Đa dạng di truyền đoạn siêu biến 1 và đoạn siêu biến 2 trên DNA ty thể của dân tộc Mường ở Việt Nam

TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

ĐA DẠNG DI TRUYỀN ĐOẠN SIÊU BIẾN 1 VÀ ĐOẠN SIÊU BIẾN 2
TRÊN DNA TY THỂ CỦA DÂN TỘC MƯỜNG Ở VIỆT NAM
Nguyễn Thu Thúy, Trần Thúy Hằng, Tạ Thành Văn,
Nguyễn Đức Hinh, Trần Vân Khánh
Trư ng
h YH N
ng
nt 2 - H

tr
n
n
n 1 (H
r r
g nt 1 - H
- )
n
n 2 (H
r r
g- )
g n t th ư t tr ng ngh n
ng ụng tr ng nh g
ng tr
n
t n
h
n th ngư
h n
n nh t th g

nh g n
nh h
t th ng Tr ng ngh n
n
h ng t
nh t nh
h nh ng g n H
H
- tr n 100
ngư
nt
ư ng ng hương h
g tr nh t g n
t
ngh n
t th 22 h
gr
h
gr
1
t
nh t 1
h
gr
1 10
5
2
9
5
4 4

4
4
2 10
N9
2
H
gr
5 1
2
t
th nh t
h
1 T
NP
2
100
15 n C
92
09 n C 59
09 n CC 12 T1 1 9C
2
t
n
nh g
ư
ng tr
n ng
g nH
H
- tr n 100

ngư
nt
ư ng
t n h n h nh ng
tr nh t
ng g n H
H
nt
ư ng
ư ng
n
Từ khóa: DNA ty thể, vùng gen HVS - I, vùng gen HVS - II, dân tộc Mường

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bộ gen ty thể của người đã được nghiên cứu từ
cách đây hơn 30 năm và được công bố lần đầu tiên vào
năm 1981 [1], sau đó được chỉnh sửa lại vào năm 1999
[2]. Đây là bộ gen ty thể của đại diện người da trắng và
được coi là trình tự chuẩn đối chứng. Cho đến nay đã
có hàng trăm công trình nghiên cứu về của bộ gen ty thể
người thuộc các chủng tộc khác nhau đã được công bố.
Bộ gen ty thể người là phân tử DNA có cấu trúc dạng
mạch vòng, bao gồm 37 gen với 16 569 bp mã hóa cho
13 polypeptide tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào, 22
tRNA và 2 rRNA. Trong đó vùng siêu biến 1 và 2 (HVS I và HVS - II) có trình tự thay đổi theo thời gian và khác
nhau giữa các vùng địa lý [3]. Sự khác biệt về trình tự
của bộ gen ty thể có ý nghĩa quan trọng không chỉ trong
nghiên cứu lịch sử mẫu hệ của con người hiện đại mà
còn trong việc xác định các mối quan hệ về chủng tộc
và các vùng địa lý khác nhau. Những khác biệt về trình

tự mtDNA ở những vùng mã hóa còn cho biết quá trình
chọn lọc tự nhiên có ảnh hưởng quyết định đến quá
trình tiến hóa của bộ gen ty thể [3,4]. Các nghiên cứu
này cho thấy trình tự DNA ty thể của các chủng tộc
khác nhau có những khác biệt nhất định. Trong số các
h n h Tr n n h nh Tr ng t
Pr t n trư ng
h YH N
n h nh
h
Ng nh n 2
2014
Ng
h th n 1 11 2014

24

Ngh n

n-

trình tự hoàn chỉnh của bộ gen ty thể đã được công bố
không chỉ có các tộc người ở châu Âu và châu Phi mà
còn có các tộc người ở khu vực châu Á như Nhật Bản,
Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Mã Lai và Thái Lan là
những tộc người có quan hệ chủng tộc và địa lý gần gũi
với người Việt Nam [4 - 8].
Đề tài được tiến hành với mục tiêu: xác định đa dạng
di truyền của đoạn siêu biến 1 và đoạn siêu biến 2 trên
DNA ty thể của dân tộc Mường ở Việt Nam.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Nguyên liệu
- 100 mẫu máu của 100 người dân tộc Mường, sống tại
tỉnh Hòa Bình.
- Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được mua
của các hãng QIAGEN, Sigma, ABI.
2. Phương pháp
- 100 mẫu DNA được tách chiết từ các mẫu máu theo
phương pháp sử dụng enzym protease K và phenol:
chloroform: isoamyl alcohol.
- Hai vùng gen HVS - I và HVS - II được khuếch đại
bằng phương pháp PCR, sử dụng các cặp mồi đặc
hiệu:
HVSI-F: 5’- CTC CAC CAT TAG CAC CCA AAG C -3’
HVSI-R: 5’- CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG -3’
HVSII-F: 5’- GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C -3’
HVSII-R: 5’- CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A -3’
Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20µl) gồm:


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
1X đệm PCR; 2,5mM dNTP; 0,2µl mồi xuôi và ngược;
0,5unit Taq polymerase; 50ng DNA và H2O.

III. KẾT QUẢ

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC - 5 phút;
30 chu kỳ [94oC - 30 giây, 54oC - 30 giây, 72oC - 30
giây]; 72oC - 5 phút; bảo quản mẫu ở 15oC.

1. Khuếch đại vùng gen HVS - I và HVS - II

Sản phẩm PCR được điện di cùng với thang chuẩn
100bp trên gel agarose 1%. Các băng DNA được
nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống
máy EC3 Imaging system.
- Thành phần phản ứng PCR giải trình tự vùng gen
HVS - I và HVS - II gồm: 1X Bigdye buffer; Bigdye; mồi
xuôi hoặc ngược; DNA và H2O. Được tiến hành trên hệ
thống máy giải trình tự gen ABI 3100 vant.
- Kết quả giải trình tự gen của các mẫu nghiên cứu
được so sánh với trình tự chuẩn J01415 trên Genebank
bằng phần mềm phân tích CLC Main Workbench.
3. Đạo đức trong nghiên cứu
Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào
nghiên cứu. Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu
khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Các
thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật.

DNA sau khi được tách chiết từ mẫu máu nghiên
cứu được kiểm tra chất lượng, nồng độ và độ sạch
bằng cách đo phổ hấp thụ tử ngoại ở hai bước sóng
260 nm, 280 nm. Tất cả các mẫu DNA đạt nồng độ ≥ 50
ng/µl, độ tinh sạch trong khoảng 1,7 ÷ 2, không đứt gẫy
được sử dụng làm khuôn để khuếch đại hai vùng gen
HVS - I và HVS - II.
Để xác định các đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphinsms - SNPs) của đoạn siêu biến
1 và đoạn siêu biến 2 trên DNA ty thể của các mẫu
nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu

khuếch đại đoạn gen HVS - I từ vị trí nucleotide 15975
đến nucleotide 16517, có kích thước 543 bp và đoạn
gen HVS - II từ vị trí nucleotide 8 đến nucleotide 429, có
kích thước 422 bp. Với điều kiện thành phần phản ứng
và chu trình nhiệt được mô tả ở phần phương pháp,
sản phẩm PCR thu được có chất lượng tốt, chỉ gồm 1
băng đặc hiệu và có kích thước đúng như đã tính toán
(hình 1).

Hình 1. Sản phẩm khuếch đại đoạn gen HVS - I (1 - 11) và gen HVS -II (12 - 21)
2. Kết quả phân tích trình tự vùng gen HVS - I và
HVS - II
Hình ảnh giải trình tự gen một số SNP trên 2 vùng

gen HVS - I và HVS - II được thể hiện ở hình 2 và 3: tín
hiệu các đỉnh cao, rõ, không bị nhiễu, tín hiệu đường
nền thấp.

25


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen một số SNP của vùng gen HVS - II

Hình 3. Hình ảnh giải trình tự gen một số SNP của vùng gen HVS - I
Bảng 1. Các dạng SNP của vùng gen HVS - I và HVS - II trên DNA ty thể của 100 mẫu dân tộc Mường
Loại đột biến

Vị trí

Vùng gen HVS-I

C-stretch
polymorphism

A16182C A16183C 16193insC 16193insCC

Transition

C16069T G16084C
T16124C T16126C
A16162G A16163G
C16192T C16193T
C16223T C16226A
C16256T C16257A
G16274A C16278T
T16298C C16299T
T16324C C16327T
C16465T G16496A

Transversion

T16092A A16113C A16116C A16122T T16140A C16291A A16194C C16197G
C16426G

Indel

38delA 469delT 474delG

T16086C

G16129A
C16168T
T16195C
T16231C
C16260T
G16279A
A16300G
C16355T

T16092C
T16140C
T16172C
C16201T
A16233G
C16261T
A16289G
T16304C
T16356C

T16093C
C16147T
T16178C
T16209C
A16235G
C16266A
C16291T
A16309G
T16362C

C16095T

C16148T
A16183G
G16213A
A16240G
A16269G
C16292T
G16310A
A16367C

C16108T
A16149C
C16184T
T16217C
A16241C
T16271C
C16295T
T16311C
G16390A

C16111T
T16154C
T16189C
C16221T
T16249C
A16272G
T16297C
G16319A
A16399G

Vùng gen HVS-II

C-stretch
polymorphism

309insC 309insCC 315insC

Transition

C43T G53A T55C A56C T57C A73G T146C C150T C151T T152C A183G G185A
A189G C194T T195C C198T T199C T204C G207A A210G A214G T217C A225G
A234G A235G A237G A249G A263G C308T T310C G316A A328G C332T

Transversion

T146A G316C T158A C303A

Indel

249delA 310delT 315insA 334delA 337delA 352delA 368delA

26


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
Chú thích: Transition - t
n th th n
t
t
n th th n
t
g

r n th nh r
h nh ng
n
t
C t n Indel - t
n

ng g
rn( - )h
nh
ngư
( -T Ch
th
n
t

r
n (C - T) Tr n
r n) C- tr t h
r h
-

Kết quả phân tích trình tự gen HVS - I và HVS - II được thể hiện ở bảng 1. Đối với gen HVS - II, tìm thấy 47 đa
hình; 100 mẫu nghiên cứu đều có SNP A73G và A263G; 92 mẫu có SNP 315insC; 59 mẫu có SNP 309insC; 12 mẫu
có SNP 309insCC. Đối với gen HVS - I, tìm thấy 90 đa hình; 68 mẫu mang haplotype AAAACCCCCTCCCCC (68%)
từ nucleotide 16180 đến 16193 và 32 mẫu có đột biến thay thế T16189C (32%) gồm: 3 mẫu mang haplotype AAAACCCCCCCCCCC, 6 mẫu mang haplotype AAACCCCCCCCCCCC, 21 mẫu mang haplotype AACCCCCCCCCCCCC,
2 mẫu mang haplotype AAAATCCCCCCCCCC. Dựa trên kết quả phân tích trình tự gen HVS - I và HVS - II, xác định
haplogroup cho các mẫu nghiên cứu. Tần số các haplogroup với một số SNP đặc trưng của từng haplogroup được
thể hiện ở bảng 2.
Bảng 2. Tần số các Haplogroup của vùng gen HVS - I và HVS - II của 100 mẫu dân tộc Mường [5]

Haplogroup
(%)

Các SNP đặc trưng
(+A73G, A263G)
HVS - I

Haplogroup
(%)

HVS - II

Các SNP đặc trưng
(+A73G, A263G)
HVS - I

HVS - II

B (8)

T16189C

G2 (6)

C16278T,
T16362C

B4 (4)

T16189C,

T16217C

M (5)

C16223T

B4a (4)

T16189C,
T16217C,
C16261T

M10 (2)

T16311C

B5 (1)

T16140C/A,
T16189C

M7 (6)

B5a (7)

T16140C/A,
T16189C,
C16226A,

M7b (4)

T16297C,

T150C,
T199C

C (5)

T16298C,
C16327T

M7b1 (10)

G16129A,
C16192T,
T16297C,

T150C,
T199C

D4 (4)

T16362C

M7c (1)

C16295T,

T146C/A,
T199C

F1a (16)

G16129A,
T16172C,
T16304C,

249delA

M8a (2)

C16184T,
T16298C,
G16319A

F1b (1)

T16189C,
T16304C,

249delA

N9a (2)

C16257A,
C16261T,

T150C

F2 (2)

T16304C,

249delA

R (3)

F2a (1)

C16291T,
T16304C,

249delA

R9a (6)

T16298C,
C16355T,
T16362C,

249delA

249delA

T146C/A,
T199C

Đã xác định được 22 haplogroup thuộc các nhóm B, C, D, F, G, M, N, R. Haplogroup F1a có tỷ lệ cao nhất, chiếm
16%, haplogroup M7b1 là 10%; B là 8%; B5a là 7%; G2, M7, R9a là 6%; M là 5%; B4, B4a, D4, M7b là 4%; F2, M10,
M8a, N9a là 2%. Haplogroup B5, F1b, F2a, M7c có tỷ lệ thấp nhất, đều chiếm 1%.

27


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014

IV. BÀN LUẬN
Nghiên cứu năm 1999 của nhóm R. Ivanova trên 50
người Việt Nam đã phát hiện được 20 đa hình vị trí các
enzym cắt trên DNA ty thể. Trong đó, 3 vị trí của enzym
HaeII - 13Viet, MspI - 19Viet, MspI - 20Viet là các đa
hình mới [9]. Năm 2005, Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng
sự đã giải trình tự 2 vùng gen HVS - I và HVS - II trên 2
mẫu dân tộc Kinh, 2 mẫu dân tộc Tày và một mẫu dân
tộc H’Mông, đã phát hiện 26 vị trí đa hình trên HVS - I
và 5 vị trí đa hình trên HVS - II [10]. Kết quả nghiên cứu
của Han Jun Jin và cộng sự (năm 2009) trên 47 người
Việt Nam cho thấy, haplogroup F1a có tỷ lệ cao nhất
10/47, và haplogroup D4 là 7/47, G2a là 6/47, B4 và
N9a là 3/47 [6]. Trong nghiên cứu của chúng tôi trên
100 mẫu dân tộc Mường, các haplogroup nhóm B, F,
M chiếm tỷ lệ cao và haplogroup F1a có tỷ lệ cao nhất
(16%), haplogroup D4, B4 chiếm 4%, haplogroup N9a
chiếm 2% và không có haplogroup G2a. Theo kết quả
năm 2010 của nhóm nghiên cứu Ya-Ping Zhang, các
haplogroup B, R9 và M7 là dạng haplogroup phổ biến ở
dân tộc Chăm và Kinh Bắc [11].
Ở một số cá thể vùng siêu biến 1 và 2 có các đoạn
lặp lại liên tiếp nucleotide Cytosine (C-stretch). Vùng
C - stretch nằm từ vị trí nucleotide 16183 đến 16193
trên HVS - I và từ vị trí nucleotide 303 đến 327 trên

HVS - II. Theo trình tự chuẩn CRS, vùng C - stretch của
HVS - I được ngắt quãng bởi nucleotide Thymine ở vị
trí 16189. Tuy nhiên, rất nhiều trình tự DNA ty thể có
đột biến T16189C tạo thành chuỗi 10 nucleotide Cystosine liên tiếp [1, 2]. Đột biến T16189C được xem là
đột biến có tốc độ cao nhất trong hệ gen ty thể người
[12]. Dạng dị hợp tử của vùng lặp Cystein trong trình tự
HVS - I và HVS - II đã được nghiên cứu nhiều và tỷ lệ
đa hình vùng này có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
giữa các chủng tộc người khác nhau. Vì vậy, đa dạng
di truyền trong vùng C - stretch có ý nghĩa quan trọng
trong giám định hình sự gen và nghiên cứu di truyền
quần thể. Năm 2009, Chen và cộng sự đã nghiên cứu
đa dạng di truyền của vùng C - stretch trên 919 người
Trung Quốc, thuộc 8 chủng tộc khác nhau. Kết quả cho
thấy, haplogroup AAAACCCCCTCCCCC và AACCCCCCCTCCCCC là các haplogroup đặc trưng cho quần
thể người dân tộc Tibetan và Salar của Trung quốc và tỷ
lệ đa hình T16189C thuộc vùng lặp nucleotide Cystein
của gen HVS - I là 25,14% [13]. Tỷ lệ đa hình T16189C
trên dân tộc Mường trong nghiên cứu của chúng tôi là
32%, cần có thêm nghiên cứu trên các dân tộc khác để
tìm ra các haplogroup đặc trưng cho từng dân tộc.
Việt Nam là một quốc gia đa văn hoá với 54 dân tộc
anh em, do vậy việc nghiên cứu đặc điểm và nguồn gốc
28

của mỗi tộc người cũng như mối liên quan giữa các tộc
người là một việc làm cần thiết, nhất là trong điều kiện
phát triển kinh tế xã hội hiện nay, việc di cư giữa các
vùng, việc kết hôn giữa các dân tộc ngày càng trở nên
phổ biến. Một số khía cạnh nhân chủng học như khảo

cổ, nhân trắc, văn hoá - xã hội, ngôn ngữ... đã được
quan tâm nghiên cứu từ lâu, riêng khía cạnh gen học
lại chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều. Ở Việt Nam,
những nghiên cứu về khảo cổ, nhân trắc, văn hoá - xã
hội, ngôn ngữ… cho thấy các tộc người Kinh, Mường,
Chăm và Khmer có những điểm tương đồng. Trên cơ
sở kết quả nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên
cứu, đánh giá sự đa dạng di truyền DNA ty thể của các
dân tộc khác ở Việt Nam nhằm khảo sát đặc điểm về
gen học của các tộc người Việt, đưa ra những bằng
chứng khoa học về nguồn gốc của các tộc người này,
nhằm triển khai dự án bảo tồn và lưu trữ nguồn gen
phục vụ cho công tác bảo vệ và chăm sóc sức khỏe
người dân.

V. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên cho phép được
rút ra kết luận: Đã giải trình tự hoàn thiện vùng gen
HVS - I và HVS - II trên DNA ty thể của 100 mẫu dân
tộc Mường, cụ thể:
- Tỷ lệ SNP A73G và A263G là 100%; 315insC là 92%;
309insC là 59%; 309insCC là 12%; T16189C là 32%.
- Xác định được 22 haplogroup, haplogroup F1a có tỷ
lệ cao nhất là 16%, haplogroup M7b1 là 10%; B là 8%;
B5a là 7%; G2, M7, R9a là 6%; M là 5%; B4, B4a, D4,
M7b là 4%; F2, M10, M8a, N9a là 2%. Haplogroup B5,
F1b, F2a, M7c có tỷ lệ thấp nhất, đều chiếm 1%.
Như vậy, chúng tôi đã đánh giá được sự đa dạng di
truyền vùng HVS - I và HVS - II của DNA ty thể trên 100
mẫu dân tộc Mường.

Lời cảm ơn
Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề
tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu một số chỉ số sinh
học, trình tự gen ty thể người Việt Nam trưởng thành và
đột biến gen gây bệnh thalassemia” thuộc đề tài nhiệm
vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt
Nam”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anderson A, Bankier AT, Barrel BG et al (1981).
Sequence and organisation of the human mitochondrial
genome. N t r 290: 457 - 465


TCNCYH Phụ trương 91 (5) - 2014
2. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PE et al (1999).
Reanalysis and revision of the Cambridge reference
sequence for human mitochondrial DNA. N t r
n t23, 147
3. DiMauro S, Schon EA (2003). Mitochondrial respiratory-chain diseases. N
ng
348: 2656 - 2668.
4. Li YC, Korol AB, Fahima T et al (2002). Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review.
11(12): 2453
- 2465.
5. Yao YG, Kong QP, Bandelt HJ et al (2002). Phylogeographic Differentiation of Mitochondrial DNA in Han
Chinese.
H
n t 70: 635 – 651.

6. Jin HJ., Chris TS., Kim W (2009). The peopling of
Korea revealed by analyses of mitochrondrial DNA and
Y-chromosomal markers. P
N 4(1): e4210.
7. Jain S., Panigrahi I., Sheth J et al (2011). STR
markers for detecting heterogeneity in Indian population.
39(1): 461 - 465.
8. Zhong H., et al (2011). Extended Y chromosome investigation suggests postglacial migrations of modern

humans into East Asia via the northern route.
28(1): 717 - 727.
9. Ivanova R., An Vu Trieu., et al (1999). Mitochondrial
DNA polymorphism in the Vietnamese population.
r
n
rn
n g n t
26, 417 - 422.
10. Huỳnh Thị Thu Huệ, Hoàng Thị Thu Yến, Nguyễn
Đăng Tôn (2005). Phân tích trình tự vùng điều khiển
(D-LOOP) trên genome ty thể của 5 cá thể người Việt
Nam. T
h C ng ngh
nh h
3(1): 15 - 22.
11. Peng MS., Ho QH., Pham DK., et al (2010). Tracing
the Austronesian Footprint in Mainland Southeast Asia:
A Perspective from Mitochondrial DNA.
27(10): 2417 – 2430.
12. Liou CW, L.T., Huang FM, Chen TL, Lee CF., et al

(2004). Association of the mitochondrial DNA 16189 T
to C variant with lacunar cerebral infarction: evidence
from a hospital-based case-control study. nn N Y
1011: 317 - 324.
13. Chen F., Dang Y., Yan C et al (2009). Sequencelength variation of mtDNA HVS - I C-stretch in Chinese
ethenic groups.
h
ng n
10(10): 711 - 720.

Summary
VARIATION OF mtDNA HYPERVARIABLE SEGMENT 1
AND HYPERVARIABLE SEGMENT 2 OF MUONG ETHNIC IN VIETNAM
The sequences polymorphism of mtDNA hypervariable Segment 1 (HVS - I) and hypervariable Segment 2 (HVS
- II) are studied and applied for assessing the genetic diversity and evolution of human population, the forensic genetics, consanguinity, and mitochondrial disease diagnosis. We define the variations of HVS - I and HVS - II genes
of 100 Muong ethnic samples by direct sequencing method. We find 22 haplogroup; F1a haplogroup frequency is
the highest (16%); M7b1 haplogroup frequency is 10%; B is 8%; B5a is 7%; G2, M7, R9a is 6%; M is 5%; B4, B4a,
D4, M7b is 4%; F2, M10, M8a, N9a is 2%. B5, F1b, F2a, M7c haplogroup frequencies are the lowest (1%). The frequencies of SNP A73G and A263G are 100%; 315insC is 92%; 309insC is 59%; 309insCC is 12%; T16189C is 32%.
In conclusion, we have assessed the genetic polymorphism of mtDNA HVS - I and HVS - II of 100 Muong ethnic
samples. This is the first and complete data of HVS - I and HVS - II gene sequences of a large number of Muong
individuals.
Key words: mitochondrial DNA, HVS - I gene, HVS - II gene, Muong ethnic.

29