Nano bạc trong khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro cây hoa cúc (Chrysanthemum morifolium Ramat cv. Jimba)

Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 505-513, 2017

NANO BẠC TRONG KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
CÂY HOA CÚC (CHRYSANTHEMUM MORIFOLIUM RAMAT CV. JIMBA)

IN

VITRO

Dương Tấn Nhựt1, *, Hoàng Thanh Tùng1, 2, Lương Thiện Nghĩa1, Nguyễn Duy Anh1, Nguyễn Phúc
Huy1, Nguyễn Bá Nam1, Vũ Quốc Luận1, Vũ Thị Hiền1
1
2

Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế

*

Người chịu trách nhiệm liên lạc. E-mail:
Ngày nhận bài: 20.10.2016
Ngày nhận đăng: 09.12.2016

TÓM TẮT
Phương pháp nhân giống in vitro được chứng minh là phương pháp hữu hiệu để nhân giống cây trồng
với số lượng lớn trong thời gian ngắn và trở thành một công cụ hữu hiệu cho công tác chọn, tạo giống cây
trồng. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn những tồn tại mà nổi bật lên là vấn đề nhiễm vi sinh vật trong
quá trình nuôi cấy, chúng làm giảm chất lượng, tăng khả năng mất nguồn giống. Khử trùng môi trường nuôi
cấy là vấn đề bắt buộc đối với quá trình vi nhân giống, đây là giai đoạn tiêu tốn nhiều điện năng và trải qua
nhiều công đoạn. Bên cạnh đó, việc hấp khử trùng môi trường trong một thời gian làm giảm hoạt tính của các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng như thành phần dinh dưỡng của môi trường. Nghiên cứu này hướng

đến việc ứng dụng nano bạc như một biện pháp thay thế cho phương pháp khử trùng môi trường truyền
thống. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bổ sung các nồng độ khác nhau của nano bạc (0 - 5 ppm), đường (0 30 g/l) và than hoạt tính (0 - 1g/l) vào môi trường nuôi cấy in vitro cây hoa cúc và không hấp khử trùng môi
trường nhằm đánh giá khả năng tiệt trùng môi trường cũng như cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Kết quả ghi nhận được cho thấy, bổ sung 4 ppm nano bạc, không bổ sung than hoạt tính và nồng độ đường từ
0 - 20 g/l vào môi trường nuôi cấy không cấy mẫu cho hiệu quả khử trùng 100% sau 4 tuần. Cây cúc cho sự
sinh trưởng và phát triển tốt trong môi trường bổ sung 4 ppm nano bạc, 20 g/l đường, 5 g/l agar và không hấp
khử trùng.
Từ khóa: đường, khử trùng, nano bạc, than hoạt tính, vi nhân giống, vi sinh vật

MỞ ĐẦU
Hiện nay, nuôi cấy mô, tế bào và cơ quan thực
vật đã được ứng dụng rất rộng rãi để nhân giống một
số loài cây có giá trị kinh tế, khó nhân giống cũng
như là công cụ để ứng dụng trong nghiên cứu cơ bản
của công nghệ sinh học thực vật (Gamborg, 2002).
Vi nhân giống được chứng minh là phương pháp có
hiệu quả trong nhân nhanh số lượng cây giống trong
thời gian ngắn, có thể sản xuất cây giống sạch bệnh
và có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp. Bên cạnh
một số thuận lợi thì phương pháp này vẫn còn tồn tại
một số hạn chế như khả năng nhiễm vi sinh vật trong
nuôi cấy in vitro (nấm và vi khuẩn), chúng sinh
trưởng và ức chế sự sinh trưởng của thực vật bởi việc
sử dụng dung dịch dinh dưỡng có trong môi trường
nuôi cấy (Cassells, 1991). Ngoài ra, để có môi

trường lí tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của
cây thì yếu tố vô trùng môi trường rất quan trọng.
Chúng ta cần phải khử trùng các bình chứa môi
trường nuôi cấy (thủy tinh hay túi nylon…), nấu môi

trường; sau đó khử trùng môi trường ở 121°C, áp
suất 1 atm và khoảng thời gian từ 20 - 40 phút tùy
theo thể tích môi trường (có thể từ 20 - 80 ml nếu là
môi trường thí nghiệm ở các bình nuôi cấy có thể
tích từ 100 - 500 ml). Việc chuẩn bị môi trường nuôi
cấy phải trải qua nhiều công đoạn không những mất
thời gian, nhân công lao động mà còn tốn chi phí
điện năng cho việc hấp khử trùng môi trường.
Tác động kháng vi sinh vật của nano bạc đã được
chú ý từ rất lâu và ngày nay các hạt nano bạc có kích
thước rất nhỏ (< 20 nm) đã được ứng dụng trong lĩnh
vực y sinh, y dược. Có một vài nghiên cứu tác động
của nano bạc lên thực vật như khử trùng mẫu cấy
505


Dương Tấn Nhựt et al.
(Mahna et al., 2013), tỷ lệ nảy mầm của một số loài
thực vật (Rezvani et al., 2012), sinh lý cũng như
hình thái của thực vật (Syu et al., 2014). Cho đến
nay, chưa có bất kỳ công bố nào tập trung nghiên
cứu tác động của nano bạc lên khả năng khử trùng
môi trường nuôi cấy in vitro. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi bổ sung nano bạc vào môi trường nuôi cấy
in vitro cây hoa cúc và không hấp khử trùng nhằm
đánh giá khả năng tiệt trùng môi trường cũng như
cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của cây.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Vật liệu
Thực vật

Nguồn mẫu được sử dụng trong thí nghiệm là
các chồi in vitro (1,5 cm) của cây cúc trắng
(Chrysanthemum morifolium Ramat cv. Jimba) 1
tháng tuổi hiện có tại phòng Sinh học phân tử và
Chọn tạo giống cây trồng (Viện Nghiên cứu Khoa
học Tây Nguyên).
Dung dịch nano bạc
Các hạt nano bạc có kích thước trung bình ≤ 20
nm được thiết lập theo tỷ lệ: AgNO3: 750 - 1000
ppm, β-chitozan: 250 - 300 ppm, NaBH4: 200 ppm,
tỷ lệ mol NaBH4/AgNO3: ¼ và với tốc độ nhỏ
giọt của NaBH4 là 10 - 12 giọt/phút (Chau et al.,
2008).
Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong các thí
nghiệm là MS (Muraghige, Skoog, 1962) có hoặc
không bổ sung đường, than hoạt tính và bổ sung
nồng độ nano bạc khác nhau. Tất cả các môi trường
nuôi cấy được điều chỉnh về pH = 5,8; đun sôi để
hòa tan các chất khoáng với nhau.
Phương pháp nghiên cứu
Khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy không
cấy mẫu in vitro
Bổ sung nano bạc vào môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy MS bổ sung nồng độ khác
nhau của nano bạc (0, 1, 2, 3, 4 và 5 ppm) và không
bổ sung đường cũng như than hoạt tính. Đun môi
trường khoảng 4 phút cho đến lúc sôi trào lên; sau
đó, rót 40 ml môi trường vào bình thủy tinh loại 250
ml và đậy nắp bình để thu nhận số liệu về tỷ lệ

nhiễm của môi trường nuôi cấy sau 1, 2, 3 và 4 tuần.
506

Bổ sung đường và than hoạt tính
Môi trường nuôi cấy MS bổ sung nồng độ nano
bạc tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với các nồng độ
khác nhau của đường (0, 10, 20 và 30 g/l) và than hoạt
tính (0 và 1 g/l). Sau đó, môi trường được đun sôi và
rót 40 ml môi trường vào bình thủy tinh loại 250 ml
và đậy nắp bình. Môi trường sau khi đông thì có cấy
mẫu và không cấy mẫu để thu nhận số liệu về tỷ lệ
nhiễm của môi trường nuôi cấy sau 1, 2, 3 và 4 tuần.
Quan sát sự biểu hiện của nấm khuẩn trên môi
trường nuôi cấy trên tổng số 30 bình nuôi cấy (3 lần
lặp lại với 10 bình/nghiệm thức). Tỷ lệ nhiễm được
tính dựa trên tỉ số giữa tổng của các bình nuôi cấy bị
nhiễm nấm khuẩn và tổng của tất cả các bình nuôi
cấy của nghiệm thức đó (30 bình).
Khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy có cấy
mẫu in vitro
Thí nghiệm được thiết lập như thí nghiệm bổ
sung đường (S) và than hoạt tính (AC). Môi trường
sau khi rót vào bình thủy tinh 250 ml (chứa 40 ml
môi trường nuôi cấy MS), đậy nắp bình và để ngoài;
sau đó, cấy các mẫu chồi cúc in vitro (1,5 cm) và
tiến hành ghi nhận số liệu về tỷ lệ nhiễm của mẫu
nuôi cấy sau thời gian theo dõi 1, 2, 3 và 4 tuần.
Khả năng tăng trưởng của cây cúc in vitro trên môi
trường không khử trùng
Các mẫu cây sau khi cấy vào bình môi trường

nuôi cấy 4 tuần được ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu
sinh trưởng và phát triển của cây trên môi trường bổ
sung nano bạc, đường và than hoạt tính không hấp
khử trùng.
Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng
của cây cúc in vitro
Môi trường nuôi cấy MS bổ sung nồng độ nano
bạc và đường tối ưu ở thí nghiệm trên kết hợp với
các nồng độ agar khác nhau (3, 4, 5, 6, 7 và 8 g/l).
Môi trường sau khi rót vào bình thủy tinh 250 ml
(chứa 40 ml môi trường), đậy nắp bình và để ngoài;
sau đó, cấy các mẫu chồi cúc in vitro (1,5 cm) và
tiến hành ghi nhận số liệu về các chỉ tiêu sinh trưởng
và phát triển sau 4 tuần nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy
In vitro: điều kiện phòng thí nghiệm với nhiệt độ
25 ± 2°C, quang chu kỳ 16 h/ngày, cường độ chiếu
sáng 40 - 45 µmol.m-2.s-1 của ánh sáng huỳnh quang
và độ ẩm trung bình 55 - 60%.


Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 505-513, 2017
Ex vitro: điều kiện vườn ươm với nhiệt độ 17 27°C, ánh sáng tự nhiên, che phủ 50% sáng trong
tuần đầu và độ ẩm khoảng 70 - 80%.
Xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với 10
bình/nghiệm thức. Tất cả các số liệu sau khi thu thập
ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được xử lý bằng
Microsoft Exel 2010 và phần mềm phân tích thống
kê SPSS 16.0 theo phương pháp Duncan test với P <

0,05 (Duncan, 1995).
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Khử trùng môi trường nuôi cấy không cấy mẫu
Bổ sung nano bạc vào môi trường nuôi cấy
Sau 1, 2, 3 và 4 tuần theo dõi, tỷ lệ nhiễm của
môi trường nuôi cấy in vitro bổ sung các nồng độ

nano bạc khác nhau được ghi nhận ở hình 1.
Sau 1 tuần theo dõi, kết quả cho thấy môi trường
nuôi cấy không bổ sung nano bạc cho tỷ lệ nhiễm
của môi trường là 33,3%; trong khi đó, ở các nghiệm
thức bổ sung nano bạc ở các nồng độ 1, 2, 3, 4 và 5
ppm không ghi nhận được tỷ lệ nhiễm của môi
trường nuôi cấy in vitro (Hình 1).
Đến tuần theo dõi thứ 2, chỉ còn môi trường nuôi
cấy bổ sung 4 và 5 ppm nano bạc là không ghi nhận
được tỷ lệ nhiễm, các nghiệm thức còn lại đều cho tỷ
lệ nhiễm khác nhau từ 20% đến 76,7%. Sau 3 và 4
tuần theo dõi, 2 nghiệm thức bổ sung 4 và 5 ppm
nano bạc vẫn chưa ghi nhận được tỷ lệ nhiễm của
môi trường (Hình 1), các nghiệm thức khác đều cho
tỷ lệ nhiễm rất cao từ 60% - 100%. Từ những kết quả
ghi nhận ở trên, chúng tôi nhận thấy việc bổ sung 4
ppm nano bạc vào môi trường nuôi cấy cho hiệu quả
khử trùng môi trường.

Hình 1. Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro không đường.

Bổ sung đường và than hoạt tính vào môi trường
nuôi cấy

Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng khử trùng
môi trường nuôi cấy in vitro có bổ sung đường ở các
nồng độ khác nhau được ghi nhận sau 1, 2, 3 và 4
tuần nuôi cấy thể hiện ở hình 3. Sau 1 và 2 tuần, kết
quả ghi nhận cho thấy chưa quan sát được các bình
nuôi cấy có tỷ lệ nhiễm ở các nồng độ đường và than
hoạt tính khác. Sang tuần nuôi cấy thứ 3, việc bổ
sung nồng độ đường 0, 10, 20 g/l và không bổ sung
than hoạt tính không ghi nhận được tỷ lệ nhiễm của

bình nuôi cấy. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ đường
lên tới 30 g/l thì kết quả ghi nhận được cho thấy tỷ lệ
nhiễm của môi trường nuôi cấy là 40% (Hình 2).
Khi tăng nồng độ đường trong môi trường nuôi
cấy thì các vi sinh vật có thêm nguồn carbon để sử
dụng và tiếp tục sinh trưởng, có lẽ vì thế mà tỷ lệ
nhiễm của môi trường ở nồng độ 30 g/l lại cao hơn
so với các nồng độ đường từ 0 - 20 g/l. Đến tuần thứ
4, bổ sung nồng độ đường 0, 10, 20 mg/l và không
bổ sung than hoạt tính không ghi nhận được tỷ lệ
nhiễm, các tỷ lệ khác thì tỷ lệ nhiễm tương đương
507


Dương Tấn Nhựt et al.
với số liệu ghi nhận trong tuần thứ 3 (Hình 2).
Trong khi đó, môi trường nuôi cấy bổ sung 30 g/l
đường cho tỷ lệ nhiễm tăng lên đến 60%. Khi môi

trường nuôi cấy bổ sung thêm than hoạt tính, tỷ lệ

nhiễm của môi trường ghi nhận được cũng là khác
nhau (Hình 2).

Hình 2. Khả năng khử trùng môi trường có bổ sung 4 ppm nano bạc và đường ở các nồng độ khác nhau không cấy mẫu.

Sau 1 và 2 tuần nuôi cấy, kết quả chưa ghi nhận
được tỷ lệ nhiễm của môi trường. Đến tuần nuôi cấy
thứ 3, tỷ lệ nhiễm của môi trường có sự khác nhau
khi bổ sung các nồng độ đường khác nhau. Không bổ
sung và bổ sung đường thì tỷ lệ nhiễm là 20%, tăng
nồng độ đường lên 20 - 30 g/l thì tỷ lệ nhiễm tăng từ
40 - 60%. Sau 4 tuần nuôi cấy, tất cả môi trường bổ
sung than hoạt tính (1 g/l) đều ghi nhận tỷ lệ nhiễm
và tăng theo nồng độ của đường bổ sung vào môi
trường nuôi cấy (30 - 80%) (Hình 2). Vì vậy, môi
trường nuôi cấy bổ sung 4 ppm nano bạc, nồng độ
đường từ 0 - 20 g/l và không bổ sung than hoạt tính
cho khả năng khử trùng môi trường là tối ưu hơn so
với các nghiệm thức còn lại.

Khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy có cấy
mẫu in vitro
Ở nghiệm thức cấy mẫu có bổ sung 4 ppm nano
bạc và không bổ sung than hoạt tính, kết quả ghi
nhận cho thấy các bình nuôi cấy bổ sung 0, 10 và 20
g/l đường không có tỷ lệ nhiễm sau 4 tuần nuôi cấy.
Nồng độ đường tăng lên tới 30 g/l thì tỷ lệ nhiễm của
mẫu ghi nhận được từ 10 - 20% sau 2 - 4 tuần nuôi
cấy. Ở nghiệm thức bổ sung than hoạt tính, ngoại trừ
nghiệm thức không bổ sung đường không ghi nhận

tỷ lệ nhiễm, các nghiệm thức còn lại đều ghi nhận tỷ
lệ nhiễm từ 13,3 - 76,7% sau 2 - 4 tuần nuôi cấy
(Hình 3).

Hình 3. Khả năng khử trùng môi trường có bổ sung 4 ppm nano bạc và đường ở các nồng độ khác nhau có cấy mẫu.

508


Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(2): 505-513, 2017
Kết quả ghi nhận được khi cấy mẫu vào môi
trường không khử trùng cũng cho thấy, bổ sung 4
ppm nano bạc, không bổ sung than hoạt tính và bổ
sung 0 - 20 g/l đường cho hiệu quả khử trùng môi
trường là tối ưu so với các nghiệm thức khác và
tương tự với khả năng khử trùng môi trường khi
không cấy mẫu cúc in vitro.

tăng nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy
không hấp khử trùng, sự tăng trưởng của cây cúc
tăng tỷ lệ thuận với với sự gia tăng nồng độ đường
(Hình 4). Kết quả cũng cho thấy có sự khác biệt về
sự sinh trường giữa môi trường không bổ sung than
hoạt tính và có bổ sung 1 g/l (Hình 4). Trên môi
trường có bổ sung nano bạc, than hoạt tính và 30 g/l
đường, sự sinh trưởng của cây cúc tối ưu hơn các
nồng độ đường khác như chiều cao cây (4,63 cm),
chiều dài rễ (1,52 cm) số rễ (9,66 rễ), chiều dài rễ
(3,63 cm), khối lượng tươi (0,324 g), khối lượng khô
(0,026 g) và chỉ số chlorophyll (đo bằng máy SPAD

502, Japan) (39,28) (Bảng 1).

Than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy tham
gia vào một số hoạt động kích thích tăng trưởng của
cây như hấp thụ các chất độc (ethylene) hiện diện
trong môi trường, thúc đẩy tăng trưởng, tạo môi
trường tối cho cây phát triển, tuy nhiên than hoạt tính
cũng hấp thụ các vitamin, các ion kim loại và chất
điều hòa sinh trưởng thực vật (Thomas, 2008). Chính
vì vậy, khi bổ sung 1 g/l than hoạt tính vào môi
trường nuôi cấy nó đã hấp thu nano bạc và làm giảm
tác động của nano bạc lên tỷ lệ nhiễm; kết quả chúng
ta ghi nhận được là tỷ lệ nhiễm tăng khi môi trường
có than hoạt tính.

Tuy nhiên, khi môi trường không hấp khử trùng
có bổ sung đường và than hoạt tính thì tỷ lệ nhiễm
của môi trường sau 4 tuần nuôi cấy là 40 - 75%
(Hình 3). Tỷ lệ nhiễm này là rất cao, nó ảnh hưởng
tới chất lượng cây sống cũng như số lượng cây giống
sạch bệnh còn lại chỉ còn khoảng 20 - 40% khi
chuyển ra vườn ươm. Đối với môi trường không hấp
khử trùng có bổ sung nano bạc và 30 g/l đường,
không bổ sung than hoạt tính thì sự sinh trưởng của
cây cúc cũng tương đối tốt và tương đương với cây
cúc nuôi cấy trên môi trường có bổ sung than hoạt
tính nhưng tỷ lệ nhiễm của mẫu sau 4 tuần nuôi cấy
là 20% cũng ảnh hưởng tới số lượng cây giống sạch
bệnh (Hình 3).

Khả năng tăng trưởng của cây cúc in vitro trên môi
trường không khử trùng
Sự tăng trưởng của cây cúc in vitro nuôi cấy trên
môi trường MS không hấp khử trùng bổ sung 4 ppm
nano bạc và các nồng độ khác nhau của đường và
than hoạt tính được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy cho
thấy có sự khác biệt về sự tăng trưởng giữa các nồng
độ đường và than hoạt tính khác nhau (Bảng 1). Khi

Bảng 1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây cúc trên môi trường MS có bổ sung nano bạc, đường và than hoạt tính.
Nồng
độ
đường
(g/l)

Nồng
độ AC
(g/l)

Chiều
cao
cây
(cm)

Số lá

Chiều
rộng lá
(cm)

Chiều
dài lá
(cm)

Số rễ

Chiều
dài rễ
(cm)

Khối
lượng
tươi cây
(g)

Khối
lượng
khô cây
(g)

SPAD

3,20

d

4,66

bc

0,84

d

1,02

c

0,33

e

0,06

d

0,174

b

0,008

de

26,33

e

3,43

cd

7,00

ab

0,96

cd

1,16

bc

7,00

bc

0,56

d

0,192

b

0,010

d

30,24

cd

20

3,76

bc

7,00

ab

1,13

bc

1,20

b

7,33

abc

2,63

b

0,280

b

0,016

bc

35,67

bc

30

4,38

ab

7,33

a

1,19

bc

1,22

b

8,33

ab

2,73

b

0,298

ab

0,018

bc

37,56

ab

3,66

bcd

3,66

c

1,26

ab

1,33

ab

2,33

d

0,33

d

0,207

b

0,009

de

27,21

de

3,96

bc

5,66

b

1,32

ab

1,37

ab

6,33

bc

1,60

c

0,217

b

0,012

d

32,58

c

4,20

ab

7,00

ab

1,40

a

1,43

ab

7,66

ab

2,90

ab

0,311

b

0,021

b

36,35

abc

4,63

a

7,33

a

1,46

a

1,52

a

9,66

a

3,63

a

0,324

a

0,026

a

39,28

a

0
10

0

0
10
20
30

1

Ghi chú: *Các chữ cái a, b,… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với P < 0,05 trong phép thử Duncan.

509

Dương Tấn Nhựt et al.

Hình 4. Cây cúc nuôi cấy trên môi trường không hấp khử trùng có bổ sung 4 ppm nano bạc và nồng độ khác nhau của
đường và than hoạt tính. a, a’: cây cúc nuôi cấy trên môi trường không bổ sung than hoạt tính; b, b’: cây cúc nuôi cấy trên
môi trường bổ sung 1 g/l than hoạt tính.

Vì vậy, môi trường nuôi cấy bổ sung 4 ppm nano
bạc, 20 g/l đường và không bổ sung than hoạt tính cho
tỷ lệ nhiễm thấp (0%) và sự sinh trưởng của cây cũng
khá tốt là môi trường phù hợp cho sự sinh trưởng của
cây cúc cũng như khả năng tiệt trùng môi trường mà
không cần trải qua giai đoạn hấp khử trùng.
Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy bổ
sung 4 ppm nano bạc cho thấy số rễ và chiều dài rễ
tăng tỷ lệ thuận với sự gia tăng nồng độ đường (Bảng
1). Nghiên cứu trước đây của Dương Tấn Nhựt và
đồng tác giả (2014) cũng chỉ ra rằng nano bạc có tác
dụng tăng khả năng ra rễ cũng như kéo dài rễ.
Cúc là loài rất dễ ra rễ và cho sự sinh trưởng
nhanh trong điều kiện in vitro, chính vì vậy sau 4
tuần nuôi cấy chúng ta có thể ghi nhận số liệu và
chuyển cây ra vườn ươm để tiếp tục theo dõi. Đó là
lý do giải thích vì sao trong nghiên cứu này chúng
tôi chỉ theo dõi tỷ lệ nhiễm của môi trường nuôi cấy
cũng như sự sinh trưởng và phát triển của cây sau 4
tuần nuôi cấy. Khi chuyển ra vườn ươm, sau khoảng
510

1 tuần thích nghi thì cây Cúc cho thấy sự sinh trưởng

và phát triển tốt. Tỷ lệ sống sót của cây cúc được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung nano bạc và 20 g/l
đường là 100% và sự sinh trưởng và phát triển tốt
sau 2 tuần
Nano bạc đã được chứng minh có tính kháng
khuẩn cao, ảnh hưởng tới sinh sản và hô hấp của
thực vật (Abdi et al., 2008; Lok et al., 2007). Theo
nghiên cứu của Mahna và đồng tác giả (2013), nano
bạc có vai trò trong khử trùng mẫu cấy ban đầu như
hạt giống hay chồi cây, kết quả cho thấy nano bạc có
hiệu quả khử trùng lên tới 100% và có thể thay thế
thủy ngân như là một chất khử trùng mẫu.
Trong nuôi cấy mô thực vật, nano bạc không chỉ
có vai trò làm tăng cường khả năng sinh trưởng, phát
triển (chiều dài chồi và rễ, diện tích lá), tăng cường
các quá trình biến dưỡng trong cây (tổng hợp
chlorophyll, tăng hàm lượng carbohydrate, protein
và tổng hợp các enzyme oxy hóa) của cải Brassica
juncea, đậu và ngô (Salama, 2012; Sharma et al.,


Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 505-513, 2017
2012) mà còn tăng cường khả năng hình thành rễ, ức
chế hình thành ethylene ở cây Crocus sativus
(Rezvani et al., 2012).
Trong nghiên cứu này, bổ sung than hoạt tính vào
môi trường nuôi cấy có cấy mẫu thì sự sinh trưởng
và phát triển của cây là rất tốt (Bảng 1 và hình 5).
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng bổ sung than hoạt
tính giúp tăng khả năng phát sinh cơ quan (Park,

Hahn, 2000), gia tăng sự phát triển rễ (Pan, Staden,
1998). Tuy nhiên, khi trong môi trường có bổ sung
than hoạt tính thì tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy lại tăng
lên (Hình 4). Kết quả nghiên cứu về mối tương quan
giữa tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy và sự có mặt của than
hoạt tính trong môi trường nuôi cấy hầu như chưa
được đưa ra bởi các các nghiên cứu trước đây.
Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng
của cây cúc in vitro trên môi trường không hấp
khử trùng
Sau 4 tuần nuôi cấy, các chỉ tiêu về sinh trưởng
và phát triển của cây Cúc được ghi nhận (Bảng 2).

Khi nồng độ agar trong môi trường giảm, chiều dài
rễ tăng dần. Chiều dài rễ tốt nhất ở nghiệm thức bổ
sung 3 g/l agar (4,03 cm), dài hơn nhiều so với đối
chứng (2,57 cm) và ở nghiệm thức bổ sung 8 g/l agar
chiều dài rễ chỉ đạt 2,13 cm (Bảng 2). Agar ở nồng
độ thấp tương ứng với độ cứng của môi trường thấp,
tạo điều kiện cho sự kéo dài rễ. Chiều rộng lá tăng
khi giảm lượng agar trong môi trường và đạt cao
nhất ở nồng độ 5 g/l agar (1,43 cm), sau đó đó giảm
còn 1,13 cm ở nghiệm thức 3 g/l agar.
Do sở hữu tính chất liên kết với các phân tử nước
(H2O) và hấp thu các hợp chất từ môi trường; vì thế,
agar có thể ảnh hưởng đến tính chất vật lý như hạn
chế sự kéo dài rễ và rễ trở nên dày hơn nhờ sự
trương phồng tỏa tròn của tế bào. Khả năng giữ nước
và lượng nước được thể hiện trên bề mặt môi trường
thay đổi tỷ lệ nghịch với nồng độ agar, điều này dẫn

đến chu vi bề mặt rễ liên kết với các phân tử nước ở
dạng lỏng giảm theo (Pierik, 1997). Cameron và
đồng tác giả (1974) chỉ ra rằng cây con Radiate pine
có rễ kéo dài trên môi trường agar, rễ khô héo và hóa
đen khi chuyển ra đất.

Hình 5 Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây cúc in vitro trên môi trường
không hấp khử trùng. a, b: cây cúc sinh trưởng trên môi trường bổ sung nồng độ agar khác nhau (3, 4, 5, 6, 7,
8 g/l).

511


Dương Tấn Nhựt et al.
Bảng 2 Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng và phát triển của cây Cúc in vitro trên môi trường
không khử trùng sau 4 tuần nuôi cấy.

Nồng độ
agar
(g/l)

Chiều
cao cây
(cm)

Số lá

Chiều
rộng lá
(cm)

Chiều
dài rễ
(cm)

Số rễ

ĐC

3,33

a*

8.67

a

1,20

c

12,33

3

2,87

bc

7,67

abc

1,13

c

7,67

c

3,07

ab

6,67

bc

1,40

ab

9,67

bc

5

3,17

ab

6,33

c

1,43

a

6

2,63

cd

7,00

bc

1,27

bc

7

2,47

d

6,67

bc

1,23

c

8

3,00

ab

8,00

ab

1,13

c

4

a

Khối lượng
tươi cây
(g)

Khối lượng
khô cây
(g)

SPAD

2,57

c

0,585

a

0,020

a

36,53

4,03

a

0,275

bc

0,012

b

30,8

a

c

3,23

b

0,275

bc

0,015

b

33,63

abc

10.33

ab

2,40

c

0,366

b

0,016

ab

36.07

a

10.33

ab

2,36

c

0,261

c

0,012

b

32,7

bc

8,33

bc

2,23

c

0,253

c

0,012

b

34,3

ab

9,67

abc

2,13

c

0,267

bc

0,013

b

33.77

abc

Ghi chú: *Các chữ cái a, b,… trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa với P < 0,05 trong phép thử
Duncan.

KẾT LUẬN
Nano bạc có hiệu quả trong việc khử trùng
môi trường nuôi cấy in vitro không hấp khử trùng.
Cây cúc cho sự tăng trưởng tốt khi nuôi cấy trên môi
trường không hấp khử trùng bổ sung 4 ppm nano
bạc, 20 g/l đường và 5 g/l agar.
Lời cảm ơn: Để hoàn thành nghiên cứu này, nhóm
tác giả xin chân thành cảm ơn sự tài trợ kinh phí của
đề tài “Nghiên cứu tác động của hạt nano kim loại
lên khả năng tái sinh, sinh trưởng, phát triển và tích
lũy hoạt chất trong quá trình nhân giống vô tính một
số cây trồng có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam”

thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và
đánh giá an toàn sinh học của các chế phẩm nano
được nghiên cứu trong dự án”, mã số:
VAST.TĐ.NANO.04/15-18.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abdi G, Salehi H, Khosh-khuri M (2008) Nano silver:
Anovel nanomaterial for removal of bacterial
contamination in Valerian (V. officinalis) tissue culture.
Acta Physiol Planta J 30: 709-714.
Cameron RJ, Rook DA (1974) Rooting stem cuttings of
radiata pine: environmental and physiological aspects. New
Zealand J Forest Sci, 298.
Cassells AC (1991) Problems in tissue culture: Culture
contamination. In Debergh PC, Zimmerman RH, eds.
Micropropagation:
technology
and

512

application Springer.
Chau HN, Bang LA, Buu NQ, Dung TTN, Ha HT, Quang
DV (2008) Some results in manufacturing of
nanosilver and investigation of its application for
disinfection. Adv Nat Sci: J Nanosci Nanotechol 9(2): 241248.
Duncan DB (1995) Multiple range and multiple F test.
Biometrics 11: 1-42.
Dương Tấn Nhựt, Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Thị Thanh
Hiền, Lê Kim Cương, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Bá Nam,
Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương,

Nguyễn Hồng Hoàng, Nguyễn Xuân Tuấn, Nguyễn Thanh
Sang, Nguyễn Việt Cường, Đỗ Mạnh Cường, Nguyễn
Hoài Châu, Ngô Quốc Bưu (2014) Khảo sát ảnh hưởng của
nano bạc lên sự sinh trưởng và phát triển của cây cúc, dâu
tây, đồng tiền nuôi cấy in vitro. Tạp chí Công nghệ Sinh
học 12(1): 103-111.
Gamborg OL (2002) Plant tissue culture: Biotechnology
Milestones. In Vitro Cell Dev Biol Plant 38: 84-92.
Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, Tam
PKH, Chiu JF, Che CM (2007) Silver nanoparticles:
Partial oxidation and activities. Biol Inor Chem 12: 527534.
Mahna N, Vahed SZ, Khani S (2013) Plant in vitro culture
goes nano: Nanosilver-Mediated decontamination of ex
vitro Explants. J Nanomed Nanotechol 4: 2.
Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol
Planta 15(3): 473-497.
Pan MJ, Staden VJ (1998) The use of charcoal in in vitro
culture: Review. J Plant Grow Regul 26: 155-163.


Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 505-513, 2017
Park KY, Hahn EJ (2000) Cytokinin, auxin and activated
charcoal
affect
organogenesis
and
anatomical
characteristics of shoot tip culture of Lisianthus (Eustoma
grandiforum Raf Shinn). In Vitro Cell Dev Biol Plant

36(2): 128-132.
Rezvani N, Sorooshzadeh A, Farhadi N (2012) Effect of
nano-silver on growth of saffron in flooding stress. World
Acad Sci Eng Technol 1: 517-522.
Salama, HMH (2012) Effects of silver nanoparticles in some
crop plants, common bean (Phaseolus vulgaris L.) and corn
(Zea mays L.). Inter Res J Biotech 3(10): 190-197.

Sharma P, Bhatt D, Zaidi MG, Saradhi PP, Khanna PK.,
Arora S (2012) Silver nanoparticle-mediated enhancement
in growth and antioxidant status of Brassica juncea. Appl
Biochem Biotech 167: 2225-2233.
Syu YY, Hung JH, Chen JC, Chuang HW (2014) Impacts
of size and shape of silver nanoparticles on Arabidopsis
plant growth and gene expression. Plant Physiol Bioch 83:
57-64.
Thomas TD (2008) The role of activated charcoal in plant
tissue culture. Biotechnol Adv 26(6): 618-631.

STERILIZING
MEDIUM
USING
SILVER
NANOPARTICLES
IN
MICROPROPAGATION OF CHRYSANTHEMUM MORIFOLIUM RAMAT CV. JIMBA
Duong Tan Nhut1, Hoang Thanh Tung1, 2, Luong Thien Nghia1, Nguyen Duy Anh1, Nguyen Phuc Huy1,
Nguyen Ba Nam1, Vu Quoc Luan1, Vu Thi Hien1
1
2

Tay Nguyen Institute for Scientific Research, Vietnam Academy of Science and Technology
Hue University of Sciences, Hue University
SUMMARY
Micropropagation proved to be an effective method for large-scale plant multiplication in a short period
and becomed an effective tool for plant breeding. However, there have been some drawbacks when applying
this method, including microbial contamination which reduces plant quality and leads to losing stockes.
Sterilization of culture media is a compulsory stage in micropagation, which consumes a lot of power and time.
Besides, autoclaved media might reduce the activity of plant growth regulators as well as the nutritional
components. This study aims to investigate effects of nano-silver as an alternative for traditional medium
sterilization method. In this study, the different concentrations of silver nanoparticles (0 - 5 ppm), sucrose (0 30 g/l) and activated charcoal (0 - 1 g/l) were added in non-autoclave in vitro medium to evaluate effectiveness
of medium sterilization and parameter of plant’s growth and development. The results showed that the addition
of 4 ppm silver nanoparticles and 0 - 20 g/l sucrose into free activated charcoal culture medium resulted in a
high disinfection perventage of 100% after 4 weeks. In vitro Chrysanthemum plants grew and developed well
on non-steriliziing medium containing 4 ppm silver nanoparticles, 20 g/l sucrose and 5 g/l agar.
Keywords: activated charcoal, microorganisms, micropropagation, silver nanoparticles, sterilizing, sucrose.

513