Bài thuyết trình: Ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

Trường Đại Học Nông 
Lâm TP.HCM
Nhập Môn Công Nghệ Sinh 
Học

Thuyết 
Trình

Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học 
Trong Sản Xuất Thuốc BVTV
GVHD: Ts.Nguyễn Vũ Phong


Đặt Vấn Đề
Thuốc Trừ Sâu Sinh Học 
( Biopesticides )
Vi Khuẩn (Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus, 
Bacillus papillae )

Các virus côn trùng thuộc họ Baculoviridae


Có 2 hướng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong vấn đề 
tạo giống và sản xuất thuốc trừ sâu sinh học:
­  Cắt phân lập và tái tổ hợp các gien sản xuất protein kết tinh 
( nội độc tố ) của B.thuringiensis và plasmid của E.coli và sản xuất 
theo phương pháp CNSH.
­  Sản xuất Baculovirus theo phương pháp  nuôi cấy tế bào. Để tăng 
cường tính gây bệnh của baculovirus, giảm thời gian nung bệnh và 
gây chết nhanh công trùng, người ta tái tổ hợp gien sản xuất nọc 
độc của ong, nhện vào virus baculovirus và sản xuất theo lối CNSH.

Phương Pháp Thực Hiện
1.Vi khuẩn Bacillus 
thuringgiensis làm thuốc trừ sâu 
sinh học

­ Các loại vi khuẩn Bacillus thường sinh trưởng, phân chia mạnh và 
khi môi trường nghèo chất dinh dưỡng, chúng hình thành bào tử.
­ Bào tử là một dạng quá độ của sự sinh sản, được hình thành trong 
điều kiện bất lợi của môi trường và có tính kháng với ngoại cảnh khá 
cao.
­ Các loại Bacillus trong quá trình hình thành có sản xuất một 
loại protein nào đó, rất độc đối với các loài VSV khác.




Có 2 chủng Bacillus thunringiensis đáng quan tâm
­ Bacillus thurigiensis var.israelensis: loại này gây bệnh cho 
hầu hết côn trùng hút máu như muổi, ve, bét,…được coi là 
vector truyền bệnh ở người và động vật.
­ Bacillus thurigiensis  var.tenebrionis phát hiện năm 
1983, có tác dụng gây bệnh với các loài bọ gây thiệt hại 
lớn với khoai tây


Bacillus thurigiensis 
var.israelensis

Bacillus thurigiensis  
var.tenebrionis


Tinh thể protein nội bào ( nội độc tố $ ) và gien 
Cry
Nha bào:một dạng tiềm sinh của các loại 
vi khuẩn trong họ Bacillus 
Tinh thể protein của Bacillus thuringiensis được 
hình thành trong khi nha bào hóa ( sporulation )
Tinh thể proteun có thể là dạng hình bình hành, 
nhiều góc cạnh hoặc hình khối đa chiều.
Tinh thể protein được mang trong nha bào là 
một tiền độc tố ( protoxin )


­ Tinh thể protein hình bình hành bao gồm 2 loại 
protein tiền độc tố : một loại có phân tử lượng 135 
Kda, 2 loại có phân tử lượng 140 Kda. Tất cả đều đặc 
hiệu gây độc cho côn trùng trong lớp Lepidoptera.
­ Tinh thể hình khối chỉ chứa duy nhất một protoxin có 
phân tử lượng 65 Kda và đặc hiệu gây độc cho cả 
Lepidoptera vả Diptera.


Chịu trách nhiệm sản xuất nội độc tố delta là gien có tên 
gọi là Cry. 
Có 4 nhóm gien Cry sản xuất các loại tinh thể protein
Cry­I sản xuất tin thể protein đặc hiệu gây bệnh cho lớp 
Lepidoptera

Cry­II đặc hiệu cho lớp Lepidotera và Diptera
Cry­III cho Coleoptera
Cry­IV cho Diptera


Thực chất gien Cry không nằm trong hệ gien 
của Bacillus thuringiensis mà là do các loại 
plasmid của Bacillus thuringiensis cưu mang.
­ Loại plasmid 67.000 nucleotide chứa gien Cry­I sản xuất loại protoxin 
135Kda và loại plasmid này có thể dùng để chuyển nạp qua lại trong 
các chủng Bacillus thuringiensis .
­ Loại plasmid 174.000 nucleotide có 2 gien Cry­I và Cry­II, sản xuất 
protoxin 140 Kda, và 65 Kda. Loại plasmid này chỉ thích ứng riêng 
cho chủng Bacillus thuringiensis typ HD­1.


Khi mem protease trong hệ tiêu hóa của côn trùng 
phân cắt rời thành các tiểu phần khác nhau.

Tiểu phần protein có tính độc với côn trùng chỉ có phân 
tử lượng 60 – 70 Kda. Đó là phần hoạt tính, các phần 
khác chỉ có chức năng làm nền và bảo vệ đó là phàn kết 
tinh.


Tái tổ hợp gien Cry ­ Công nghệ sinh học sản xuất tinh 
thể protein diệt công trùng.
­ Chủng Bacillus thuringiensis cung cấp nguồn gien Cry được 
dùng hiện nay là Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 7, sản xuất 
2 protoxin: 130 KDa và 135 KDa . 

­ Khi 2 gien Cry chịu trách nhiệm sản xuất 2 loại protoxin này 
được tái tổ hợp vào plasmid của E.coli thì trong tế bào E.coli  các 
tinh thể protein của protoxin được sản xuất và thu được gần 
như nguyên chất.


Bacillus thuringiensis aizawai typ IPL 7


Công nghệ sinh học sản xuất nội độc tố delta của Bacillus 
thuringiensis sữ dụng kỹ thuật tái tổ hợp gien.

1.Tái Tổ Hợp 
Gen

Các gien Cry đặc hiệu với nhóm 
Lepidoptera của Bacillus 
thuringiensis được cắt và phân 
lập rồi nối vào plasmid của E.coli

+ Gien Cry được lấy từ Bacillus thuringiensis var.berliner chuyễn 
nạp vào E.coli, cho sản phẩm protoxin ký hiệu Bt2.
+ Tái tổ hợp gien Cry từ Bacillus thuringiensis var.aizawai typ HD­
68 vào E.coli cho sản phẩm Bt3.


2.Chuyển protoxin thành toxin
­ Protoxin thành phẩm sau khi được xữ lý bằng mem trypxin, 
sẽ chuyễn thành toxin.
­ Mem Trypxin giống như các loại mem phân cắt protein có 

trong ruột côn trùng, đã cắt protoxin cho một tiểu phần 
khoảng 60Kda có hoạt tính gây độc.
­ Loại mem trypxin và các thành phần khác, chúng ta thu 
được độc tố tinh khiết.


3. Chuẩn độ độc tố
Chuẩn độ độc tố ( toxin titration ): tức là tìm liều lượng thích 
hợp của một loại độc tố để gây nhiễm một loại côn trùng 
nhất định.
Có 2 loại ấu trùng được sữ dụng để chuẩn độ độc tố: 
Ấu trùng sâu cuốn thuốc lá ( Manduca sexta )
 Ấu trùng bướm trắng ( Pieris brassicae ).


Ấu trùng sâu cuốn thuốc 
lá ( Manduca sexta)


Ấu trùng bướm 
trắng ( Pieris 
brassicae )


-

-

Độc tố được hòa thành các nồng độ khác nhau, 
thấm vào thức ăn và cho chúng ăn trong giai đoạn 

phát triển từ ấu trùng thành nhộng.
Sau khi tính toán được lượng độc tố gây chết 50% 
ấu trùng chuẩn độ, từ đó ta có thông số cần thiết 
để sữ dụng độc tố chống côn trùng phá hoại mùa 
màng. 


Virus côn trùng ( Baculovirus )
Baculovirus là tên chung chỉ các loài virus côn trùng có dạng 
hình que
­ Đặc tính hình thái của chúng, đc phân loại thuộc họ virus có 
tên là Baculoviridae 
­ Chiếm trên 60% tổng số gây bệnh cho côn trùng
­ Chúng hoàn toàn không gây nhiễm và gây bệnh cho người, 
động vật, kể cả thực vật. 



Ấu trùng nhiễm baculovirus theo đường thức 
ăn
Khi đã vào hệ tiêu hóa, virus xâm nhập vào các tế bào biểu mô và 
thực hiện chu kỳ nhân lên của mình.
Trong các tề bào bị nhiễm, trước hết AND của virus thực hiện sự 
nhân lên của mình theo cơ chế bổ xung, thường là 12­24h sau khi bị 
nhiễm.
Trong vòng 24­72 h tiếp theo các loại protein cần thiết đc tổng hợp 
sau cùng là protein vỏ bọc polyhedrin 


Hiện nay có một số loại baculovirus đang được 

ngiên cứu sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học
AcMNPV ( Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
HzSNPV ( Helicoverpa zea Single Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
OpMNPV ( Orgyia pseudotsugata Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )
LdMNPV ( Lymantria dispar Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus )