Báo cáo đồ án tốt nghiệp: Nghiên cứu xác định các loại axit amin trong một số loài nấm lớn ở khu vực Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI: 
“NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CÁC LOẠI AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI 
NẤM  LỚN Ở KHU VỰC BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)”

GVHD:  Th.S Hoàng Văn Trung
SVTH: Nguyễn Duy Trọng
Hoàng Thị Nga
Lớp:
51K_CNTP



MỞ ĐẦU
 

1. Lí do chọn đề tài
 Với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu 
nhiệt  đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự đa dạng của hệ nấm 
Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.
 Hiện nay không chỉ  ở Việt Nam mà trên thế giới đều công nhận 
giá trị khoa học các loài nấm, nấm được coi là một thực phẩm chức 
năng, có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là 
nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng, nguồn dược phẩm quý. 
 Protein trong nấm có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với hầu hết các 
protein thực vật. Protein khi đi vào cơ thể được chuyển hóa thành  các 
axit amin, trong đó có 9 axit amin thiết yếu. Axit amin là thành phần 
quan trọng  thực hiện các chức năng đa dạng của cơ thể, là tiền thân 
của  nhiều  sinh  chất  quan  trọng  trong  cơ  thể  sống.  Vì  vậy  việc  xác 
định axit amin trong nấm là rất cần thiết.

 

    Trong  những  năm  gần  đây,  HPLC  được  ứng  dụng  rộng  rãi  trong 
phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng 
sinh, phụ gia thực phẩm... Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn 
đề tài : “Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số 
loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng 
hiệu năng cao HPLC”.

2. Mục đích nghiên cứu
      Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời các axit amin 
trong  các  loại  nấm  khác  nhau,  cung  cấp  số  liệu  về  thành  phần  dinh 
dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu.

3. Đối tượng nghiên cứu 
         Nghiên  cứu  xác  định  các  axit  amin  trên  nấm  tự  nhiên  được  thu 
thập từ  rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng  thuộc  vùng Bắc 
Trung Bộ.


Tuần hoàn 
vật chất

Dược phẩm, 
chống lão hóa

1
6

2

Ngăn ngừa, điều 
trị bệnh

NẤM

5

Các chất 
có hoạt tính 
sinh học cao

Thực phẩm giàu 
dinh dưỡng

4

3
Vitamin, khoáng 
chất


1.3. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao ­ HPLC
Chú thích: 
1.  Bình  chứa  dung 
môi pha động
2. Bộ phận khử khí
3. Bơm cao áp
4. Bộ phận tiêm mẫu 

5. Cột sắc ký 
6. Đầu dò  
7. Hệ thống máy tính 
8. Máy in

 


 

1.2. Axit amin
H

R

N

C

H

H

H

O
C

H
O

N

_

R
+

C

O
C

H
H

O

H

Bảng 1.1: Cấu trúc của 17 axit amin tiêu chuẩn

 
L­Alanin 

 
L­Arginin 

 

 

L­Histidin 

L­Methionin 

 
L­Leucin 

 
L­Lysin 

 
Axit L­Aspartic 

L­Cystin 

 

 
Axit L­Glutamic 

L­isoleucin 

 

 
L­Phenylalanin 

 

L­Prolin 

 
 
L­Serin 
 

 

 
L­Thrionin 

L­Tyrosin 

 
L­Valin 

 
L­Glycin 


Chương 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
 

2.1. Thu thập mẫu 
nấm
Các mẫu  Nấm Thượng hoàng, nấm PL1, nấm PL2, nấm PL3, 

nấm PL4  được thu thập từ các rừng Quốc Gia Pù Mát và rừng Phong 
Nha Kẻ Bàng vào 8­2013. Sau khi đưa về phòng thí nghiệm được làm 

khô và bảo quản ở nhiệt độ phòng.

  Hình 2.1: Mẫu nấm PL1  

Hình 2.2: mẫu nấm PL2

Hình 2.3: mẫu nấm PL3


 

  

Hình 2.4: Mẫu nấm PL4                         Hình 2.5: Mẫu nấm Thượng hoàng
  

   2.6: Mẫu nấm Linh Chi


2.2 Quy trình phân tích


 

2.3. Điều kiện chạy máy
­ Cột sắc ký: cột C18 150 x 4,6mm, kích thước hạt 5μm.
­ Nhiệt độ cột: 450C.
­ Tốc độ dòng: 0,5ml/phút.
­ Pha động: 
Pha động A: Hỗn hợp dung môi nước và tetrahydrofuran

 Pha  động  B:  Hỗn  hợp  dung  môi  nước,  axetonitril  và 
methanol theo gradient:
Flow 
(ml/min)
0,5

TT

Time (min)

A %

B %

1

0

100

0

2

18

0

100

0,5

3

18,1

0

100

0,5

4

18,5

0

100

0,8

5

23,9

0

100

0,8

6

24

0

100

0,5

7

25

100

0

0,5


 Chương trình bơm mẫu:

TT 

Chương trình 

1 

Hút 5 l từ vial 10 –  Đệm borate 

2 

Hút 1 l  từ vial 11 – Dẫn suất OPA 

3 

Hút 0 l  từ vial 12 – Nước 

4 

Hút 1 l  từ vial chứa mẫu 

5 
6 
7 

Hút 0 l  từ vial 11 – Nước 

8 
9 
10 
 

Trộn mẫu 
Hút 1 l  từ vial 14 – FMOC 
Hút 0 l  từ vial 12 – Nước 
Trộn mẫu 

Bơm mẫu 


Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
 

3.1. Khảo sát các điều kiện thủy phân mẫu
3.1.1. Khảo sát nồng độ axit HCl
        Để chọn nồng độ axit HCl phù hợp cho sự thủy phân mẫu chúng tôi khảo 
sát một dãy mẫu thực (mẫu nấm Thượng hoàng) cùng với chuẩn axit amin 
25pmol được thêm vào và thủy phân trong môi trường HCl ở các nồng độ : 
3M; 4M; 5M; 6M; 6,5M ; 7M. Ở nhiệt độ thủy phân 1250C  trong thời gian 24h 


 

 

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi axit amin
TT 

 
 
1 

 
2 

 
3 

4 

Nồng độ 

Axit 

HCl (M) 

amin 

4 

Nồng độ (pmol) 

Cs+mẫu  ­ Cmẫu 

Cos 
(pmol) 

H% 

Cs+mẫu 

Cmẫu 

Val 

78,20105 

58,60855 

19,5925 

25 

78,37 

6 

Val 

77,12652 

53,83017 

23,29635 

25 

93,19 

7 

Val 

94,67967 

82,07970 

12,59997 

25 

50,40 

4 

Ser 

70,0778 

51,12522 

18,95251 

25 

75,81 

6 

Ser 

46,55488 

37,16798 

9,38690 

25 

93,87 

7 

Ser 

80,16694 

60,07444 

20,09250 

25 

80,37 

4 

Gly 

56,85719 

43,16463 

15,69256 

25 

62,77 

6 

Gly 

57,20037 

35,11787 

22,0825 

25 

88,33 

7 

Gly 

71,83441 

59,46321 

12,3712 

25 

49,48 

4 

Leu 

60,70277 

46,69294 

14,00983 

25 

56,04 

6 

Leu 

57,87564 

38,27814 

19,5975 

25 

78,39 

7 

Leu 

75,05681 

61,20772 

14,74909 

25 

59,00 


 

Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl

       Từ đồ thị cho thấy khi nồng độ axit HCl 6M  ở các axit amin đều cho 
hiệu suất thu hồi cao nhất. Từ nồng độ 6­6,5M thì hiệu suất thu hồi ổn 
định và các hiệu suất thu được lớn hơn 90%. Từ kết quả này chúng tôi 
chọn nồng độ axit HCl 6M làm môi trường thủy phân mẫu cho các nghiên 
cứu tiếp theo.


 

3.3.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu
       Để chọn thời gian phù hợp cho sự thủy phân các axit amin, chúng tôi chuẩn bị 
mẫu  nấm  Thượng  hoàng  và  mẫu  nấm  Thượng  hoàng  thêm  chuẩn  25pmol  tiến 
hành  thủy  phân  trong  môi  trường  HCl  6M,  nhiệt  độ  1250C  và  thủy  phân  tại  các 

mốc thời gian khác nhau : 20h, 22h, 24h, 26h.


Bảng 3.2  Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi
TT 

(h) 

amin 

Cs+mẫu 

Cmẫu 

20 

Met 

13,89374 

3,74293 

10,15081 

25 

101,51 

46,39152 

32,79879 

11,59273 

25 

115,93 

31.81972 

7,07722 

24,74251 

25 

98,97 

53.60454 

30,87333 

22,73 

25 

90,92 

173,41949 

164,48299 

8,93650 

25 

89,36 

136.45201 

113,74197 

22.71003 

25 

90,84 

46.55488 

37,16798 

9,38690 

25 

93,87 

115,10768 

104,07405 

11,03318 

25 

110,33 

190.99758 

169,27693 

21.72065 

25 

86.88 

140.40317 

119,86729 

20.53586 

25 

82.14 

24.48210 

0,627899 

23.85420 

25 

95.42 

134.14618 

109,49253 

24.65365 

25 

98.61 

157.45626 

130,81709 

26.63917 

25 

106,56 

136.99577 

114,66710 

22.32867 

25 

89.31 

87.02606 

62,92079 

24.10527 

25 

96.42 

121,07270 

111,74550 

9,32720 

25 

93,21 

22 

1 

24 
26 
20 

2 

 

Met 
Met 
Ser 
Ser 

24 

Ser 

26 

Ser 
Thr 

22 

Thr 

24 

Thr 

26 

Thr 

20 

 

Met 

22 

20 

3 

Ala 

22 

Ala 

24 

Ala 

26 

Ala 

4 

 

Cos 

Axit 

 

 

Nồng độ (pmol) 

Thời gian 

Cs+mẫu  ­ Cmẫu 

(pmol) 

H% 


Hình 3.2: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân

     Kết quả ở hình 3.2 cho thấy khi thời gian thủy phân lớn hơn 22h hiệu 
suất thu hồi bắt đầu ổn định. Thời gian từ 24h­26h cho hiệu suất thu hồi 
tốt nhất, ở 24h cho hiệu suất rất lớn (> 95%). Vậy nên chúng tôi chọn 24h 

là thời gian thủy phân mẫu phân tích.


3.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn
Để  tiến hành xây  dựng  đường  chuẩn  chúng tôi  chuẩn bị  một dãy  dung 
dịch  chuẩn  có  nồng  độ:  10pmol,  25pmol,  100pmol  để  xác  định  khoảng 
tuyến tính của các axit amin. Kết quả đo được như sau:


Bảng 3.3:  Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/     )
l
của axit amin
TT 

Axit 

Nồng 

Diện tích 

Nồng 

Diện tích 

amin 

độ 

1 

Asp 

10 

918,90765 

25 

1710,64294 

100 

5496,87207 

2 

His 

10 

510,25375 

25 

1177,97742 

100 

4722,54395 

3 

Thr 

10 

948,26996 

25 

2164,69751 

100 

8251,57422 

4 

Tyr 

10 

878,52673 

25 

2247,63525 

100 

8347,11035 

5 

Ile 

10 

1316,59045 

25 

3005,27686 

100 

11251,700 

6 

Glu 

10 

570,48480 

25 

1088,09412 

100 

4358,87207 

7 

Ser 

10 

1021,77795 

25 

2183,39722 

100 

8127,51758 

8 

Gly 

10 

1089,90881 

25 

2269,00244 

100 

8475,58496 

9 

Ala 

10 

1964,74426 

25 

4545,54541 

100 

12645,000 

10 

Cys­

10 

278,71521 

25 

746,77118 

100 

2604,47350 

độ 

Nồng 

Diện tích 

độ 

ss­cys 
11 

Val 

10 

1036,72620 

25 

2218,25806 

100 

8452,68523 

12 

Met 

10 

1049,86084 

25 

2753,15942 

100 

10393,100 

13 

Phe 

10 

725,73773 

25 

1790,02100 

100 

6737,20166 

14 

Leu 

10 

1069,91785 

25 

2494,30664 

100 

9461,74219 

15 

Lys 

10 

348,24469 

25 

912,37457 

100 

3495,46118 

16 

pro 

10 

1648,60986 

25 

4539,64209 

100 

6955,32373 


Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 10pmol

Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 25pmol

Hình 3.5: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn các axit amin ở nồng độ 100pmol

 


 

      

 y = 103.81416x + 38.54980
R2 =0,99988

y = 81,82352x + 83.06823
R2 = 0,99989

y = 81,82352x + 83.06823
R2 = 0,99989

Hình 3.6: Đường chuẩn định lượng Met        Hình 3.7: Đường chuẩn định lượng 
Thr          

       Hình 3.8: Đường chuẩn định lượng Ser       Hình 3.9: Đường chuẩn định lượng Ile    


 

3.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
LOD

3 SD
a

                   LOQ

10 SD
a

10 LOD
 
3

   
n
i 1

SD

 

x) 2

( xi

n

( xi

i 1

n 1

k

x) 2

 

Tiến hành đo lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ chuẩn ta có bảng giá trị LOD và 
LOQ của Aspartic như sau:
Bảng 3.4: Giá trị LOD và LOQ của axit Aspartic
Nồng độ đo được
Nồng độ chuẩn
(pmol)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

10

12,29757

12,20815

12,21738

0,04015

25

24,08097

24,10468

24,06121

0,01777

100

99,04614

99,11618

99,14143

0,04030

SD

SD(tb)

LOD
Pmol

LOQ
Pmol

0,03274

0,0019

0,0063


Bảng 3.5: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

 

TT 

Axit amin 

LOD (pmol) 

LOQ (pmol) 

1 

Asp 

0,0019 

0,0063 

2 

Glu 

0,0027 

0,0090 

3 

Ser 

0,0021 

0,0070 

4 

His 

0,0060 

0,0200 

5 

Gly 

0,0037 

0,0125 

6 

Thr 

0,0025 

0,0084 

7 

Ala 

0,0006 

0,0020 

8 

Try 

0,0046 

0,0153 

9 

Cys­ss­cys 

0,0029 

0,0097 

10 

Val 

0,0036 

0,0120 

11 

Met 

0,0010 

0,0033 

12 

Phe 

0,0022 

0,0073 

13 

Ile 

0,0013 

0,0043 

14 

Leu 

0,0014 

0,0047 

15 

Lys 

0,0015 

0,005 

16 

Pro 

0,0029 

0,0097 


 

3.5. Độ thu hồi của phương pháp
       Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực cùng với làm mẫu thực 

không thêm chuẩn song song chúng tôi tiến hành tính độ thu hồi như sau :
      Hiệu suất thu hồi

H%

Cs

m

C so

Cm

100

      Tiến hành thí nghiệm trên nấm Thượng hoàng, nấm Thượng hoàng 
thêm chuẩn 25pmol, thực hiện phân tích 5 lần lặp lại và lấy kết quả 
trung bình. Các kết quả được chỉ ra ở bảng 3.6.