Nghiên cứu hệ thống tái sinh In vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu nho nhe (Vigna Umbellata) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THU TRANG

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU NHO NHE
(VIGNA UMBELLATA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

VŨ THU TRANG

NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH IN VITRO
PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐẬU NHO NHE
(VIGNA UMBELLATA)
Ngành: Di truyền học
Mã số: 8.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ ii thông tin – ĐHTN




LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nội dung trình bày trong luận văn là kết quả nghiên cứu
của tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của GS.TS Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết
quả sử dụng trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

Xác nhận của BCN Khoa

Xác nhận của cán bộ hướng dẫn

Nguyễn Thị Tâm

GS.TS. Chu Hoàng Mậu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn,
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành
bản luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của Đề tài khoa học-công nghệ cấp Bộ
Giáo dục & Đào tạo mang mã số B2017-TNA-38 do GS.TS Chu Hoàng Mậu làm
chủ nhiệm.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục
sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã tạo
điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa học
này.
Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên và
giúp đỡ trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này.

Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ ii thông tin – ĐHTN




MỤC LỤC
Tran
g
Lời

cam

đoan………………………………………………………….......
Lời

cảm

ơn…………………………………………………………….......
Mục
Danh mục hình…………………………………………………................
mục

bảng………………………………………………………........
Danh

mục

chữ

viết

tắt………………………………………………..........
Mở

ii

iii

lục…………………………………………………………………....
Danh

i

đầu

………………………………………………………………........

iv
v

vi

1

1. Đặt vấn đề ……………………………………………………...............

1

2. Mục tiêu nghiên cứu ……………………………………………….......

2

3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………...............

2

Chương 1. Tổng quan tài liệu……………………………………….......

3

1.1. Cây đậu Nho nhe…………………………………………………......

3

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe……......

4

1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe....................

6

1.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................................................

8

1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy in vitro mô tế bào thực
vật...............................................................................................................
.
1.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật……………………………….

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

8
9




1.2.3. Các yếu tố đảm bảo thành công trong quá trình nuôi cấy mô tế bào

thực

13

vật…………………………………………………………………....
1.3. Hệ thống tái sinh cây in vitro phục vụ chuyển gen ở cây họ Đậu........

15

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu....................................

18

2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên

18

cứu……………………….......
2.1.1. Vật liệu thực

18

vật…………………………………………………....
2.1.2.

Hóa

chất,

thiết

bị………………………………………………........
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.....................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ iv thông tin – ĐHTN

18
19




2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………......

19

2.2.1. Phương pháp khử trùng hạt, tạo cây con nuôi cấy in vitro................

19

2.2.2. Tái sinh chồi đậu Nho nhe từ mô sẹo…………………....................

20

2.2.3. Tái sinh đa chồi đậu Nho nhe từ lá mầm và chồi ngọn….................

21

2.2.4. Môi trường ra rễ………………………………………………........

22

2.2.5. Ra cây và chế độ chăm sóc………………………………………....

23

2.2.6. Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu…………………....

24

Chương 3. Kết quả và thảo luận………………………………..............

25

3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt đậu Nho nhe…………………......

25

3.2. Tái sinh in vitro cây đậu Nho nhe……………………………………

28

3.2.1. Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ mô sẹo………………………….

28

3.2.2. Tái sinh chồi cây đậu Nho nhe từ nách lá mầm và chồi ngọn….......

29

3.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh chồi từ chồi ngọn in vitro............

33

3.2.4. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro……….....

37

3.3. Chuyển cây in vitro ra môi trường tự nhiên……………………….....

39

Kết luận và đề nghị…………………………………………………........

42

1. Kết luận…………………………………………………………….......

42

2. Đề nghị……………………………………………………………........

42

Tài liệu tham khảo…………………………………………….................

43

Phụ lục ………………………………………………………..................

48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC HÌNH
Tran
g
Hình

Cây

1.1.

đậu

Nho

nhe…………………………………………….....
Hình

2.1.

Sơ

đồ

thí

nghiệm

tổng

quát.........................................................
Hình 3.1. Hạt đậu Nho nhe nảy mầm trên môi trường GM……………....
Hình 3.2. Hình ảnh mô sẹo từ mảnh lá sau 3 tuần nuôi cấy trên môi
trường có bổ sung 2,4-D 1mg/l…………………………………………
Hình 3.3. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trường SIM sau 4
tuần…………….....

6

19
27
29

29

Hình 3.4. Nách lá mầm được nuôi cấy trên môi trường cảm ứng chồi
SIM……………………………………………………………………...

30

..
Hình 3.5. Hình ảnh đa chồi từ chồi ngọn sau 4 tuần nuôi cấy…………....

31

Hình 3.6. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ tạo đa chồi của chồi ngọn dưới tác động
của

BAP

và

kinetine

sau

8

32

tuần………………………………….................
Hình 3.7. Tái sinh chồi từ chồi ngọn trên môi trường SIM sau 4
tuần……………………………………………………………………

33

…..
Hình 3.8. Hình ảnh chồi đậu Nho nhe trên môi trường chứa BAP
1,5mg/l.………………………………………………………………

34

…..
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Hình 3.9. Cụm chồi nuôi cấy trên môi trường tái sinh chồi với BAP
1,5mg/l sau 4 tuần ……………………………………………………
Hình 3.10. Cây đậu Nho nhe trên môi trường chứa IBA

37

39

0,3mg/l…………
Hình 3.11. Cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh để ra bầu đất………………

40

Hình 3.12. Cây tái sinh in vitro hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất
chứa giá thể đất thịt, trấu hun tỷ lệ 2:1 sau 2

41

tuần…………………………….....

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




DANH MỤC BẢNG
Trang

Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy dùng cho hệ thống
tái

sinh

cây

từ

chồi
23

ngọn…………………………………………………
Bảng

2.2.

Giá

thể

nuôi

cây.........................................................................

24

Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ Javen và thời gian khử trùng đến sự
nảy mầm của hạt đậu Nho nhe sau 7 ngày nuôi cấy……………………...

26

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi của cây đậu Nho
nhe…..............................................................................................................

35

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ IBA tới khả năng tạo rễ của chồi tái
sinh………………………………………………………………………

38

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của giá thể tới sức sống của cây đậu Nho nhe tái
sinh

in

vitro……………………………………………………………………

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

40




DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D :

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

ARN

:

Ribonucleic Acid

BAP

:

6-Benzylaminopurine

CS

:

Cộng sự

CT

:

Công thức

ĐC

:

Đối chứng

GM

:

Germination Medium

IAA

:

Indole-3-acetic acid

IBA

:

Indole-3-butyric acid

Kinetin :

6-furfurylaminopurine

MS

Murashige và Skoog, 1962

:

NAA :

Naphthalene acetic acid

ND

:

Nước dừa

RM

:

Rooting medium

SEM

:

Shoot Elongation Medium

SIM

:

Shoot Induction Medium

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Đậu Nho nhe có tên khoa học Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & Ohashi
thuộc họ Đậu (Fabaceae) hay thường được gọi là đậu gạo, đậu nâu. Loài đậu
này được phát hiện lần đầu tiên ở Ấn Độ, sau đó được Ohwi và Ohashi miêu tả
khoa học đầu tiên vào năm 2010. Đậu Nho nhe phân bố khá rộng từ miền Nam
Trung Quốc sau đó lan rộng ra miền Bắc Việt Nam, Lào, Thái Lan,...Ở nước
ta, đậu Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao
Bằng, Lào Cai, Yên Bái...
Ðậu đỗ nói chung và đậu Nho nhe nói riêng là nhóm cây có giá trị dinh
dưỡng cao, đóng vai trò thiết yếu để nâng cao tiêu chuẩn thực phẩm cho con
người đặc biệt ở những nước đang phát triển trong tình trạng thiếu hụt protein.
Ðậu Nho nhe thường được sử dụng làm thức ăn cho người và vật nuôi, là cây
một năm, hệ rễ phát triển mạnh, có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm
nên thường được trồng luân canh với lúa và ngô để tăng vụ và cải tạo đất bạc
màu chống xói mòn. Đậu Nho nhe là cây sinh trưởng rất nhanh, sau 3 tháng có
thể phủ kín đất, đặc biệt hàm lượng dinh dưỡng trong thân và lá cao, làm phân
bón rất tốt. Một số những nghiên cứu gần đây, còn cho thấy đậu Nho nhe ngoài
là cây lương thực thiết yếu còn có tác dụng trong việc chữa bệnh. Ở Trung
Quốc, đậu Nho nhe được dùng như một loại dược liệu để chữa các bệnh liên
quan đến đau nhức xương khớp, hay sắc uống để giải độc, giảm phù nề [41].
Tuy nhiên, các cây trồng thuộc họ Đậu có khả năng chống chịu kém đối
với các tác nhân bất lợi từ ngoại cảnh và khả năng này ngày càng bị suy giảm
nghiêm trọng do biến đổi khí hậu. Do vậy nghiên cứu tìm biện pháp cải thiện
khả năng chống chịu của cây họ Đậu nói chung và cây đậu Nho nhe nói riêng
được quan tâm và mang tính thời sự.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Có nhiều cách tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả năng chống chịu của cây
họ Đậu bằng lai hữu tính, đột biến thực nghiệm và công nghệ gen. Trong đó
ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để làm tăng khả năng chống chịu các stress phi
sinh học là một hướng tiếp cận có triển vọng. Việc xây dựng hệ thống tái sinh
là một trong những giai đoạn có ý nghĩa quan trọng và quyết định rất lớn đến
sự thành công của kỹ thuật chuyển gen. Đối với các cây họ Đậu như đậu tương,
đậu xanh, đậu cove việc xây dựng hệ thống tái sinh in vitro đã được nghiên cứu
và khẳng định. Còn đối với đậu Nho nhe, một loài cây hai lá mầm có thể tái
sinh trong ống nghiệm hay không, tái sinh từ bộ phận nào của cây, công thức
môi trường thích hợp cho tái sinh đa chồi. Đây là những câu hỏi đặt ra cho
nghiên cứu này.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn thạc
sĩ là: “Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây đậu
Nho nhe (Vigna umbellata)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hệ thống tái sinh đa chồi in vitro phục vụ chuyển gen ở cây
đậu Nho nhe.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt để tạo mẫu sạch trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tái sinh đa chồi in vitro qua mô sẹo, nách lá mầm, chồi ngọn.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng BAP, kinetin đến sự
tạo đa chồi ở cây đậu Nho nhe.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro.
- Nghiên cứu điều kiện chuyển cây đậu Nho nhe in vitro ra ngoài môi trường tự
nhiên.

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY ĐẬU NHO NHE
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học của đậu Nho nhe
Đậu Nho nhe có những tên khác như: đậu gạo, đậu nâu, đậu Cao Bằng,
đậu đà, thua dài.... Tên khoa học của đậu Nho nhe là Vigna umbellata (Thunb.)
Ohwi & Ohashi. Đậu Nho nhe thuộc chi Đậu (Vigna), họ Đậu (Fabaceae), bộ
Đậu (Fabales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ là
Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotrophic, Lasionspron,
Sigmoidotrotopis. Đậu Nho nhe theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc
hai chi phụ là Vigna và Ceratotrophic. Chi phụ Ceratotrophic còn được gọi là
nhóm đậu Châu Á mang những mức độ điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất
cho Vigna. Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong 16 loài của Ceratotrophic
đã được thuần hóa là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczel), đậu gạo (Vigna
umbellata (Thunb.)), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna
aconiti (Jacp)), Vigna trilobala (L.) Wilczel.
Đậu Nho nhe là dạng cây thân thảo, có thể mọc thẳng đứng, bán thẳng
hoặc xoắn có dây leo, thường có chiều dài từ 30-100 cm, một số loài có thể cao
đến 200 cm. Thân cây có rãnh, phân nhánh. Khi cây còn non có lông ngắn, mịn,
trắng phát triển bao phủ, lông này sẽ rụng dần khi cây lớn lên.
Lá của đậu Nho nhe phần lớn là mọc cách, thường là lá kép ba lá chét, lá
kèm hình ngọn giáo, chiều dài của lá từ 6-9 cm, cuống lá dài từ 5-10 cm. Hệ
thống rễ của đậu Nho nhe phát triển mạnh mẽ, rễ cái có thể cắm sâu xuống đất
100-150 cm có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm.

Hoa thường có màu vàng tươi hoặc vàng nhạt. Cụm hoa hình chùm mọc
ra từ nách lá. Hoa lưỡng tính, đều hoặc không đều, mẫu 5. Hoa thường có 10
nhị, màng hạt phấn có 3 rãnh - lỗ. Bộ nhụy gồm có 1 noãn với nhiều noãn đảo
hay cong.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Quả của đậu Nho nhe dài hình dải cong, mọc đứng dài từ 7,5-12,5 cm,
rộng 4- 6 mm, chứa khoảng 6-10 hạt. Hạt đậu dài 6-8 mm, rốn hạt lõm. Hạt đậu
Nho nhe có màu sắc đa dạng: vàng lục, vàng nâu, nâu, đen, đốm hoặc màu rơm.
Các hạt màu vàng lục thường trở thành màu nâu vàng trong quá trình lưu trữ.
Hạt màu vàng nâu được cho là có giá trị dinh dưỡng cao hơn cả.
Đậu Nho nhe phát triển nhanh vào mùa hè. Ở Ấn Độ và Nepal, đậu Nho
nhe được gieo vào tháng 2, tháng 3 để thu hoạch vào mùa hè và tháng 7, tháng
8 để thu hoạch vào tháng 12. Thời kỳ sinh trưởng của cây thay đổi tùy theo
giống và vùng địa lý. Khi được trồng ở Ăng-gô-la (vĩ độ 6°-17°S), theo báo
cáo, cây trưởng thành sau 60 ngày kể từ khi gieo hạt, nhưng ở Tây Bengal ở
bán cầu bắc, cây trồng cần khoảng 130 ngày để tạo ra năng suất hạt giống kinh
tế [40].
Đậu Nho nhe là một cây họ đậu linh hoạt có thể phát triển ở vùng cận nhiệt
đới ẩm đến khí hậu ôn đới ấm áp và mát mẻ. Cây không chịu được sương giá
nhưng chịu được nhiệt độ cao, thường được tìm thấy mọc ở những khu vực có
nhiệt độ trung bình từ 18-30°C. Phạm vi nhiệt độ cho sự tăng trưởng là 10-40°C
với mức tối ưu trong khoảng từ 18-30°C. Đậu Nho nhe phát triển tốt ở vùng
khí hậu ẩm ướt và mặc dù có khả năng chịu hạn tốt, nhưng để có năng suất tốt,
nó đòi hỏi lượng mưa hàng năm là 1000-1500 mm. Phạm vi lượng mưa hàng
năm được báo cáo cho cây tăng trưởng là 300-2000 mm với mức tối ưu trong
khoảng 700-1500 mm. Đậu Nho nhe phát triển mạnh trong điều kiện ánh sáng

đầy đủ, sự tăng trưởng của nó có thể bị cản trở nếu trồng xen canh với cây trồng
khác chẳng hạn như ngô, lúa [40].
Loài đậu này có thể được trồng trên nhiều loại đất, cả những loại đất thoái
hóa, khô cằn, nghèo dinh dưỡng nhưng để có năng suất tối ưu, nó đòi hỏi phải
có đất màu mỡ. Tuy nhiên, độ phì nhiêu của đất cao có thể cản trở sự hình thành
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




quả và làm giảm năng suất hạt. Phạm vi pH đất cho sự tăng trưởng là 5,5-8 với
mức tối ưu trong khoảng 6-7,5.
Đậu Nho nhe là một loại cây khỏe mạnh, có khả năng chống lại nhiều loại
sâu bệnh, nó không cần phân bón hoặc chăm sóc đặc biệt trong quá trình tăng
trưởng. Nó có nguồn gốc từ châu Á, được tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ và miền
trung Trung Quốc sau đó lan sang Malaysia. Loài đậu này được người Ả Rập
đưa vào Ai Cập, dọc theo bờ biển phía Đông châu Phi và các đảo Ấn Độ
Dương. Ngày nay, đậu Nho nhe được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới châu
Á, ít được trồng ở Hoa Kỳ, Úc, Tây Nam châu Á, vùng nhiệt đới châu Phi và
châu Mỹ. Ở các cùng nhiệt đới châu Phi, nó được trồng ở Tây Phi, Đông Phi
và các đảo Ấn Độ Dương, và ít gặp hơn ở Trung và Nam Phi. Ở nước ta, đậu
Nho nhe được trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Cao Bằng, Lào
Cai, Yên Bái,...
Hiện nay, chưa có số liệu cụ thể về tình hình sản xuất đậu Nho nhe, tuy
nhiên loài đậu này được sản xuất chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, Nhật Bản
là nước nhập khẩu chính, các nhà xuất khẩu chính là Thái Lan, Myanmar và
Trung Quốc. Madagascar cũng là một trong những nước xuất khẩu chính đậu
Nho nhe. Xuất khẩu trung bình hàng năm từ năm 1998-2000 ước tính là 1100
triệu tấn [40].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Hình 1.1. Cây đậu Nho nhe (ảnh chụp của tác giả tại vườn thí nghiệm Khoa
Sinh học, 6/2018)
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng của đậu Nho nhe
Đậu Nho nhe là một loại đậu ít được biết đến và chưa được sử dụng đúng
cách. Tuy nhiên, gần đây loại đậu này đã gây được sự chú ý nhờ giá trị tiềm
năng về mặt dinh dưỡng của nó. Chất lượng dinh dưỡng của hạt đậu Nho nhe
cao hơn so với nhiều loại đậu khác thuộc họ Vigna. Trong nghiên cứu hiện tại,
16 kiểu gen khác nhau của hạt đậu Nho nhe đã đánh giá được các thành phần
dinh dưỡng chính là: hàm lượng protein, chất béo tổng hợp, chất xơ,
carbohydrate, vitamin, khoáng chất, axit amin và axit béo [28]. Hạt đậu Nho
nhe khô chứa nước 13,3%, protid 20,9%, lipid 0,9%, glucid 64,9%, xơ 4,8%,
tro 4,2%, 100g cung cấp năng lượng là 1373KJ. Ðậu gạo còn chứa nhiều Ca,
Fe, P và các loại vitamin của nhóm B như thiamin, niacin, riboflavin. Nghiên
cứu gần đây cho thấy đậu Nho nhe có hàm lượng Ca cao so với các loại cây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




trồng họ Đậu khác tốt cho các bà mẹ đang cho con bú. Protein cô đặc được điều
chế từ hạt đậu đã cho thấy tác dụng chống tăng huyết áp ở chuột đồng
Botrytiscinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani và Mycosphaerella
arachidicola [16]. Hơn nữa, nó đã cho thấy giảm thiểu và chống lại hoạt động
sao mã ngược của HIV-1 [18]. Ở Ấn Độ lá đậu Nho nhe cùng với bột gạo được
dùng làm thuốc đắp vào bụng để trị đau dạ dày.Tuy nhiên, các yếu tố chống

dinh dưỡng cũng tìm thấy trong hạt đậu Nho nhe bao gồm các yếu tố ức chế
trypsin, phytates, tannin và oligosacarit. Việc ngâm, tách vỏ, nảy mầm và nấu
chín có thể làm giảm đáng kể các yếu tố chống dinh dưỡng này [33], [34].
Đậu Nho nhe là một cây họ đậu đa năng, không phổ biến như các loại đậu
khác: đậu đũa (Vigna unguiculata), đậu adzuki (Vigna angulari) và đậu xanh
(Vigna radiata), đậu Nho nhe lại là một loại thực phẩm quan trọng và thiết yếu
trong dinh dưỡng của con người ở các nước đang phát triển, thiếu hụt nguồn
dinh dưỡng trong thức ăn như: Ấn Độ, Nepal, Thái Lan… trong đó có Việt
Nam đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Yên Bái, Cao Bằng…).
Tất cả các bộ phận của cây đậu đều có thể ăn được và sử dụng trong các
chế phẩm thức ăn. Hạt khô có thể luộc ăn với cơm hoặc chúng có thể thay gạo
khi hầm hoặc nấu súp. Ở một số nước, hạt này được xay ra để tạo thành loại
bột dinh dưỡng có trong thức ăn dành cho trẻ em. Quả non, lá, rau mầm được
luộc và ăn như rau. Quả non đôi khi còn để ăn sống. Đậu Nho nhe rất hữu ích
cho chăn nuôi. Những thứ còn lại sau thu hoạch như thân cây, lá, hạt… có thể
để tươi hoặc phơi khô sử dụng làm thức ăn cho ra súc.
Đậu Nho nhe được dùng để làm phân xanh, nó mọc rất nhanh và che phủ
kín mặt đất như một hàng rào sống hay hàng rào sinh học. Ở những ngọn đồi ở
vùng biên giới Nepal, người nông dân dùng cây đậu với hai mục đích chính là
làm thức ăn cho gia súc, cải tạo các loại đất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1.2. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

1.2.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Tính toàn năng của tế bào
Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang thông tin di truyền giống nhau.

Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau. Các tế bào
được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng,
lá mầm, đoạn thân, rễ…) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn
chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường. Quá trình
này có thể thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính và được
nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp có bổ sung các chất kích thích
sinh trưởng cần thiết. Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả
năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là phát triển thành tế bào mô
sẹo. Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân
hoá thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh. Khả năng đó gọi là tính toàn năng
của tế bào [9], [14].
Phản biệt hóa và tái biệt hóa
Quá trình tái sinh được chia làm hai giai đoạn: phản biệt hóa và tái biệt hóa.
Phản biệt hóa là giai đoạn đưa tế bào từ trạng thái đã biệt hóa trở lại trạng
thái chưa biệt hóa. Các tế bào đã biệt hóa là những tế bào có chức năng nhất
định và có cấu trúc phù hợp để hoàn thành chức năng ấy. Quá trình phản biệt
hóa biến tế bào đã biệt hóa thành những tế bào có hình thức giống như những
tế bào ở đỉnh sinh trưởng (tế bào mầm phôi), chúng có đặc điểm: tế bào đậm
đăc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thước tế bào lớn. Những
tế bào như vậy coi như đã được phản biệt hóa xong và trong những điều kiện
nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới. Các mô phản biệt hóa
cần nuôi trên môi trường chứa các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Auxin gồm: 2,4-D, α-NAA, IAA, IBA [7].
Tái biệt hóa là giai đoạn tế bào đã phản biệt hóa phát triển thành cây hoàn
chỉnh và chỉ có các tế bào phôi mới có thể hình thành cơ thể mới [7].

Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản biệt
hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào
càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy
ra quá trình biệt hóa và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào
thần kinh ở động vật. Người ta đã chứng minh rằng: những tế bào càng gần
trạng thái của phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy
nhiêu [1].
1.2.2. Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các
thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Đầu những năm 20 đã
có một số công trình sử dụng môi trường dinh dưỡng tổng hợp, ngoài muối
khoáng và nguồn cacbon còn bổ sung thêm vitamin và một số chất khác [7].
Trong những năm 60, nhiều môi trường nuôi cấy đã được xây dựng và được sử
dụng cho đến nay chỉ cần cải tiến chút ít. Đó là các môi trường White, Knop
(1953), Môi trường giàu chất dinh dưỡng Murashige - Skoog (1963) [23], Môi
trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình Gamborg (1968) [8].
Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ
phận nuôi cấy. Tùy theo mục đích nuôi cấy muốn duy trì mô ở trạng thái mô
sẹo, muốn tạo rễ, tạo mầm hay muốn tái sinh cây hoàn chỉnh, môi trường nuôi
cấy phải thay đổi nhiều hay ít. Tuy vậy, tất cả các môi trường nuôi cấy bao giờ
cũng có các thành phần chính gồm: muối khoáng, cacbon, vitamin, các chất
điều khiển sinh trưởng, các nhóm chất bổ sung, chất độn [7].
Các nguyên tố khoáng đa lượng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Là những nguyên tố muối khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30ppm,
tức là trên 30mg/l, bao gồm các nguyên tố sau: N, P, S, K, Mg, Ca. Các nguyên

tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào và xây dựng
lên thành tế bào.
Các nguyên tố vi lượng
Các nguyên tố vi lượng được coi là cơ sở của sự sống bởi vì hầu hết các
quá trình tổng hợp chuyển hóa các chất đều được thực hiện nhờ các enzyme mà
trong thành phần của enzyme đều có các nguyên tố vi lượng. Ngoài ra, các
nguyên tố vi lượng còn có tác động sâu sắc đến quá trình quang hợp, hô hấp,
hấp thụ nước…Tuy nhiên, nhu cầu muối khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô
thực vật là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu, rất ít các nguyên tố vi lượng được
chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào. Vì
vậy, sự cung cấp các nguyên tố vi lượng và nồng độ của chúng trong các môi
trường nuôi cấy hầu hết là dựa vào kinh nghiệm, trong các trường hợp cụ thể
là không cần thiết.
Trong nuôi cấy mô thực vật, những nguyên tố vi lượng được sử dụng ở
nồng độ thấp hơn 30 ppm. Bao gồm: Fe, B, Mn, I Mo, Cu, Zn, Ni, Co.
Nguồn cacbon
Hầu hết các mẫu mô nuôi cấy là dị dưỡng, không có khả năng tổng hợp
cacbon. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều
kiện bắt buộc. Trong phần lớn các môi trường nguồn cacbon và năng lượng chủ
yếu là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng nhiều hơn cả.
Các loại đường khác như fructose, lactose, galactose… cũng đã được thử
nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được sử dụng trong những trường hợp
đặc biệt.
Vitamin
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




Mặc dù các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự

tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do
đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài, đặc biệt các vitamin thuộc nhóm B như:
Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B6. Myo-inositol cũng hay được sử dụng vì
nó có vai trò quan trọng trong việc sinh tổng hợp thành tế bào.
Các chất kích thích sinh trưởng
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả
cũng như sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro. Nó ảnh hưởng
trực tiếp tới sự phản biệt hóa, tái biệt hóa và sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là
sự biệt hóa các cơ quan như chồi và rễ. Nhu cầu về chất kích thích sinh trưởng
đối với từng loài cây qua từng giai đoạn nuôi cấy là khác nhau. Vì vậy, để nuôi
cấy in vitro thành công cần phải tiến hành các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng
độ cũng như tỷ lệ các chất kích thích sinh trưởng phù hợp.
Người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó
là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic. Những chất này được phân
thành các nhóm vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên
tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu mà chúng có những tác động chồng chéo
và hỗ trợ nhau. Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng
nhất định. Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất
điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin, giberelin. [11], [13].
Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lí
học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất. Auxin là những hoocmon thực
vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu
tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hóa màng tế bào. Nhóm
auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), αnaphtylaxetic axit (NAA), Indotaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




nhưng có tác dụng kích thích quá trình phânchia tế bào và thường được sử dụng

nhiều nhất, NAA có tác dụng tạo rễ cho cây non [11], [13].
Nhóm cytokinin là nhóm chất hóa học có ảnh hưởng quyết định đến kích
thích phân chia tế bào. Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl
amino purine (BAP); 6-Dimethylalylamnino purine(2iP); Zeatin. Hiện nay một
thế hệ mới của chất điều hòa sinh trưởng, chẳng hạn như thidiazuron (TDZ) –
một cytokinin thuộc các phenylureas, đang nổi lên như là một thay thế thành
công cho tái sinh trực tiếp với tần số cao của phôi vô tính [17], [26].
Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua quá trình nghiên cứu bệnh
nấm lúa von. Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể
cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng. Đại
diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông
nghiệp [11], [13].
Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của
cây nhưng gần đây nó mới được coi là hoocmon thực vật. Ethylen thường được
sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng
đến quá trình phân bào. Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ
kéo dài khả năng ra rễ của thân [11], [13]
Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng
đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây
ngắn ngày thông qua việc tổng hợp ARN và protein [11], [13].

Chất phụ gia
Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp
dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các chất có hoạt tính trong
nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-insitol và một số amino acid khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

Nước dừa được sử dụng để kích thích sự phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều
loài cây. Nước dừa thường được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản.
Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự
nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật.
Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong
nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu là tạo điều kiện tối cho môi trường nuôi
cấy, có tác dụng hấp thụ các chất độc và các chất ức chế sinh trưởng thực vật
như các hợp chất phenolic, dịch rỉ nâu sinh ra từ môi trường nuôi cấy. Những
chất này gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay
đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích
thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Ngoài ra, than hoạt tính cũng có thể
hấp thụ các vitamin, cytokinin và auxin, làm thay đổi tỉ lệ thành phần các chất
có trong môi trường nuôi cấy cũng như pH môi trường.
1.2.3. Các yếu tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Vật liệu nuôi cấy
Tất cả các mô chưa hóa gỗ đang sinh trưởng mạnh như: mô phân sinh ngọn,
tượng tầng, đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non,… khi đặt vào môi trường
có chứa một lượng hoocmon thích hợp đều có khả năng tạo mô sẹo. Tuy nhiên,
mỗi tế bào ở mỗi mô khác nhau có khả năng tạo mô sẹo, phân hóa thành rễ, thân,
cành, lá,… rất khác nhau. Do đó việc chọn mẫu thực vật để sử dụng trong quá
trình nuôi cấy có vai trò quyết định. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, để bắt đầu
nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định, người ta chú trọng đến các chồi
bên và mô phân sinh đỉnh [3].
Vô trùng trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng và vitamin, thích hợp
cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển. Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong quá
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN