 2006) và d a theo phƣơng pháp ác định độc tính cấp của
thuốc theo Đỗ Trung Đàm (1996). Chọn mẫu không ch a độc
tính tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2.2 Phân lập các giống nấm không chứa độc tính
được chọn
Các mẫu nấm không gây độc tính cấp sẽ đƣợc phân lập
giống và khảo sát hệ sợi trên môi trƣờng thạch PDA - Potato
Dextrose Agar Nguyễn Lân Dũng, 2003).
3.2.2.3 Định danh các mẫu nấm được chọn bằng
phương pháp sinh học phân tử
3.2.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính
độc tính bán trường diễn và thử tác động kháng ung thư
của loài nấm dược liệu trên dòng tế bào ung thư máu và
ung thư đại trực tràng
5


Mục đích: tuyển chọn một loại nấm ăn có giá trị dinh
dƣ ng cao và một loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao Tất cả
các thí nghiệm trong nội dung này đƣợc th c hiện tại Viện Sâm
và Dƣợc liệu Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng của loài
nấm được tuyển chọn
Mục đích: Xác định thành phần dinh dƣ ng có trong
loài nấm đ đƣợc sơ tuyển ở nội dung 2 Qua đó, tuyển chọn

một loại nấm ăn và một loài nấm dƣợc liệu có dinh dƣ ng cao
Cách tiến hành: Định lƣợng các thành phần giá trị hiện
diện trong mẫu b ng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký
lỏng cao áp Xác định hàm lƣợng chất b o, chất đạm, các loại
vitamin A, thành phần amino acid và các khoáng vi lƣợng
can i, sắt, kẽm, kali
3.2.3.2 Xác định hàm lượng dược tính
Mục đích: Xác định thành phần có dƣợc tính trong hai
loài nấm dƣợc liệu đ đƣợc sơ tuyển ở nội dung 2 Qua đó,
tuyển chọn lại một loại nấm dƣợc liệu có dƣợc tính cao
Cách tiến hành: Định lƣợng các thành phần giá trị hiện
diện trong mẫu nhƣ định lƣợng triterpenoid, hàm lƣợng đƣờng
kh đƣờng t do và polysaccharide Chọn ra loại nấm có hàm
lƣợng cao hơn tiến hành đánh giá độc tính bán trƣờng diễn.
3.2.3.3 Đánh giá độc tính bán trường diễn của nấm
Mục tiêu: ác định dòng nấm hoang dại đƣợc tuyển
chọn không có độc tính bán trƣờng diễn để tiếp tục nghiên c u.
Cách tiến hành:
Xác định các chỉ tiêu cơ bản v dinh dƣ ng và dƣợc lý
theo “Phƣơng pháp nghiên c u tác dụng dƣợc lý của thuốc từ
Dƣợc thảo” Viện Dƣợc liệu – Bộ Y Tế, 2006). Tuyển chọn
6


một loại nấm ăn có giá trị dinh dƣ ng cao và một loài nấm
dƣợc liệu có dƣợc tính cao Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn
của loài nấm dƣợc liệu đƣợc tuyển chọn
3.2.3.4 Đánh giá khả năng ức chế sự tăng trưởng tế
bào ung thư của dịch cao chiết nấm
Mục tiêu: ác định khả năng c chế s tăng trƣởng và

gây chết tế bào ung thƣ máu, ung thƣ đại tr c tràng của dịch
cao chiết nấm
Cách tiến hành: thí nghiệm đƣợc tiến hành trên đĩa 96
giếng với các nồng độ khác nhau của dịch cao chiết nấm Đánh
giá theo hình thái tế bào ung thƣ sau khi
lý thuốc; khả năng
sống của tế bào khi đƣợc
lý với các nồng độ khác nhau
3.2.4 Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi trồng hoàn
ch nh 2 chủng nấm đ được tuyển chọn.
Mẫu nấm đƣợc nhân giống cấp I, cấp II, nuôi trồng theo
quy trình của Nguyễn Lân Dũng 2003)
Mục tiêu: Hoàn thiện quy trình nuôi trồng một loài nấm
ăn và một loài nấm dƣợc liệu đƣợc chọn ở trên.
Cách tiến hành: thí nghiệm với các loại môi trƣờng cơ
chất khác nhau để tìm ra môi trƣờng thích hợp cho quá trình
sinh trƣởng, phát triển hệ sợi tơ, hình thành quả thể nhanh nhất
và hiệu quả nhất.
3.2.4.1 Quy trình công nghệ nuôi trồng nấm ăn
a) Thí nghiệm 1: Xác định môi trƣờng cấy chuy n nấm
ăn tốt nhất
Mục đích: chọn đƣợc môi trƣờng cấy chuy n thuần hóa
giống nấm ăn tốt nhất
Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi s lan tơ của giống nấm trên
các môi trƣờng và độ lan tơ trung bình trên các môi trƣờng
7


b ng cách đo độ sâu của s lan tơ cm) theo từng ngày th 3,
th 5, th 7 tính từ ngày cấy chuy n Ghi nhận và so sánh thời

gian lan tơ của giống nấm Chọn môi trƣờng cho tơ nấm lan
nhanh và dày nhất, tiếp tục cho thí nghiệm tiếp theo
b) Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng nhân giống nấm
ăn
Mục đích: Chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống nấm ăn
phù hợp nhất
Chỉ tiêu theo dõi: số ngày lan tơ 50% và 100% của nấm
ăn trên môi trƣờng nhân giống Chọn môi trƣờng cho tơ nấm
lan nhanh và dày nhất
c) Thí nghiệm 3: Chọn môi trƣờng nuôi trồng tốt nhất
Mục đích: tìm ra cơ chất thích hợp để trồng nấm ăn
Chỉ tiêu theo dõi: số ngày lan tơ 50% và 100% của nấm
ăn trên cơ chất nuôi trồng Chọn môi trƣờng cho tơ nấm lan
nhanh và dày nhất
3.2.4.2 Quy trình nuôi trồng nấm dược liệu
a) Thí nghiệm 1: Chọn l a môi trƣờng cấy chuy n
giống tốt nhất
b) Thí nghiệm 2: Khảo sát môi trƣờng nhân giống nấm
dƣợc liệu tốt nhất
c) Thí nghiệm 3: Chọn l a môi trƣờng nuôi trồng nấm
dƣợc liệu tốt nhất
Cả ba thí nghiệm này làm tƣơng t thí nghiệm nấm ăn ở
trên nhƣng môi trƣờng cơ chất có thay đổi có trình bày cụ thể
phần kết quả

8


Chương 4
KẾT QUẢ V THẢO LUẬN

4.1 Thu thập một số loài nấm lớn ở vùng rừng núi Thất Sơn
An iang điều tra khảo sát người dân địa phương tìm ra
các loài nấm sử dụng được định danh các loài nấm này
4.1.1 Thu thập mẫu nấm
Luận án đ thu thập đƣợc 28 mẫu nấm hoang dại tại
vùng Bảy Núi An Giang núi Phú Cƣờng, núi Dài Năm Giếng,
núi K t, núi Cô Tô, núi Nƣớc, núi Dài và núi Cấm) Kết quả,
định danh và phân loại sơ bộ các mẫu nấm này gồm 11 loài
chƣa đƣợc phân nhóm; 7 loài nấm có dƣợc tính; 5 loài nấm ăn
và 5 loài nấm độc Năm loài nấm ăn bao gồm nấm tr ng
Amanita caesarea m số 01), nấm tuyết Tremella fuciformis
m số 09), nấm dai Lentinus squarosolus m số 14); nấm
ngân nhĩ đỏ da cam Tremella cinnabarina m số 18); nấm
tràm Tylopilus felleus m số 19).
Bảy loài nấm có tính
dƣợc gồm nấm lie da cam mỏng Pycnoporus sanguineus (mã
số 02), nấm linh chi da trâu Amauroderma subresinosum (mã
số 05), nấm Vân Chi Trametes sp m số 10), nấm rỉ vàng
Phellenus givus m số 15), Linh Chi Tầng Ganoderma
apllanatum m số 20), Phellenus sp m số 22), và linh chi
đen Amauroderma niger m số 25) Năm loài nấm độc gồm
nấm thuộc chi Scleradermataceae m số 03), hai loài thuộc
chi Amanita m số 04 và m số 06), Chi Leucocoprinus (mã
số 17), Chi Russula emetica m số 23) Các loài nấm chƣa
phân nhóm đƣợc 11 loài) gồm Gymnopilus penetrans m số
07), Lycogala epidendrum m số 08), Mycena niveipes m số
11), Xylaria polymorpha m số 12), chi Thelephora m số
13), Cyathus striatus m số 16), Daldinia concentrica m số
21), Polyporus ciliatus m số 24), Cookeina sinensis m số
26), nấm Mộc Bá Huê chƣa định danh đƣợc m số 27) và chi

Coprinopsis m số 28)
9


4.1.2 Điều tra khảo sát các mẫu nấm được chọn
Trong 28 mẫu nấm hoang dại thu đƣợc khi khảo sát
thông tin từ ngƣời dân địa phƣơng, có năm mẫu nấm có thể ăn
đƣợc hoặc s dụng làm dƣợc liệu nấm Linh Chi Tầng , nấm
Vân Chi, nấm Thƣợng Hoàng, nấm dai và nấm Mộc Bá Huê).
4.1.3 Định danh các loài nấm được chọn theo hình thái
4.1.3.1 Nấm Linh Chi Tầng
Tên địa phƣơng: Linh Chi Tầng Sống trên thân cây, hệ
cơ len lỏi trong mô cây đ chết còn tƣơi, phát hiện ở núi Cấm
Bào t hình tr ng hơi cụt đầu

Hình 4.1: Bào t và Nấm Linh Chi Tầng m số 20)

Linh Chi Tầng là loại nấm có nhi u tầng, quả thể có
hình quạt hay hình tròn, đƣờng kính từ 6-100 cm, dày từ 3-8
cm Nấm không có vỏ bóng trên mặt mũ nấm, không cuống,
màu từ nâu dất đến nâu đen, nâu sẫm, các vân tăng trƣởng
đồng tâm có thể nổi rõ hoặc không tạo thành những mấu lồi gồ
gh trên mặt mũ nấm Nấm hóa gỗ, hóa sừng, sần sùi tạo nên
vẻ cũ kỹ, m p nấm màu đen giống mũ nấm và uốn lƣợn chi u
dày từ 0,5-1 cm.
4.1.3.2 Nấm Vân Chi
Tên địa phƣơng nấm Vân Chi.
Nấm Vân Chi là loại nấm không cuống, phát triển một
bên Khi non quả thể dạng nhi u u lồi tròn, mọc thành dạng
vành với m p tán màu trắng kem Nấm trƣởng thành có dạng

10


quả giả, chất da hóa gỗ Quả thể hình nan quạt có nhi u vân
đồng tâm, chồng chất en kẽ nhau nhƣ ngói lợp, mũ nấm
mỏng, phẳng hoặc hơi quăn hình bán nguyệt, mọc thành cụm
kích thƣớc 40-50 cm Mặt trên tai nấm không có lông, có các
vòng màu trắng đục đồng tâm, thịt nấm màu trắng Mặt dƣới
nấm có các ống nhỏ, các ống này rất nhỏ khoảng 4-5 ống/mm
Miệng ống tròn hay hơi tròn và chƣa thu nhận đƣợc bào t
D a trên đặc điểm hình thái bên ngoài của nấm thấy r ng
chúng có đặc điểm tƣơng đồng với nấm Vân Chi thuộc chi
Trametes đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả trong nấm lớn ở
Việt Nam tập 1

Hình 4.2: Nấm Vân Chi m số 10)

4.1.3.3 Nấm Thượng Hoàng
Tên địa phƣơng: nấm Thƣợng Hoàng

Hình 4.3: Nấm Thƣợng hoàng và bào t

m số 22)

Nấm Thƣợng Hoàng sống trên thân cây cổ thụ còn
sống, ở độ cao khoảng 5 đến 10 m Quả thể không cuống với
nhi u lớp ống, mô và ống màu nâu gỉ sắt, sống đơn độc, dạng
11

thon dài, gỗ m m Mặt trên, nâu sẫm tới đen, có r nh, lớp vỏ
c ng màu nâu đậm tới đen, đôi chút n t nẻ tƣơng đối sâu Mặt
mũ ban đầu phủ một lớp lông măng nhung màu vàng, dần trở
nên sẫm màu hơn từ nâu đen tới đen, có nhi u mấu nhỏ, n t
thành những vùng nhỏ M p mũ từ màu nâu vàng thịt nấm màu
nâu gỉ sắt khi già và màu vàng khi non, thể sinh sản dạng ống,
tầng mới sinh ra trên tầng cũ Bào t hình tròn vách hơi dày
D a trên các đặc điểm ngoài nhận thấy loài này khá tƣơng
đồng với loài Phellinus linteus, loài Phellinus igniarius và
Phellinus lamaensis. Theo mô tả của Trịnh Tam Kiệt 2011) có
thể kết luận đây là một loài thuộc chi Phellinus nhƣng chƣa thể
ác định đƣợc tên loài, tạm thời nhận định loài nấm thu thập
hoang dại m số 22 là loài Phellinus sp.
4.1.3.4 Nấm Dai
Tên địa phƣơng: nấm Xoài
Nấm dai có mũ hình phễu, đƣờng kính 2-15 cm, màu
trắng, ở mặt trên phủ vẩy dạng lông màu nâu sáng Thịt nấm
màu trắng, phiến nấm màu trắng, men dài uống cuống hẹp;
cuống lệch, dài 3-5 cm, màu trắng đục, có phủ vẩy nhƣ mũ,
không có vòng và bao gốc Nấm uất hiện vào tháng 3-11.

Hình 4.4: Nấm Dai m số 14) và bào t

Nấm này mọc từng cây riêng lẻ hay thành cụm lớn trên
thân cây gỗ hay trên cây oài mục Khi nấm còn non ăn m m,
12


ngọt Khi nấm già thì ăn dai nên thƣờng chỉ nấu lấy nƣớc làm
canh ăn Bào t nấm có dạng hình que D a vào những đặc

điểm v hình thái quả thể của nấm mọc tại núi Cấm, thấy r ng
chúng có đặc điểm tƣơng đồng với loại nấm dai Lentinus
squarosolus đƣợc Trịnh Tam Kiệt 2011) mô tả trong Nấm lớn
ở Việt Nam tập 1
4.1.3.5 Nấm Mộc Bá Huê
Tên địa phƣơng: Mộc Bá Huê

Hình 4.5: Nấm Mộc Bá Huê m số 27)

Là loài nấm sống trên rễ cây, thân n m trong đất, có
thân đƣa lên, ung quanh là những quả thể nấm màu vàng nghệ
hình trái tim, trên những quả thể có những chấm màu đen nhƣ
hạt cát, từ thân nấm mọc ra rễ cũng màu vàng nghệ, chƣa thu
nhận đƣợc bào t Đây là loài nấm khá mới chƣa có tác giả nào
mô tả v hình thái bên ngoài cũng nhƣ định danh
4.2 Xác định độc tính cấp phân lập giữ giống nấm trên môi
trường PDA định danh phân tử các loài nấm không chứa
độc tính
4.2.1 Xác định độc tính cấp các mẫu nấm có giá trị được
chọn từ người dân địa phương
Sau 72 giờ th nghiệm li u tối đa, cả cao chiết nƣớc và
cao chiết cồn đ u không gây chết chuột Li u s dụng đối với
từng loại cao chiết trên từng loại nấm nhƣ bảng sau:
Bảng 4.1: Tổng hợp liều tối đa cho chuột uống cao các loại nấm
13


Tên nấm

Dmax(g)

g nấm khô/kg thể trọng chuột

Cao chiết nƣớc

Cao chiết cồn

Cao chiết nƣớc

Cao chiết cồn

Linh chi tầng

23,41

28,66

137,7

391,9

Thƣợng hoàng

22,86

27,97

134,5

383,4

Vân chi

23,42

28,80

132,9

388,2

Nâm Dai

23,51

29,72

111,1

338,9

Mộc bá huê

23,26

29,27

111,3

332,1

Tiếp tục theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi dùng cao
chiết, không ghi nhận đƣợc triệu ch ng bất thƣờng nào, cho
thấy các loài nấm không gây độc tính cấp trên chuột th
nghiệm Các mẫu nấm này đƣợc phân lập để giữ giống.
4.2.2 Phân lập các loài nấm được chọn lọc ở nội dung 4.2.1
Môi trƣờng PDA đƣợc s dụng để phân lập các loại
nấm thu đƣợc với cùng đi u kiện nhiệt độ và thời gian Kết quả
cho thấy môi trƣờng PDA thích hợp để phân lập nấm Linh Chi
Tầng, Thƣợng Hoàng, Vân Chi và nấm Dai nhƣng không phù
hợp để phân lập nấm Mộc Bá Huê. Sau đó, tiến hành giải trình
t ITS để định danh 4 loài nấm phân lập đƣợc
4.2.3

iải trình tự ITS xác định loài
4.2.3.1 Nấm Vân Chi

Đoạn gen giải trình t dài 666 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng
93% với một số loài trong chi Trametes trên cơ sở dữ liệu
NCBI. Cùng với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012).
Bƣớc đầu đánh giá mẫu nấm thu thập đƣợc thuộc chi Trametes.
4.2.3.2 Nấm Dai
Đoạn gen giải trình t dài 567 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng
96% với loài Lentinus squarrosulus trên cơ sở dữ liệu NCBI.
14


Cùng với mô tả hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) mẫu nấm
có thể Lentinus squarrosulus.
4.2.3.3 Linh Chi Tầng

Đoạn gen giải trình t dài 631 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng
97%, với loài Ganoderma applanatum. Kết hợp với mô tả hình
thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012) có thể mẫu nấm này là
Ganoderma applanatum.
4.2.3.4 Nấm Thượng Hoàng
Đoạn gen giải trình t dài 653 bps, có tỷ lệ tƣơng đồng
92%, độ phủ 91% với loài Phellinus linteus trên cơ sở dữ liệu
NCBI. Cùng với đánh giá hình thái theo Trịnh Tam Kiệt 2012)
có thể tạm thời kết luận đây là một loài thuộc chi Phellinus.
Tạm thời gọi tên là Phellinus sp.
Qua hai nội dung nghiên c u lớn, bốn loài nấm đƣợc
chọn để tiếp tục tiến hành nghiên c u là nấm dai Lentinus
squarrosolus, nấm Linh Chi Tầng Ganoderma applanatum,
nấm Thƣợng Hoàng Phellinus sp. và nấm Mộc Bá Huê.
4.3 Xác định thành phần dinh dưỡng dược tính độc tính
bán trường diễn và thử tác động kháng ung thư của loài
nấm dược liệu trên dòng tê bào ung thư máu và ung thư đại
trực tràng
4.3.1 Xác định thành phần dinh dưỡng và dược tính các
loài nấm được tuyển chọn
Bảng tổng hợp thành phần các chất dinh dƣ ng có trong nấm b ng
sắc ký lỏng cao áp đƣợc tổng hợp trong bảng sau:

15


Bảng 4.2: Thành phần dinh dưỡng và dược tính các loài nấm
Thành phần

% hàm lƣợng ác

định /kg nấm

Tên loài nấm
Mộc bá
huê

Nấm dai

Thƣợng
hoàng

Linh chi
tầng

Béo

7,01

vết

Không xác
định

Không
ác định

mg/kg

Protein

0,79

0,75

Không xác
định

Không
ác định

mg/kg

4Hydroxyprolin

193

Không phát
hiện

376

186

mg/kg

Acid aspartic

624

695

2510

891

mg/kg

Acid glutamic

759

693

1780

767

mg/kg

Alanin

68,8

72,8

1460

623

mg/kg

Cystine

1470

Không phát
hiện

355

338

mg/kg

Glycin

419

331

1810

566

mg/kg

Histidin

176

169

520

259

mg/kg

Isoleucin

106

113

829

421

mg/kg

Leucin

439

432

1480

671

mg/kg

Lysin

172

309

540

349

mg/kg

Methionine

237

262

Không phát
hiện

103

mg/kg

Phenylalanin

244

245

658

470

mg/kg

Prolin

649

495

1470

550

mg/kg

Serin

245

313

1550

623

mg/kg

Threonin

507

537

1610

563

mg/kg

Tyrosin

117

165

158

193

mg/kg

Valin

298

248

1190

494

mg/kg

16


Tro tổng

3,31

0,28

5,78

2,20

mg/kg

Canxi

216

602

5370

2060

mg/kg

Sắt

312

13,5

1650

2210

mg/kg

Kali

3880

255

Không xác
định

Không
ác định

mg/kg

Kẽm

20,8

23,4

25,9

36,4

mg/kg

Vitamin A

Không
xác
định

Không xác
định

1,04

0,91

mg/kg

4.3.2 Xác định thành phần dược tính có trong hai mẫu nấm

Linh Chi Tầng và Thượng Hoàng
Bảng 4.3. Thành phần dược tính của hai loài nấm dược liệu
Mẫu
nấm

Linh chi
tầng
Thƣợng
hoàng

Hàm lƣợng
triterpenoid
có trong mẫu
(%)

Hàm lƣợng
polysaccharid
có trong mẫu
(%)

Hàm lƣợng
đƣờng t do
trung bình
(%)

1,10

0,46

29,42

2,11

4,0

40,17

Hàm lƣợng
đƣờng kh
trung bình
(%)
22,07
57,14

Khi so sánh một số giá trị dƣợc tính kết hợp bảng đánh giá
thành phần dinh dƣ ng Bảng 4 2) hiện diện trong mẫu nghiên
c u có thể chọn nấm Dai và Thƣợng Hoàng để tiến hành các
thí nghiệm tiếp theo
4.3.3 Xác định độc tính bán trường diễn nấm Thượng Hoàng
Chuột đƣợc th nghiệm là chuột đ c và chuột cái, 6
tuần tuổi Chuột đƣợc cho uống cao nấm Thƣợng Hoàng với
li u 0,4 g/kg mỗi ngày, liên tục trong 1 tháng
Thể trọng của chuột ở lô ch ng và lô uống cao nấm
Thƣợng Hoàng tăng so với trƣớc th nghiệm; đồng thời, không
có s khác biệt v s tăng trọng lƣợng cơ thể giữa hai lô, cho
17


thấy cao nấm Thƣợng Hoàng không ảnh hƣởng đến s phát
triển của chuột trong thời gian cho uống

Các thông số huyết học đƣợc so sánh ở cả hai nhóm
chuột bao gồm: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, công th c
bạch cầu, tiểu cầu, các chỉ số liên quan đến hồng cầu nhƣ
MCV, MCH, MCHC, RDW), thông số thuộc ch c năng gan
GOT, GPT), protein toàn phần, triglyceride, thông số thuộc
ch c năng thận creatinin, urea), khảo sát vi thể gan và thận
Kết quả cho thấy, các thông số v huyết học, chỉ số sinh
hóa thuộc v ch c năng gan - thận n m trong giới hạn bình
thƣờng ở cả hai lô chuột
Kết quả giải phẫu vi thể mô gan, mô thận ở cả hai lô
chuột đ u không ghi nhận đƣợc s bất thƣờng
4.3.4 Xác định khả năng tác dụng với tế bào ung thư của
nấm Thượng Hoàng Phellinus sp.
Sau 72 giờ tiếp úc với dịch cao chiết của nấm thƣợng
hoàng Phellinus sp., tế bào ung thƣ máu dòng K562 không có
thể hiện đáp ng Nồng độ cao chiết đƣợc s dụng trong thí
nghiệm lần lƣợt là 5000 µg/ml; 2500 µg/ml, 1250 µg/ml; 625
µg/ml; 312 µg/ml; 156 µg/ml và 78 µg/ml Ở tất cả các nồng
độ cao chiết s dụng, tế bào ung thƣ máu gần nhƣ vẫn phát
triển bình thƣờng nhƣ nhóm đối ch ng
Đối với tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116, sau 72
giờ tiếp úc với dịch cao chiết của nấm thƣợng hoàng
Phellinus sp., tế bào ung thƣ đại tr c tràng HCT116 đ có
những biểu hiện bị c chế s sống Kết quả cho thấy hiệu quả
c chế rõ rệt ngay ở nồng độ 16 µg/mL Từ nồng độ 250
µg/mL trở lên thấy đƣợc s c chế gia tăng rõ rệt Độ hợp dòng
của tế bào HTC116 khi
lý với cao chiết Phellinus sp. 16
µg/mL; 31 µg/mL; 62,5 µg/mL; 125 µg/mL; 250 µg/mL; 500
18

µg/mL và 1000 µg/mL lần lƣợt là 50%, 40%, 45%, 40%, 20%,
15% và 10%.
Các kết quả thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với nghiên
c u của các tác giả khác trên dòng tế bào ung thƣ máu và ung
thƣ đại tr c tràng Alla,2010; Ji Hun, 2015) Tùy từng loại tế
bào khác nhau mà biểu hiện thay đổi khác nhau, s thay đổi do
cao chiết do Phellinus sp tác động có thể gây apoptosis
trƣờng hợp HCT116) hoặc hỗ trợ gây apoptosis ở các tế
bào trƣờng hợp K562).

Hình 4.6: Đáp ng của dòng tế bào K562 đối với cao chiết của
Phellinus sp Quan sát trên kính hiển vi đảo ngƣợc độ phóng đại
10X. a) tế bào K562, b) đĩa ch a tế bào K562 thêm CCPL nồng độ
500 µg/mL, c) thêm CCPL nồng độ 250 µg/mL, d) nồng độ 125
µg/mL, e) nồng độ 61,5 µg/mL

19


Hình 4.7: Đáp ng của HCT 116 với cao chiết Phellinus sp dƣới
kính hiển vi đảo ngƣợc, độ phóng đại 10X. a) đối ch ng b) HCT 116
thêm CCPL nồng độ 16 µg/mL c) nồng độ 31 µg/mL d) nồng độ
62,5 µg/mL e nồng độ 125 µg/mL f) nồng độ 250 µg/mL g) nồng
độ 500 µg/mL h) nồng độ 1000 µg/mL.

4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu quy trình công nghệ nuôi trồng
hoàn ch nh 2 chủng nấm đ được tuyển chọn
Trên môi trƣờng cấy chuy n, số liệu đƣợc ghi nhận

b ng cách đo độ lan tơ cm) sau 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày trên
môi trƣờng ống thạch nghiêng Đối với môi trƣờng nhân giống
và môi trƣờng nuôi trồng sẽ ghi nhận số ngày tơ lan 50% và
100% ở cả hai loài trên. Số liệu đo đƣợc đƣợc
lý b ng phần
20


m m SAS 9 1 3 và kết quả trung bình đƣợc thể hiện trong các
bảng b ng phƣơng pháp DUNCAN với độ tin cậy 95%
4.4.1 Nghiên cứu quy trình trồng nấm dai L. squarrosolus
Môi trƣờng PDD PDA bổ sung nƣớc dừa) đƣợc chọn
để cấy chuy n nấm Dai.
Môi trƣờng hạt lúa – cám gạo 5% là phù hợp cho tơ
nấm Dai phát triển
Môi trƣờng mùn cƣa bổ sung bột bắp 5% và cám gạo
5% có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 70 ngày
Sau những thí nghiệm trên tổng hợp qui trình nuôi
trồng và thuần hóa nấm dai L. squarrosolus hoang dại nhƣ sau:

Hình 4.8: Qui trình nuôi trồng nấm dai Lentinus
squarrosolus.
21


4.4.2 Nghiên cứu quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng
Phellinus sp.
Môi trƣờng PDA là môi trƣờng để nhân giống cấp 1
nấm Thƣợng Hoàng.
Môi trƣờng hạt lúa bổ sung 5% cám là môi trƣờng đƣợc

l a chọn để nhân giống cấp 2 nấm Thƣợng Hoàng.
Môi trƣờng mùn cƣa bổ sung 5% bột bắp và 5% cám
gạo có số ngày lan tơ nhanh nhất, đạt khoảng 50 ngày và 70
ngày sau ra quả thể.
Sau quá trình nghiên c u, qui trình nuôi trồng và thuần
hóa giống Thƣợng Hoàng Phellinus sp. hoang dại nhƣ sau:

Hình 4.9: Quy trình nhân giống nấm Thượng Hoàng
(Phellinus sp.)
22