Đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (22.49 MB, 72 trang )
Đồ án tốt nghiệp 1
MỞ ĐẦU
Trong những năm cuối cùng của thế kỉ 20, các nhà sinh học đã phát hiện ra
các nhóm sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh. Vi tảo ( Microalgae) là những
sinh vật bậc thấp có trong sự chú ý đó vì chúng không chỉ có những cơ chế
đặc thù mà còn sinh trưởng và phát triển cực kì nhanh. Hàng năm có 200 tỉ tấn
chất hữu cơ được tạo thành trên toàn thế giới, trong số đó 170 180 tỉ tấn là do
tảo tạo thành. Vi tảo chiếm 1/3 sinh khối của thực vật trên trái đất.
Cho đến nay hàng loạt các công nghệ nuôi trồng, thu hoạch, chế biến sinh
khối vi tảo, các loại công nghệ này đang không ngừng được hoàn thiện, hạ giá
thành và nâng cao chất lượng sinh khối, mặt khác sử dụng vi tảo đang được
mở rộng trong các lĩnh vực như dùng làm thức ăn bổ dưỡng cho người và thức
ăn cho động vật, đặc biệt là các ngành nuôi trồng thủy sản, nguồn phân bón
sinh học, năng lượng sạch, các hóa chất trong công nghiệp và dược phẩm, xử
lý môi trường.
Tuy ở nước ta đã có nhiều nghiên cứu về loại tảo này nhưng quy mô ứng
dụng còn chưa rộng. Hiện tại ở Đà Nẵng vẫn chưa có cơ sở nào sản xuất sinh
khối để phục vụ cho các ngành thực phẩm và y học, sở dĩ như thế là do thành
phần môi trường nuôi cấy còn sử dụng quá nhiều hóa chất nên môi trường
nuôi cấy đắt, do đó kém kinh tế dẫn đến chi phí đầu tư cao, các điều kiện để
nuôi cấy cũng chưa tốt nhất và phương pháp thu nhận sinh khối tảo chưa
được triệt để, hiệu quả chưa cao. Ngoài ra, cũng chưa có phương pháp bảo
quản giống tốt trong một thời gian dài để chủ động được nguồn giống để
giảm chi phí sản xuất cho những đợt sau. Trước những lý do như thế chúng tôi
chọn đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thu sinh khối và các
phương pháp thu hoạch, bảo quản tảo Spirulina platensis”. Nhằm mục
đích tìm ra môi trường ít thành phần hóa chất, rẻ tiền, phương pháp thu hoạch
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 2
tốt và các phương pháp bảo quản giống trong một thòi gian dài để chủ động
trong quá trình nuôi cấy và mang lại tính kinh tế.
PHẦN I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đối tượng thí nghiệm
1.1.1. Vai trò, vị trí của tảo Spirulina trong công nghệ sinh học (CNSH)
Công nghệ sinh học là một lĩnh vực công nghệ cao dựa trên nền tảng khoa
học về sự sống, kết hợp với quy trình và thiết bị kỹ thuật nhằm tạo ra các
công nghệ khai thác các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào thực vật và
động vật để sản xuất ở quy mô công nghiệp các sản phẩm sinh học có chất
lượng cao phục vụ cho lợi ích, nhu cầu của con người đồng thời phát triển
kinh tế xã hội và bảo vệ môi trường [30].
Trong tự nhiên vai trò của giới tảo (Algae) nói chung, nhất là tảo biển với
vai trò quang hợp gắn giữ cacbonic đã tạo ra khoảng 500 tỷ tấn chất hữu cơ có
thể sử dụng được (trong đó có nhiều hoạt chất sinh học quý) và thải ra 90%
lượng oxy trong bầu khí quyển cần cho sự hô hấp của người và động vật.
Chính điều này đã kích thích nghề nuôi tảo biển ra đời và đặc biệt xuất hiện
Công nghệ sinh học vi tảo với bộ 3 nổi tiếng là Chlorella, Scenedesmus và
Spirulina, chúng có nhiều giá trị trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và
dược phẩm... Trong 3 nhóm tảo trên thì Spirulina hiện được chọn để phát
triển sản xuất hơn 2 loại kia do 5 ưu thế sau:
Hiệu quả kinh tế cao và góp phần bảo vệ, cải thiện môi trường: Spirulina
không những đơn giản trong nhu cầu dưỡng chất mà còn rất hiệu quả trong sử
dụng năng lượng ánh sáng mặt trời, nước (có thể dùng nước biển, nước lợ,
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 3
nước mặn,...)…, tạo ra 16,8 tấn oxy/năm... Điều này giúp bảo vệ môi trường
khí quyển, giảm hiệu ứng nhà kính (green house).
Giá trị sử dụng đã vượt ra khỏi ranh giới truyền thống là dùng làm thực
phẩm. Theo Thạc sĩ Dược sĩ Lê Văn Lăng, giảng viên Trường Đại học Y
Dược TpHCM, Spirulina là nguồn dinh dưỡng quý của tự nhiên. Nó có đủ các
thành phần thiết yếu: protein lipid glucid cùng khoảng 30 vi lượng và hầu
hết các vitamin cần thiết cho cơ thể, đáp ứng hoàn hảo công thức chuẩn về
chế phẩm dinh dưỡng vi lượng khoáng vitamin do FAO/WHO công bố và là
sản phẩm cải thiện suy dinh dưỡng rất tốt cho trẻ em, người già, người bệnh
sau phẫu thuật... Mặt khác, với các hoạt chất: Phycocyanin, Sulfolipid,
Spirulan, Betacaroten, các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt…) và các vitamin
cần thiết, tảo Spirulina còn có giá trị dược liệu, giúp cơ thể tăng cường miễn
dịch, chống lại bệnh tật. Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị các
bệnh: viêm gan, suy gan, đục thủy tinh thể, suy giảm thị lực, rụng tóc… Song
song đó, tảo Spirulina cũng có tác dụng trong phòng chống một số bệnh ung
thư do các hoạt chất tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, bảo vệ tế bào,
chống đột biến gen. Năm 1996 1997, một nhóm nhà khoa học người Nhật đã
phân lập và xác định cấu trúc một hoạt chất mới trong Spirulina và đặt tên là
Spirulan (CaSp). Các thử nghiệm đã chứng tỏ Ca Sp có tác dụng kháng virus
HIV type 1 và virus Herpes simplex type 1 [31].
Tham gia vào việc xử lý môi trường: ngoài việc cung cấp dưỡng khí oxy,
Spirulina còn có khả năng gắn giữ mạnh các cation độc như chì, thuỷ ngân,
cadimi,... nên chúng có thể dùng để xử lý chất thải lỏng, xử lý nước thải [29].
Spirulina có thể là đối tượng chuyển tải các tiến bộ khoa học kỹ thuật rất
hiện đại trong công nghệ sinh học:
+ Nuôi định hướng thu các chất có lợi cho dinh dưỡng và trị bệnh cho người
và động vật. Đã có các tiến bộ về nuôi cấy Spirulina gắn Iod (phòng trị bệnh
thiếu vi chất iod), gắn Selen, gắn Germani (chất chống oxy hoá, chống lão
hoá, phòng chống ung thư...)v.v... Hoặc nuôi với những tiền chất định hướng
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 4
cho sinh khối Spirulina giàu acid béo cần thiết, giàu betacaroten. Sự thành
công trong tương lai phụ thuộc vào việc chọn giống Spirulina và tìm tòi công
nghệ phù hợp, sẽ cho những lô/mẻ sinh khối Spirulina rất có giá trị trong y
dược.
+ Spirulina với công nghệ chuyển nạp gen: Chuyển nạp gen là kỹ thuật
phân lập gen từ cơ thể cho (donor) cấy ghép vào bộ máy di truyền của cơ thể
nhận (receiver) nhằm tạo ra tính trạng mới cần thiết từ cơ thể đó. Kỹ thuật
tân tiến này đang được nghiên cứu với Spirulina ở 2 hướng sau:
Chuyển gen chịu trách nhiệm di truyền tạo phao khí của Spirulina giúp
vi sinh vật nổi trên mặt nước dễ dàng. Ta biết muốn phòng trừ bệnh sốt rét
phải diệt muỗi Anopheles stopenis, bệnh sốt xuất huyết phải diệt muỗi Aedes
aegypti, bệnh giun chỉ phải diệt muỗi Culex quinquefasciatus. Một cách hiệu
quả cắt đứt vector truyền bệnh này là diệt ấu trùng (bọ gậy, lăng quăng...) của
chúng. Hiện một số nghiên cứu cho thấy có những vi sinh vật, hoặc vi nấm có
thể thực hiện được điều này. Tuy vậy, việc phải sống trôi nổi trên mặt nước
(môi trường ấu trùng các loại muỗi gây bệnh sinh sống) để diệt ấu trùng muỗi
lại là điểm không có hoặc yếu kém của các vi sinh vật này. Do vậy có thể tách
gen di truyền tạo phao khí nổi trên mặt nước của Spirulina ghép vào vi sinh
vật có ích trên, tạo ra những đặc điểm mong muốn diệt ấu trùng muỗi gây
bệnh [1].
Chuyển nạp gen tạo chất dẻo sinh học cho Spirulina: có thể ghép vào
Spirulina gen tạo chất polyhydroxyl butylat (P.H.B), gen này có ở vi khuẩn
Aleutroplus, để tạo ra giống Spirulina mới có đặc tính phát triển sinh khối
nhanh, đồng thời chứa P.H.B với hàm lượng thích hợp. Trích ly chất P.H.B để
sản xuất nhựa thay thế nhựa dẻo (như polystyrene) và chất dẻo mới này dễ bị
phân huỷ không làm ô nhiễm môi trường v.v... [22].
Spirulina tương đối thích nghi với mọi quy mô sản xuất: có thể thu hoạch
từ tự nhiên hoặc nuôi ở quy mô nhỏ (hộ gia đình, làng xã), trong điều kiện bán
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 5
tự nhiên với kỹ thuật đơn giản như nuôi trồng thuỷ sản, và nuôi ở quy mô
công nghiệp [11].
1.1.2. Phân loại học
Mang nhiều tên gọi khác nhau như Spirulina, Arthrospira và là một chủ đề
được thảo luận nhiều từ trước đến nay, nhất là khi cái tên “tảo” được nhắc
đến lần đầu tiên. Năm 1852, việc phân loại học đầu tiên được viết bởi
Stizenberger. Ông đưa ra tên loài mới là Arthrospira dựa vào cấu trúc chứa
vách ngăn, đa bào, dạng xoắn. Gomont đã khẳng định những nghiên cứu của
Stizenberger vào năm 1892, đồng thời Gomont bổ sung thêm loài không có vách
ngăn là Spirulina và loài có vách ngăn là Arthrospira. Như vậy, tên được công
nhận là Arthrospira, nhưng trong những hoạt động khảo sát và nghiên cứu
Arthrospira được gọi là Spirulina, do đó tên Spirulina được sử dụng phổ biến
cho đến nay thay cho tên Arthrospira.
1.1.3. Đặc điểm sinh học của Spirulina
Loài Spirulina (Arthrospira) platensis thuộc[2]:
Chi : Spirulina (Arthrospira)
Họ : Oscillatoriceae
Bộ : Oscillatoriales
Lớp : Cyanophyceae
Ngành : Cyanophyta
Hình 1.1: Tảo Spirullina platensis
1.1.3.1. Đặc điểm hình thái
Tên “Spirulina” xuất phát từ tiếng Latinh “helix” hoặc “spiral” biểu hiện
hình dạng xoắn của nó. Spirulina là tảo đa bào, dạng sợi, sống cộng sinh, các
tế bào được phân biệt bởi vách ngăn, dạng sợi xoắn hình lò xo không phân
nhánh, số vòng xoắn lớn nhất là 6 8 vòng đều nhau. Đường kính xoắn khoảng
35 50 m, bước xoắn là 60 m, chiều dài sợi tảo có thể đạt 250 m. Nhiều
trường hợp Spirulina có kích thước lớn hơn. Các vách ngang chia sợi Spirulina
thành nhiều tế bào riêng rẽ liên kết với nhau bằng cầu liên bào. Sợi tảo
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 6
Spirulina có khả năng chuyển động và tự vận động theo kiểu trượt quanh trục
của sợi [13].
1.1.3.2. Đặc điểm cấu tạo
Tế bào Spirulina có cấu trúc giống với sinh vật Prokaryote thiếu các hạt liên
kết với màng. Thuộc gram âm, thành tế bào nhiều lớp và được bao bọc bởi
màng polysaccharide nhầy. Thành tế bào Spirulina không chứa celulose mà hệ
tiêu hóa con người không phân cắt được. Spirulina có tỷ lệ chuyển hóa quang
hợp khoảng 10% so với chỉ 3% của các thực vật sống trên cạn như đậu nành.
Tế bào tảo Spirulina chưa có nhân điển hình, vùng nhân chỉ là vùng giàu axit
nucleic chưa có màng nhân bao bọc, phân bố trong nguyên sinh chất. Thành tế
bào Spirulina có cấu trúc nhiều lớp, không chứa celulose mà chứa
mucopolyme, pectin và các loại polysacharid khác. Màng tế bào nằm sát ngay
dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylakoid tại một vài điểm.
Spirulina không có lục lạp mà chỉ chứa thylakoid quang hợp nằm rải rác trong
nguyên sinh chất. Màng thylakoid bao quanh các hạt polyphosphat có đường
kính 0,5 1μ thường nằm ở trung tâm tế bào. Sắc tố quang hợp chính là
phycocyanin, bên cạnh đó còn có chlorophyll a. Ngoài ra, tế bào Spirulina
không có không bào thực, chỉ có không bào chứa khí làm chức năng điều chỉnh
tỉ trọng tế bào. Không bào khí có vai trò rất quan trọng trong việc làm cho
Spirulina nổi lên mặt nước [10].
Spirullina là một chi tảo thuộc ngành tảo lam, tế bào Spirulina không có ty
thể và mạng lưới nội chất, tuy nhiên tế bào vẫn có ribosome với hệ số lắng
70S và một số thể vùi như hạt polyphotphat, glycogen, phycocyanin,
cacboxysome và hạt mesosome [10].
Thành tế bào dưới kính hiển vi điện tử hiện lên gồm 4 lớp: từ lớp L 1 đến
L1
L2
L3
L4
lớp L4 (L1, L2, L3, L4). L1 và L3 chứa vật liệu dạng sợi. L2 là một peptidoglycan
giống như ở tế bào vi khuẩn. L4 được sắp xếp chạy theo chiều dọc của trục
sợi Spirulina [4].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Hình 1.2. Lát cắt tế bào Spirulina
Đồ án tốt nghiệp 7
Hình 1.2. cũng cho thấy một vách ngăn đang hình thành, vách ngăn này gồm
ba lớp: L2 kẹp giữa hai L1, có thể hình dung như hình 1.3.
L4
L3
L2
L1
Màng sinh chất
L1 L2 L1
Hình 1.3. Mô hình sắp xếp vách tế bào Spirulina
Lớp L1 và L3 có chức năng vận chuyển điện tử, do đó hai lớp L2 và L4 tập
platensis
trung các điện tử đó. Độ dày của mỗi lớp từ 1015nm, nên độ dày của toàn bộ
thành tế bào là khoảng 40 60nm. Các lớp L1, L3, L4 có độ dày bằng nhau, lớp
L1 lớn hơn [2].
1.1.3.3. Đặc điểm sinh thái
Spirulina là chi tảo lam phân bố rộng trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước
mặn và suối nước nóng. Đây là một trong khoảng 2500 loài cyanophyta cổ
nhất, tự dưỡng đơn giản, có khả năng tổng hợp các chất cần thiết cho cơ thể,
kể cả các đại phân tử phức tạp để xây dựng tế bào và có khả năng cố định
đạm rất cao, chúng không thể sống hoàn toàn trong tối…
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 8
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển tảo Spirulina chịu ảnh hưởng của
các yếu tố môi trường. Những yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, pH và thành
phần dinh dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến quang hợp và sản xuất sinh khối
tế bào mà còn ảnh hưởng tới các hoạt động chuyển hóa của tế bào.
a) Ảnh hưởng của ánh sáng
Ánh sáng là nhân tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến quang hợp của các sinh
vật. Do bản chất tiền nhân của Spirulina nên ánh sáng không ảnh hưởng nhiều
tới quá trình phát triển. Tuy nhiên, Spirulina cũng giống như nhiều loài tảo
khác có khả năng quang tự dưỡng và phụ thuộc vào ánh sáng vì đây là nguồn
năng lượng chính [28].
Hầu hết, các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về đáp ứng của Spirulina
đối với ánh sáng là được thực hiện dưới điều kiện phát triển quang tự dưỡng
bằng việc sử dụng môi trường khoáng và bicarbonate như một nguồn carbon.
Từ các nghiên cứu đó cho thấy sự phát triển của Spirulina trở nên bão hòa ở
cường độ ánh sáng 1µmol m2 s1 khoảng bằng 10 15% lượng ánh sáng mặt
trời ở bước sóng 400 700nm, giá trị này tùy thuộc vào điều kiện phát triển và
mối tương quang giữa chlorophyll và sinh khối [28]. Ngoài ra, cường độ chiếu
sáng còn ảnh hưởng đến các hàm lượng các chất bên trong tế bào tảo. Một số
nghiên cứu đã nhận định rằng khi cường độ chiếu sáng tăng thì hàm lượng của
acid béo (PUFA) giảm [26].
Theo Seshadri & Thomas (1979), sự tác động của ánh sáng tới Spirulina là
bởi hai yếu tố chính đó là thời gian và cường độ chiếu sáng. Quá trình nuôi
cấy ngoài trời thì cường độ ánh sáng tối hảo cho Spirulina trong khoảng 20
30klux. Về thực hành nuôi cấy Spirulina thì cường độ ánh sáng tối ưu là 25
30klux, ở khoảng này hoạt tính quang hợp cao nhất, cần điều chỉnh đạt được
khoảng cường độ chiếu sáng này trong nuôi cấy [11]. Ngoài ra, cường độ ánh
sáng còn phụ thuộc vào mật độ nuôi cấy của tảo, vì khi cường độ ánh sáng
cao mà mật độ tảo lớn thì mỗi sợi tảo vẫn nhận được cường độ ánh sáng nhỏ.
Nhiều loại vi tảo có cường độ quang hợp bão hoà ở khoảng 33% tổng lượng
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 9
cường độ ánh sáng. Vì vậy trong điều kiện ánh sáng có cường độ cao và thời
gian chiếu sáng dài, người ta thấy xuất hiện hiện tượng quang ức chế có thể
làm tảo chết hoặc làm giảm đáng kể năng suất nuôi trồng [1].
Theo Charenkova C.A (1977) thì thời gian chiếu sáng càng dài thì năng suất
tảo Spirulina càng cao. Năng suất tảo đạt cao nhất khi chiếu sáng liên tục.
Như vậy tảo Spirulina không có chu kỳ quang [1].
b) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong khi ánh sáng được xem là nhân tố môi trường quan trọng nhất cho
quang hợp của vi sinh vật thì nhiệt độ là nhân tố cơ bản nhất cho sự sống của
sinh vật. Nhiệt độ ảnh hưởng đến tất cả hoạt động sống của vi sinh vật như
quá trình trao đổi chất, thành phần dinh dưỡng cũng như các đặc tính sinh lý
khác. Nhiệt độ môi trường luôn là một trong những yếu tố nhạy cảm ảnh
hưởng đến bất kỳ sinh vật nào. Nhiệt độ môi trường nuôi là yếu tố cần đáp
ứng liên tục, vì rất dễ bị chi phối và tác động bởi điều kiện xung quanh, mức
độ và thời gian chiếu sáng. Do vậy nhiệt độ là một trong những yếu tố thường
xuyên được theo dõi trong công nghệ nuôi trồng vi tảo [28].
Spirulina phát triển ở nhiệt độ khá cao, chúng có khả năng phát triển mạnh
ở khoảng nhiệt độ 32 400C. Nhiệt độ cực thuận cho nuôi cấy Spirulina là 35
380C. Ở nhiệt độ dưới 250C Spirulina phát triển rất chậm, ở nhiệt độ trên
380C tảo này sẽ chết rất nhanh [21]. Tuy vậy, trong tự nhiên người ta phát
hiện Spirulina ở những suối nước nóng đến 690C.
Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến thành phần sinh hóa của tảo. Theo
một nghiên cứu đã cho thấy rằng: ở nhiệt độ 350C không ảnh hưởng xấu lên
sản xuất sinh khối nhưng lại ảnh hưởng tích cực lên sản xuất protein, lipid và
phenolic. Nhiều chủng khác nhau sẽ phát triển ở các khoảng nhiệt độ khác
nhau [28].
Có một mối liên hệ giữa nhiệt độ và ánh sáng trong quá trình nuôi cấy tảo.
Giống như hai mặt đối lập của một quá trình thống nhất, chúng đều đóng vai
trò quan trọng quyết định đến năng suất và sinh khối của Spirulina. Sinh
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 10
trưởng của tảo đạt cao nhất với một cường độ và thời gian chiếu sáng thích
hợp, kèm theo nó là một chế độ nhiệt tương đối ổn định.
c) Ảnh hưởng của pH
pH môi trường là một trong các nhân tố quan trọng trong nuôi cấy Spirulina.
pH tối ưu cho sự phát triển của chi này là kiềm và kiềm cao. Đây là ưu thế lớn
giúp Spirulina ít bị lây nhiễm bởi các tảo khác [14].
Tuy nhiên, pH là yếu tố nội tại luôn luôn thay đổi, không những do chế độ
chiếu sáng, nhiệt độ hàm lượng các chất dinh dưỡng tạo nên mà còn do tác
động ngược lại của chính trạng thái sinh trưởng của quần thể tảo. Khi tảo
phát triển càng mạnh, pH môi trường bị thay đổi và trở thành yếu tố kìm hãm
cho sự sinh trưởng và phát triển. Do đó, pH môi trường quá cao hay quá thấp
đều làm chậm quá trình sinh trưởng của tảo [20].
Theo Trần Văn Tựa và Nguyễn Hữu Thước (1993) thì pH môi trường từ
8,5 9 là pH tối ưu cho tảo Spirulina sinh trưởng và phát triển. Ở pH này,
nguồn cacbon vô cơ được tảo đồng hóa nhiều nhất. Tuy nhiên ở pH= 10 11
Spirulina vẫn có khả năng phát triển nhưng rất chậm. Một nghiên cứu đã chỉ
ra rằng mặc dù Spirulina là loài tảo sống trong môi trường kiềm nhưng giá trị
pH > 10,3 là có hại cho môi trường nuôi cấy [6].
Vì vậy pH được coi là yếu tố chỉ thị, phản ánh các thành phần nuôi dưỡng
cung cấp cho môi trường nuôi dưỡng tảo, chủ yếu là nguồn bicarbonat và khí
CO2 hoà tan [11].
d) Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng
Spirulina có thể sống trong môi trường tự nhiên đến các môi trường nhân
tạo hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất khoáng cần thiết vào nguồn
nước tự nhiên: nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng
khoan...
Thành phần dinh dưỡng bao gồm cả nguyên tố đa lượng (C, N, P, K, S, Mg,
Na, Cl, Ca và Fe) và nguyên tố vi lượng (Zn, Cu, Ni, Co,W). Tất cả điều ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng của tảo. Trong đó, các nguyên tố vi lượng là thành
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 11
phần bắt buộc hay tác nhân kích thích hoạt động của nhiều hệ enzyme, có tác
dụng thúc đẩy sinh tổng hợp chlorophyll và làm giảm sự phân hủy chlorophyll
nhờ làm tăng độ bền vững của phức hệ liên kết giữa chlorophyll và protein.
Ngoài ra, nhiều nguyên tố vi lượng còn làm tăng khả năng tổng hợp carotenoid
[14]. Các nguyên tố vi lượng thật sự cần thiết cho quá trình sinh trưởng của
tảo, tuy nhiên hàm lượng của chúng trong nước tự nhiên là rất thấp, có thể
không cung cấp đủ cho nhu cầu sinh trưởng của tảo do đó việc bổ sung vi
lượng vào môi trường nuôi cấy là hết sức cần thiết. Trong nuôi cấy tảo, vi
lượng thường được bổ sung với một lượng rất nhỏ vì khi hàm lượng vượt quá
ngưỡng chịu đựng của vi tảo, chúng có khả năng gây độc cho tế bào [20].
1.1.4. Đặc điểm sinh sản
Spirulina có hai hình thức sinh sản đó là sinh sản sinh dưỡng và sinh sản vô
tính. Hình thức sinh sản sinh dưỡng được thực hiện bằng cách gãy từng khúc
của sợi tảo, khúc gãy gọi là khúc tản. Từ một sợi tảo mẹ, hình thành nên
những đoạn Necridia (gồm các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản). Trong các
Necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và sự tách rời tạo các hormogonia
bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa này. Trong sự phát triển, dần dần phần đầu
gắn tiêu giảm, 2 đầu hormogonia trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều
dày không đổi. Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản
được lập đi lập lại một cách ngẫu nhiên, tạo nên vòng đời của tảo. Kiểu sinh
sản này thường gặp ở các sợi tảo có dạng chuỗi tế bào xếp nối nhau. Trong
thời kì sinh sản tảo Spirulina nhạt màu ít sắc tố xanh hơn bình thường [5, 13].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Hình 1.4. Vòng đời của tảo
Đồ án tốt nghiệp 12
Trong một số điều kiện sống không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng
tạo bào tử giống vi khuẩn, đó là hình thức sinh sản vô tính. Bào tử tảo có chứa
nhiều chất dinh dưỡng ở dạng dự trữ và được bao bọc bởi một lớp dày, khi
gặp điều kiện thuận lợi, chúng sẽ tạo thành sợi mới. Chu kỳ phát triển của
tảo Spirulina rất ngắn, nuôi trong phòng thí nghiệm thì thời gian thế hệ của nó
chỉ kéo dài trong 24 giờ, ở điều kiện tự nhiên là khoảng 3 5 ngày [7].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng của tảo Spirulina
Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực
phẩm hiện nay 60 70% trọng lượng khô, cao hơn trong thịt bò 3 lần, trong đậu
tương 2 lần. Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin B1, 40mg vitamin
B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP, 190mg vitamin E,
4.000mg caroten trong đó βCaroten khoảng 1700mg (tăng thêm 1000% so với
cà rốt), 0,5mg acid folic, inosit khoảng 500 1.000mg. Phần lớn ch ất béo trong
Spirulina là acid béo không no, trong đó acid linoleic 13.784mg/kg, γlinoleic
11.980mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm tự nhiên khác. Hàm
lượng khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt
là 580 646mg/kg (tăng thêm 5.000% so với rau chân vịt), mangan là 23
25mg/kg, Magie là 2.915 3.81mg/kg, selen là 0,4mg/kg, canxi, kali, phospho
đều khoảng là 1.000 3.000mg/kg hoặc cao hơn (hàm lượng canxi tăng hơn sữa
500%). Hàm lượng cacbonhydrat khoảng 16,5%, hiện nay đã có những thông
tin dùng glucose chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu
chống ung thư [34, 35].
Tảo Spirulina có chứa phong phú các acid amin cần thiết như lysin,
threonin... rất quan trọng cho trẻ đặc biệt là trẻ thiếu sữa mẹ. Hàm lượng
khoáng chất và các nguyên tố vi lượng phong phú có thể phòng tránh bệnh
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 13
thiếu máu do thiếu dinh dưỡng một cách hiệu quả và cũng là nguồn bổ sung
dinh dưỡng rất tốt cho trẻ lười ăn [34].
Trong tảo Spirulina có chứa nhiều loại chất chống lão hóa như βcaroten,
vitamin E, acid γlinoleic. Những chất này có khả năng loại bỏ các gốc tự do
thông qua tác dụng chống ôxi hóa, làm chậm sự lão hóa của tế bào, đồng thời
sắt, canxi có nhiều trong tảo vừa dễ hấp thụ vừa có tác dụng phòng và hỗ trợ
điều trị các bệnh thường gặp ở người già như thiếu máu, xốp xương...[34].
Có thể dùng tảo Spirulina hỗ trợ trong điều trị bệnh viêm gan, suy gan,
bệnh nhân bị cholesterol máu cao và viêm da lan tỏa, bệnh tiểu đường, loét dạ
dày tá tràng và suy yếu hoặc viêm tụy, bệnh đục thủy tinh thể và suy giảm thị
lực, bệnh rụng tóc. Với liều dùng vừa phải, Spirulina làm cân bằng dinh
dưỡng, tổng hợp các chất nội sinh, tăng hormon và điều hòa sinh lý [34].
Tảo tiêu diệt được Candida albicans, một loại nấm thường kí sinh trong
đường ruột của nạn nhân AIDS. Hiện nay Spirulina còn được nghiên cứu
invitro, để ngăn chặn sự tấn công của virus HIV. Ngoài ra, tảo Spirulina có
những tác dụng đã và đang được các nhà khoa học nghiên cứu [32, 33, 34].
1.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina
1.2.1. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina trên thế giới
Người ta bắt đầu biết đến tảo Spirulina qua loại thức ăn Tecuitlatl của
người dân Aztec (Mêhicô) và bánh Dihé của bộ tộc Kanembu (Cộng hòa Chad
và Niger). Việc phát hiện và phát triển tảo Spirulina ra khắp thế giới gắn liền
với lịch sử tìm ra châu Mỹ của Christophe Colomb năm 1492. Mãi đến năm
1960, khi Leonard và Comperé (người Bỉ) phân tích và công bố giá trị dinh
dưỡng của Tecuitlatl và Dihé chứa hàm lượng protein cao thì Spirulina được
giới khoa học quan tâm nhiều hơn. Năm 1963, Giáo sư Clement thuộc Viện
nghiên cứu dầu hỏa Pháp là người đầu tiên nghiên cứu nuôi tảo Spirulina ở
quy mô công nghiệp thành công. Năm 1967, nghiên cứu này đã được triển khai
tại Công ty Sosa Texcoco ở Mêhicô, Spirulina đã được nuôi trồng ở quy mô
lớn trên suối nước khoáng giàu bicacbonat. Tiếp sau đó, hàng loạt xí nghiệp
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 14
sản xuất tảo Spirulina đã xuất hiện ở Mỹ, Ấn Độ, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn
Quốc, Trung Quốc,…[11].
Nhu cầu về các chất có giá trị cao trong tảo Spirulina dùng để làm thuốc và
thực phẩm chức năng ngày càng tăng. Viện Nghiên cứu truyền nhiễm virus,
trường Y khoa Harvard, Earthrise Farms (California) gần đây công bố nghiên
cứu của họ về khả năng ức chế sự nhân lên của virus HIV 1 trong dòng tế
bào T của nước chiết từ Spirulina. Nếu một người sử dụng 2 3g tảo
Spirulina sẽ giúp tăng cường sức khỏe và khả năng tự bảo vệ của cơ thể [27].
Tảo lam Spirulina platensis có thể là chỉ thị tốt nhất cho một vài loại nước
thải. Spirulina có khả năng loại bỏ kim loại nặng cadimi trong nước thải rất
tốt, do độ hấp thụ cũng như hiệu suất hấp thụ kim loại của nó rất cao [29].
Ngoài các hướng nghiên cứu đã được chỉ ra ở trên, hiện nay đã có nhiều
công bố thông báo về khả năng chuyển gen ở tảo Spirulina bằng việc áp dụng
công nghệ gen, kỹ thuật DNA tái tổ hợp đang được thực hiện ở Nhật Bản và
một số nước, nhằm mục đích tạo ra những chủng giống Spirulina có những
đặc tính mong muốn cho định hướng ứng dụng như tăng cường khả năng tổng
hợp acid γ linolenic hoặc là tạo chất dẻo sinh học dễ phân hủy…[22].
Việc sử dụng tảo Spirulina platensis trong các nghiên cứu về vũ trụ là
hướng có triển vọng. Ý tưởng về vi hệ sinh thái tự cung tự cấp “MELISSA”
(Micro Ecological Life Support System Alternative) cho các chuyến du hành vũ
trụ sử dụng tảo Spirulina platensis để chuyển nước thải, CO2, phân, nước tiểu
thành sinh khối tảo dinh dưỡng, H2O sạch và O2 cung cấp lại cho người đang
được NASA (Cơ quan hàng không và vũ trụ Hoa Kỳ) thử nghiệm ở dạng pilot
[24].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng tảo Spirulina ở Việt Nam
Ở Việt Nam, tảo Spirulina được nhập nội từ Pháp năm 1972 và trở thành
đối tượng nghiên cứu sinh lý, sinh hóa, tại Viện Sinh vật học (nay là Viện
Công nghệ sinh học) do cố Giáo sư TSKH. Nguyễn Hữu Thước chủ trì.
Những thí nghiệm nghiên cứu về tác động của ánh sáng, nhiệt độ, pH đã cho
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 15
phép đẩy nhanh quá trình thích ứng của tảo này ở điều kiện Việt Nam. Các
nghiên cứu tác động của các nguyên tố khoáng lên sinh trưởng và quang hợp
của tảo Spirulina là cơ sở cho việc thiết lập những môi trường dinh dưỡng rẻ
tiền, thích hợp cho nuôi trồng chúng. Chính trên nền môi trường này, Spirulina
đã được đưa vào thử nghiệm nuôi trồng đại trà tại Hà Nội, Bình Thuận, Bến
Tre, Thành phố Hồ Chí Minh [7].
Vào đầu thời điểm năm 1980, ở Thuận Hải, hai sản phẩm Spirulina đã
được xí nghiệp dược phẩm TW24 tung ra thị trường dưới tên gọi “Linavina”
và “Lactogyl” để làm thuốc bổ dưỡng. Sinh khối Spirulina cũng được các đơn
vị như bệnh viện Thống Nhất, bệnh viện phụ sản Từ Dũ, bệnh viện tỉnh
Thuận Hải, trung tâm dinh dưỡng trẻ em thành phố Hồ Chí Minh tiến hành
thử nghiệm chống suy dinh dưỡng ở trẻ em và người già [11, 18].
Trong khoảng thời gian 1981 1985, Phòng Công nghệ Tảo Viện Công
nghệ sinh học đã hợp tác chặt chẽ với Bộ môn Hóa Công nghệ trường Đại
học Bách khoa Hà Nội và Công ty Công nghiệp tỉnh Thuận Hải (nay là tỉnh
Bình Thuận) để triển khai nuôi trồng Spirulina ở quy mô lớn tại suối nước
khoáng Vĩnh Hảo giàu bicacbonat và các chất khoáng khác, tận dụng gió, ánh
sáng, nhiệt độ cao quanh năm. Ban đầu, Spirulina được nuôi trồng ở quy mô
60 bể (mỗi bể 45m3) với năng suất 8 10g khô/m2/ngày. Cũng trong thời gian
này, hàng loạt nghiên cứu ứng dụng sinh khối Spirulina cho gia cầm, cá, vịt,
ong, tằm cũng đã được thực hiện.
Năm 1994, Nguyễn Thị Đệ đã tiến hành nghiên cứu vai trò và một số tính
chất của phycobiliprotein chính trong tảo Spirulina [3,17].
Năm 1996, Đặng Đình Kim, Đặng Hoàng Phước Hiền, Dương Trọng Hiền
đã khẳng định khả năng ứng dụng của phycobleu tách chiết từ Spirulina
platensis cho bệnh nhân ung thư. Phycobleu có tác dụng nâng cao thể trạng cho
bệnh nhân ung thư vùng đầu, cổ trong thời gian chiếu xạ hoặc sau phẫu thuật
và loại sản phẩm này không gây phản ứng phụ nào [15].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 16
Năm 1997, một nhóm nhà nghiên cứu đã thử nghiệm một số đặc điểm sinh
lý, sinh hóa của Spirulina platensis trong điều kiện chịu mặn NaCl và đã kết
luận rằng hàm lượng chlorophyll và carotenoid có khuynh hướng tăng khi tăng
nồng độ trong môi trường. Như vậy muốn sản xuất nhiều chlorophyll và
carotenoid thì trong môi trường nuôi cấy có thể bổ sung thêm một ít muối
NaCl [12]. Năm 2008, Hoàng Sỹ Nam, Đặng Diễm Hồng đã tiến hành nuôi
trồng thử nghiệm 2 chủng tảo Spirulina platensis CNT và Spirulina platensis
C1 trong các loại nước khoáng Thạch Thành Thanh Hóa, Thanh Tân Thừa
Thiên Huế và Thanh Liêm Hà Nam đã cho kết quả là cả 3 loại nước khoáng
điều có thể sử dụng để nuôi trồng tảo, trong đó loại nước khoáng ở Thanh
Hóa thì cho chi phí nuôi tảo giảm được một nửa mà chất lượng tảo vẫn đảm
bảo để làm thực phẩm cho người và động vật nuôi [9].
1.3. Các vấn đề trong nuôi tảo Spirulina platensis
Trước tình hình nhu cầu sử dụng tảo Spirulina trong các lĩnh vực khác nhau
ngày càng tăng ở Việt Nam, song lượng sinh khối tảo này sản xuất ra vẫn còn
chưa đáp ứng đủ, do đó việc lựa chọn, tạo đột biến được những chủng giống
tảo Spirulina tốt là điều kiện trước tiên. Ngoài ra, phải tìm được môi trường
dinh dưỡng thích hợp, rẻ tiền để nuôi trồng loài tảo này ở quy mô lớn, phù
hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam nhằm không ngừng nâng cao năng suất
và chất lượng sinh khối tảo là điều cần được quan tâm và có ý nghĩa thực tiễn
to lớn.
*Spirulina sản xuất ra đường (carbohydrate hoặc saccharide) trong suốt quá
trình chúng quang hợp. Khi nồng độ các chất này trở nên dư thừa trong cơ thể,
chúng sẽ tiết ra môi trường. Vì những chất đường nhầy nên khi sợi tảo trườn
lên sẽ tạo ra khối nhầy và các sợi tảo sẽ không tiếp xúc được với môi trường
dinh dưỡng nên chúng sẽ bị chết vì đói. Chúng ta phải cảnh giác với 3 nguyên
nhân dẫn đến việc sản sinh đường quá mức, đặc biệt khi nhiệt độ cao đe dọa
quang phân giải. Thứ hai là thiếu nitrogen phức hợp trong môi trường vì
nitrogen phức hợp trong tế bào được sử dụng để chuyển hóa polysaccharide
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 17
thành protein. Khi chúng không được chuyển hóa thành protein thì chúng sẽ
tiết ra môi trường. Và sự thừa bicarbonate hoặc thiếu sulfur trong môi trường
cũng dẫn tới làm sản sinh đường dư thừa [12].
*Các vi sinh vật nhiễm tạp:
Động vật chân chèo (Rotifers) kích thước từ 100 2mm
Đôi khi một số động vật chân chèo rơi vào trong môi trường và chúng
thường sử dụng tảo làm thức ăn. Vào ban đêm, tảo tiêu thụ oxygen và sản sinh
ra CO2, khí này có tác dụng đầu độc động vật. Vì vậy, nên dừng khuấy vào
ban đêm và tảo sẽ sử dụng oxygen hòa tan và do đó động vật thiếu oxygen
chúng sẽ bị chết. Cách khác để hạn chế động vật là sử dụng chúng. Dùng một
lưới dài, hình túi (mắt lưới đường kính 10m) gắn bên trong bể, tại các góc bên
phải theo hướng di chuyển của môi trường nuôi cấy như vậy các động vật
này sẽ bị giữ lại trên lưới. Những động vật này là thức ăn rất tốt cho tôm hoặc
cá con [12, 38] .
Amoeba
Những loài này khác với động vật nguyên sinh ở chỗ chúng ăn tảo. R.R.
Kudo đã mô tả 74 loài amoeba khác nhau. Có một loài trong số chúng gây nguy
hiểm cho người đó là Entamoeba histolytica. Chúng lan truyền bằng các bào tử
“hình trứng”, các bào tử này bị chết trong nước nhiệt độ 450C trong thời gian
1h và ở nhiệt độ 550C trong ít giây. Nhiệt độ bên trong của thiết bị sấy sử
dụng năng lượng mặt trời dao động từ 50600C và qúa trình làm khô diễn ra
trong suốt 4h, vì vậy nguy cơ tiềm ẩn từ những sinh vật loại này bị diệt trừ
gần như tuyệt đối [12].
Tảo
Môi trường nuôi cấy còn bị nhiễm các loại tảo khác. Nhưng do nồng độ
muối, pH cao của môi trường, do đó thường trở nên không thuận lợi với đa số
các loài tảo. Ở nồng độ muối đạt 20 g/l hầu như các loài tảo bị tiêu diệt. Tuy
nhiên, loài tảo silic Navicula, tảo xanh lục, và tảo lục Chlorella vẫn sống sót
được trong các bể nuôi Spirulina. Chúng thường sống ở đáy bể và nếu như
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 18
mật độ của Spirulina trở nên dày đặc thì ức chế các tảo khác do ánh sáng
không xuống được tới đáy. Trong trường hợp chúng phát triển mạnh thì người
ta sẽ dừng khuấy, thu vớt sinh khối tảo Spirulina trên bề mặt, chuyển chúng
sang bể khác, tiếp theo rửa sạch bể để loại bỏ tảo nhiễm tạp [12, 38].
*Môi trường nuôi cấy sau khi thu hoạch có mùi tanh nồng nếu thải ra môi
trường sẽ bị ô nhiễm vì có tính kiềm mạnh vì vậy cần xử lý trước khi thải ra
ngoài.
1.4. Mật rỉ (hay rỉ đường)
Mật rỉ là sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất đường mà từ đó
đường không thể kết tinh một cách kinh tế nữa bởi các công nghệ thông
thường. Có hai loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Ở Việt Nam
chỉ dùng rỉ đường mía. So với rỉ đường củ cải thì rỉ đường mía có lượng
saccharose thấp hơn nhưng lượng đường khử cao hơn . Rỉ đường thường
chiếm khoảng 3 5% trọng lượng của mía ép hay 100 tấn mía sẽ tạo ra 3 5
tấn rỉ đường. Thành phần của rỉ đường mía phụ thuộc vào giống mía, thổ
nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sản xuất.
Rỉ đường mía thu được khi chế biến đường thô là một hỗn hợp phức tạp có
chứa các đường lên men, các chất hữu cơ, chất có chứa nitơ cũng như các hợp
chất vô cơ. Trong rỉ đường có 15 20% là nước, 80 85% chất khô hoà tan.
Trong chất khô có từ 25 40 % là đường, trong đó saccharose chiếm 3035%,
đường glucose, fructose chiếm 15 20%, còn lại những chất không phải là
đường hoà tan trong nước gồm có 30 32% là các chất hữu cơ như pectin,
furfurol, acid hữu cơ, caramen, các chất màu, acid amin, vitamin, chất kích
thích sinh trưởng và 18 20% là chất vô cơ có các ion: K +, Na+, Cl, Ca2+, Mg2+,
SO32 … [37].
Tuy nhiên, rỉ đường cũng có những đặc điểm không phù hợp cho quá trình
nuôi cấy. Muốn sử dụng chúng cho quá trình nuôi cấy đòi hỏi phải có các quá
trình xử lý thích hợp. Các đặc điểm cần lưu ý mật rỉ bao gồm:
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 19
Rỉ đường thường có màu sẫm. Màu này khó bị phá huỷ trong quá trình nuôi
cấy. Sau nuôi cấy chúng sẽ bám vào sinh khối sinh vật và bám vào sản phẩm.
Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó
khăn. Vì vây phải xử lý trước khi tiến hành quá trình nuôi cấy.
Hàm lượng đường khá cao (thường nằm trong khoảng 40 50%). Lượng
đường này chủ yếu là saccharose nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới
nồng độ thích hợp.
Đặc điểm gây khó khăn lớn nhất cho quá trình nuôi cấy là hệ keo trong
mật rỉ. Keo càng nhiều thì khả năng hoà tan oxy càng kém và khả năng trao đổi
chất của oxy càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là
phải phá hệ keo này.
Vì rỉ đường là chất dinh dưỡng khá lý tưởng nên chúng rất dễ bị vi sinh
vật xâm nhập và phát triển. Như vậy chất lượng mật rỉ cũng dễ thay đổi theo
thời gian bảo quản.
Để giải quyết những đặc điểm không thuận lợi có trong mật rỉ đối với quá
trình lên men, người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc với lượng 3,5kg
cho một tấn mật rỉ. Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, ta có ba cách thực hiện quá trình
xử lý này :
+ Cách thứ nhất: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy
đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
+ Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun toàn
bộ lên 850C và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong.
+ Cách thứ ba: Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4, người
ta đun nóng đến 120 1250C trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly
tâm thu dịch trong.
Thực hiện một trong ba cách trên sẽ thu được dịch mật rỉ đã loại thể keo và
màu. Từ mật rỉ đã qua xử lý này đem pha chế thành các loại môi trường có
nồng độ khác nhau.. Tuy nhiên giá trị của mật rỉ trong quá trình nuôi cấy thu
nhận sinh khối không chỉ do lượng đường saccharose có trong mật rỉ mà còn
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 20
do các loại muối khoáng, các chất kích thích sinh trưởng và các thành phần
khác quyết định [15].
1.5. Giới thiệu về hệ thống ánh sáng đèn Led trong nuôi cấy tảo
Vấn đề môi trường đang là thách thức lớn của nhân loại. Việc thải khí CO2
của các nhà máy điện sử dụng nhiên liệu hóa thạch được coi là một trong
những nguyên nhân chủ yếu gây hiệu ứng nhà kính làm cho khí hậu nóng dần
lên, dẫn đến hàng loạt những biến đổi khí hậu trên thế giới trong những năm
gần đây. Do vậy, tiết kiệm điện năng là vấn đề của tất cả các quốc gia trên
thế giới không phân biệt là nước giàu hay nghèo. Tiết kiệm điện năng trước
hết là sử dụng hợp lý các thiết bị tiêu thụ điện trong đó có các thiết bị chiếu
sáng, tạo ra môi trường ánh sáng tiện nghi cho con người mà còn tiết kiệm chi
phí cho điện năng tiêu thụ và các chi phí khác. Nhưng trong hoàn cảnh thiếu
hụt điện năng như bây giờ, đèn Led là lựa chọn số 1, vừa bởi hiệu quả chiếu
sáng cao, vừa bởi hiệu quả tiết kiệm điện [16].
LED là viết tắt của LightEmittingDiode có nghĩa là “điốt phát sáng” là
một nguồn sáng phát sáng khi có dòng điện tác động lên nó. Được biết tới từ
những năm đầu của thế kỷ 20, công nghệ LED ngày càng phát triển từ những
diode phát sáng đầu tiên với ánh sáng yếu và đơn sắc đến những nguồn phát
sáng đa sắc, công suất lớn và cho hiệu quả chiếu sáng cao.
Hình 1.5: Đèn Led và hệ thống đèn Led xanh dùng trong nuôi tảo
Hoạt động của LED dựa trên công nghệ bán dẫn. Trong khối điốt bán dẫn,
electron chuyển từ trạng thái có mức năng lượng cao xuống trạng thái có mức
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 21
năng lượng thấp hơn và sự chênh lệch năng lượng này được phát xạ thành
những dạng ánh sáng khác nhau. Màu sắc của LED phát ra phụ thuộc vào hợp
chất bán dẫn và đặc trưng bởi bước sóng của ánh sáng được phát ra.
Một đặc điểm của đèn LED là ít tiêu hao năng lượng và không nóng. Bóng
đèn truyền thống, đèn neon, đèn halogen... đều cần từ 110 220V mới cháy
được, trong khi đèn LED trắng chỉ cần từ 3 24V để phát sáng. Nhiệt độ làm
việc của bóng đèn LED cao hơn nhiệt độ môi trường khoảng 5 80C, thấp hơn
so với đèn huỳnh quang thông thường là khoảng 13 250C. Đèn LED có hiệu
suất sáng cao hơn, do đó tiết kiệm khoảng 75% điện năng so với các đèn chiếu
sáng thông thường. LED còn có tính chất sáng nhanh, tắt nhanh nên khi nhiệt
chưa tạo ra thì đã ngắt dòng điện, cho nên nhiệt độ tỏa ra không nhiều (nhiệt
là nguyên nhân chính làm giảm tuổi thọ cho các thiết bị chiếu sáng). Đèn LED
có tuổi thọ rất cao vượt qua 50.000 giờ (tương đương với 6 năm thắp sáng liên
tục). Chất lượng ánh sáng thân thiện, không tia cực tím, không bức xạ tia hồng
ngoại, phát nhiệt của ánh sáng thấp, không chứa thủy ngân và những chất có
hại… không nhấp nháy, không gây nhức mỏi mắt [36].
Do ít tiêu hao năng lượng nên đèn LED có thể sử dụng ở vùng sâu vùng xa
mà không cần nhà máy phát điện công suất cao. Đèn LED trắng có thể sử
dụng với pin mặt trời và gần đây nhất với pin nhiên liệu chạy bằng hỗn hợp
nước và rượu. Đèn pin dùng LED trắng có thể sử dụng dễ dàng khi bị mất
điện, vì chỉ cần vài cục pin vẫn có thể thắp sáng được đèn.
Hiện nay đèn Led được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu về
quang sinh học như là sự tổng hợp chlorophyll ( Tripathy và Brown, 1995),
quang hợp (Tennessen và cộng sự, 1994) và phát sinh hình thái ( Hoenecke và
cộng sự, 1992; Robin và cộng sự, 1994) [16].
Một vài loại cây trồng được báo cáo là đã trồng thành công dưới hệ thống
Led như: cây tiêu, dưa, lúa mỳ, bó xôi ( Bula và cộng sự, 1991; Hoenecke,
1992; Brown và Schuerger, 1994; Yanagi và Okamoto, 1994), những cây khoai
tây nuôi cấy trong ống nghiệm ( Miyashita và cộng sự, 1995) [16].
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 22
Từ 1996 đến 2007, Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã ứng dụng thành công
hệ thống phát sáng Led trên một số loại cây trồng như dâu tây, bạch đàn, hồ
điệp, lan, cúc…Những cây trồng nuôi cấy dưới hệ thống đèn Led không
những sinh trưởng phát triển tốt ở điều kiện invitro mà còn cả ở điều kiện
exvitro. Những nghiên cứu về giải phẫu học, quang hợp cũng chứng minh
rằng những cây nuôi cấy dưới hệ thống đèn Led thì tốt hơn khi so sánh với hệ
thống chiếu sáng bằng đèn neon.
PHẦN II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài
2.1.1. Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học khu A
trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.1.2. Thời gian tiến hành đề tài: Từ 11/03/2012 01/06/2012
2.2. Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống tảo Spirulina platensis được bảo quản tại phòng thí nghiệm công
nghệ sinh học khoa Hóa trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng ngày
21/05/2011.
Giống tảo Spirulina platensis được mua tảo mua ở Phòng công nghệ Tảo
viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào 15/03/2012. Giống ở dạng dung
dịch được đựng trong chai nhựa.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị phục vụ thí nghiệm
Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, chai thủy tinh
500ml, bình tam giác, bể nuôi, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ,
micropipet, ống eppendof… tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Khoa
Hóa Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng.
Thiết bị, máy móc thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Công
nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng.
2.2.3. Hóa chất
2.2.3.1. Môi trường Zarrouk [10]
Bảng 2.1. Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường Zarrouk:
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
STT
9
1
10
Thành phần
K2HPO4
NaNO3
K2SO4
NaCl
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
EDTA
Thành ph
NaHCO3ần
H3BO
Vi lượ
ng A
3 5
Khối lượng (g/l)
0,50
2,50
1,00
1,00
Bảng 2.2.
0,20
Thành phần vi
0,04
0,01
lượng A5:
0,08
Số l16,8
ượng mg/100ml
1ml 286
2
MnSO4.7H2O
250
3
ZnSO4.7H2O
22,2
4
CuSO4.5H2O
7,9
5
Na2MoO4.2H2O
2,1
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 24
2.2.3.2. Môi trường rỉ đường [1]
Rỉ đường có nhiều ưu điểm để tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì sau
khi qua xử lý màu và hệ keo, bắt đầu tiến hành pha môi trường nuôi cấy
Spirulina plantensis.
Bảng 2.3. Thành phần môi trường rỉ đường
STT
1
2
Thành phần
Rỉ đường
NaHCO3
Đơn vị tính
ml/lít
g/lít
Lượng
0,75; 1; 1,5
16,8
2.2.3.3. Các hóa chất chuyên dùng khác: Như các hóa chất để tách chiết
chlorophyll, protein, bảo quản giống của tảo Spirulina như: cloroform,
methanol, glycerol...
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống được bảo quản trong Glycerol và
đông khô tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học
Chuẩn bị môi trường Zarrouk theo bảng 2.1 và bảng 2.2 phân phối vào bốn
ống nghiệm đã thanh trùng, cấy giống tảo được bảo quản (21/05/2011) trong
Glycerol và đông khô (được bảo quản trong tủ lạnh đông sâu hiệu Sanyo ở
210C). Tiến hành hoạt hóa giống ở máy nuôi cấy lắc hiệu Model Grant
GLS400 với điều kiện lắc 150 vòng/phút ở 350C trong 24h và 48h.
2.3.2. Quan sát hình dạng giống tảo hoạt hóa và giống tảo mua ở Phòng
công nghệ Tảo viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Các mẫu tảo sau thời gian hoạt hóa được đem đi quan sát hình thái dưới
KHV quang học hiệu Model Olympus CH2 ở các vật kính 10x và vật kính 40x.
Sau đó chụp ảnh lại và mô tả đặc điểm hình thái.
2.3.3. Khảo sát môi trường nuôi cấy
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm
bốn nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và
tiến hành lặp lại 3 lần.
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
Đồ án tốt nghiệp 25
Khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự
tăng sinh tảo Spirulina. Cấy 30% tảo giống Spirulina vào 250ml môi trường
trong bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện môi trường khác nhau
bao gồm: môi trường 1: môi trường cơ bản (Zarrouk), môi trường 2: môi
trường 0,75ml rỉ đường + 16,8g NaHCO 3, môi trường 3: 1ml rỉ đường + 16,8g
NaHCO3, môi trường 4: 1,5ml rỉ đường + 16,8g NaHCO3.
Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34 37 0C,
pH = 8 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi
trường nuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm
trong 30 phút. Tiến hành đo OD bằng máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech
Ultrospec 2000 để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường
khác nhau.
2.3.4. Khảo sát các loại ánh sáng ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, phát
triển của tảo
Thí nghiệm đơn yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm hai
nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được tiến hành nuôi trong 3 bình serum và tiến
hành lặp lại 3 lần.
Khảo sát ảnh hưởng của các loại ánh sáng nuôi cấy khác nhau lên sự sinh
trưởng và phát triển của tảo Spirulina platensis. Cấy 30% tảo giống vào 300
ml môi trường trong bình serum loại 500ml nuôi trong các điều kiện khác nhau
bao gồm: ánh sáng đèn huỳnh quang và ánh sáng đèn Led.
Các điều kiện nuôi cấy được giữ ổn định: nhiệt độ phòng nuôi: 34 37 0C,
pH = 8 11, thể tích môi trường nuôi cấy 300ml, chiếu sáng liên tục 24/24. Môi
trường nuôi cấy và dụng cụ nuôi được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 1atm
trong 30 phút. Tiến hành đo OD máy đo quang hiệu Pharmacia Biotech
Ultrospec 2000 để xác định tốc độ sinh trưởng của tảo trong các môi trường và
trong điều kiện ánh sáng khác nhau.
2.3.5. Khảo sát các phương pháp thu hoạch tảo Spirulina platensis
2.3.5.1. Thu hoạch bằng phương pháp lọc thủ công
SVTH: Nguyễn Thị Thu Thảo GVHD: TS. Đặng Đức
Long
