Nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG NIFEDIPIN TRONG MẪU ĐÁNH GIÁ TƯƠNG TÁC
DƯỢC CHẤT - TÁ DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Trần Quang Trung1; Nguyễn Thanh Hải2; Trịnh Văn Lẩu3; Trương Ngọc Hiển1
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng
nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược. Phương pháp: khảo sát các điều
kiện sắc ký: detector PDA, bước sóng phân tích, cột sắc ký và thành phần pha động, tỷ lệ pha
động. Thẩm định tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ chính
xác trung gian, độ đúng, khoảng xác định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Kết quả:
xác định được các điều kiện sắc ký như: bước sóng, cột, pha động. Phương pháp được thẩm
định và đạt các tiêu chí theo quy định. Kết luận: đã xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác dược chất - tá dược,
làm cơ sở cho các nghiên cứu tiền công thức của dạng thuốc chứa nifedipin.
* Từ khóa: Nifedipin; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Tương tác thuốc - tá dược.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nifedipin là thuốc chẹn kênh canxi thuộc
nhóm dihydropyridin, được sử dụng rộng
rãi trong điều trị chứng đau thắt ngực,
tăng huyết áp và các rối loạn về mạch
máu khác [2, 3]. Tuy nhiên, hoạt chất
nifedipin tương đối kém ổn định [4] và có
thể tương tác làm giảm hàm lượng khi
phối hợp với các tá dược trong bào chế
viên nén. Vì vậy, để góp phần nghiên cứu
xác định tương tác giữa dược chất nifedipin

và các tá dược nhằm lựa chọn ra tá dược
phù hợp cho quá trình khảo sát xây
dựng công thức viên nén nifedipin giải
phóng kéo dài theo cơ chế bơm thẩm
thấu kéo-đẩy, chúng tôi tiến hành xây dựng
và thẩm định phương pháp định lượng
nifedipin bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) trong các mẫu
đánh giá tương tác dược chất - tá dược
được tạo ra bằng cách phối hợp nifedipin
với các tá dược dự kiến sử dụng.

1. Học viện Quân y
2. Đại học Quốc Gia Hà Nội
3. Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung ()
Ngày nhận bài: 05/10/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/11/2019
Ngày bài báo được đăng: 21/11/2019

5


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.
* Nguyên liệu, hóa chất:
- Nifedipin chuẩn: hàm lượng 99,82%
(Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
cung cấp).

- Nifedipin được Công ty Baoji Guokang
Bio-Technology Co., Ltd (Trung Quốc)
cung cấp (đạt tiêu chuẩn USP 38).
- Các loại PEO: N10, N80, N750, 301,
303, Coagulant được Công ty Colorcon
Asia Pacific Pte., Ltd. cung cấp.
- Lactose monohydrat, natri clorid,
magnesi stearat, PVP K30, oxýt sắt đỏ có
nguồn gốc từ Trung Quốc và đều đạt tiêu
chuẩn USP 38.
- Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn
HPLC.
- Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn cho
HPLC hoặc tinh khiết phân tích.
* Thiết bị:
Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D;
detector 2998 dual α Absorbance (Mỹ);
cột Phenomenex LUNA, Xbridge (RP-C18,
5 µm, 250 x 4,6 mm); máy quang phổ
EMC-61PC-UV
Spectrophotometer,
Emclab (Đức); máy đo pH Mettler Toledo
(Thụy Sỹ); cân phân tích Mettler Toledo
có độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sỹ) và các
dụng cụ thí nghiệm khác đạt tiêu chuẩn
phân tích.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Xây dựng phương pháp:
- Pha các dung dịch chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác

50,0 mg nifedipin chuẩn cho vào bình
định mức 100 ml. Thêm khoảng 70 ml
6

pha động methanol/nước (65/35), lắc siêu
âm cho tan hoàn toàn trong 30 phút, để
nguội ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm pha
động vừa đủ đến vạch, lắc đều thu được
dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml.
+ Dung dịch chuẩn: lấy chính xác 3 ml
dung dịch chuẩn gốc 500 µg/ml cho vào
bình định mức 10 ml, thêm pha động vừa
đủ đến vạch, lắc đều để được dung dịch
chuẩn có nồng độ nifedipin khoảng 150 µg/ml.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm
mẫu vào hệ thống sắc ký.
- Pha mẫu thử: cân chính xác một
lượng hỗn hợp bột của nifedipin và tá
dược (theo tỷ lệ 1/1) tương đương với
khoảng 50,0 mg nifedipin cho vào bình
định mức 100 ml, thêm khoảng 70 ml pha
động methanol/nước (65/35), lắc siêu âm
trong 30 phút, để nguội ở nhiệt độ phòng,
sau đó thêm pha động vừa đủ đến vạch,
lắc đều. Lấy một thể tích khoảng 10 ml
dung dịch trong bình định mức, đem ly tâm
4.000 vòng/phút trong 20 phút. Lấy chính
xác 3 ml dung dịch đã ly tâm, cho vào
bình định mức 10 ml và thêm pha động
vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng

lọc 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ
thống sắc ký.
- Điều kiện sắc ký:
Sử dụng dung dịch chuẩn nifedipin
nồng độ 150 µg/ml để khảo sát. Quét phổ
hấp thụ của dung dịch trên trong khoảng
200 - 500 nm để tìm bước sóng hấp thụ
cực đại. Khảo sát các điều kiện sắc ký
khác nhau như: pha tĩnh: cột silica gel
pha đảo C18 Phenomenex LUNA, Xbridge;
pha động: hỗn hợp các dung môi MeOH,
ACN, H2O với tỷ lệ khác nhau. Duy trì tốc độ


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019
dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 25 µl.
Xác định điều kiện sắc ký cho píc đạt độ
đối xứng tốt, tỷ lệ diện tích píc trên nồng độ
và chiều cao píc trên nồng độ lớn nhất.
* Thẩm định phương pháp định lượng
nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác
dược chất - tá dược:

Phương pháp được đánh giá theo
hướng dẫn của ICH và thông tư 32/2018
của Bộ Y tế [1, 5], dựa trên khảo sát các
chỉ tiêu sau: độ đặc hiệu, độ tương thích
hệ thống, tuyến tính, độ lặp lại, độ chính
xác trung gian, độ đúng, giới hạn phát
hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

của phương pháp.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Xây dựng phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác
dược chất - tá dược.
* Bước sóng phân tích:
Để xác định bước sóng thích hợp phân tích nifedipin, tiến hành ghi phổ UV của mẫu
nifedipin chuẩn 150 µg/ml trên máy quang phổ EMC-61PC-UV Spectrophotometer,
Emclab.
Quét phổ tử ngoại của dung dịch này với bước sóng 200 - 500 nm, cuvet thạch anh
dày 1 cm. Mẫu trắng là hỗn hợp dung môi pha động methanol/nước (65/35).

Hình 1: Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch nifedipin chuẩn 150 µg/ml.
Phổ đồ UV-Vis cho thấy cực đại hấp thụ của nifedipin là 237,2 nm và 370 nm. Từ đó,
chọn bước sóng 237 nm để khảo sát phương pháp định lượng nifedipin bằng HPLC.
* Khảo sát hiệu lực cột phân tích:
Tiến hành phân tích mẫu trên 2 loại cột silica gel pha đảo, phenomenex LUNA
và Xbridge.
7


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
Bảng 1: Kết quả khảo sát hiệu lực cột.
STT

Tên cột

Kết quả
Hệ số bất đối xứng (AF)

Số đĩa lý thuyết (N)

Thời gian lưu (phút)

1

Phenomenex LUNA

1,120

10600

8,965

2

Xbridge

1,049

19385

13,108

Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nifedipin khi sử dụng cột Xbridge.

Hình 3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin khi sử dụng cột Phenomenex LUNA.
Dựa vào kết quả về hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết, thời gian lưu và sắc ký đồ
nhận thấy cả 2 cột đều cho píc không bị kéo đuôi, AF nằm trong giới hạn cho phép
(0,8 ≤ AF ≤ 1,5), tuy nhiên cột Phenomenex LUNA cho số đĩa lý thuyết nhỏ hơn, nhưng

thời gian lưu ngắn hơn nhiều so với cột Xbridge (13,108 phút), nên lựa chọn cột
Phenomenex LUNA cho phân tích định lượng nifedipin.
* Khảo sát thành phần pha động:
Dựa trên tài liệu tham khảo và các hóa chất dung môi sẵn có trong phòng thí nghiệm,
tiến hành khảo sát 3 hệ pha động khác nhau gồm:
- Hệ 1: MeOH:nước (65/35, v/v).
- Hệ 2: ACN:nước (65/35, v/v).
- Hệ 3: ACN:methanol:nước (25/25/50, v/v).
8


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019
Bảng 2: Kết quả khảo sát thành phần pha động.
Hệ pha động

Thời gian lưu (phút)

Hệ số bất đối xứng (AF)

MeOH:nước (65/35, v/v)

8,965

1,120

ACN:nước (65/35, v/v)

5,187

1,261

ACN:methanol:nước (25/25/50, v/v)

1,050

1,040

Hình 4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động MeOH:nước (65/35, v/v).

Hình 5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động ACN:nước (65/35, v/v).

Hình 6: Sắc ký đồ mẫu chuẩn với hệ pha động ACN:MeOH:nước (25/25/50, v/v).
9


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
Hệ dung môi ACN:nước (65/35, v/v) cho píc không cân đối bằng 2 hệ dung môi còn
lại với AF = 1,261, đường nền không ổn định bằng hệ MeOH:nước (65/35, v/v). Hệ dung
môi ACN:MeOH:nước (25/25/50, v/v) cho píc gọn, nhưng thời gian lưu quá ngắn
(1,050 phút), không đảm bảo cho quá trình tách. Trong khi đó, hệ dung môi MeOH:
nước (65/35, v/v) cho đường nền ổn định, píc cân xứng, sắc nét với AF = 1,126, khả năng
tách tốt.
* Khảo sát tỷ lệ pha động:
Tiến hành khảo sát tỷ lệ thành phần pha động MeOH:nước ở các tỷ lệ: 50/50,
65/35, 60/40, 70/30, 80/20.
Bảng 3: Kết quả khảo sát tỷ lệ thành phần pha động MeOH:nước.
MeOH:nước (v/v)

Thời gian lưu (phút)

Diện tích píc (µV.s)

Hệ số bất đối xứng (AF)

50/50

16,328

2500234

1,059

65/35

8,981

12823315

1,127

60/40

13,315

12833722

1,091

70/30

6,601

12894973

1,169

80/20

4,261

12810176

1,258

Hình 7: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (50:50, v/v).

Hình 8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (65:35, v/v).
10


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019

Hình 9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (60:40, v/v).

Hình 10: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (70:30, v/v).

Hình 11: Sắc ký đồ mẫu chuẩn nifedipin với tỷ lệ dung môi MeOH:nước (80:20, v/v).
Từ kết quả khảo sát nhận thấy tỷ lệ dung môi MeOH:nước (v/v) là 65:35 cho thời gian
lưu phù hợp, píc gọn, cân đối.
Kết quả: lựa chọn hệ dung môi MeOH:nước với tỷ lệ 65:35 (v/v) để phân tích định

lượng nifedipin.
11


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
2. Thẩm định phương pháp định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương
tác dược chất - tá dược.
* Tính tương thích hệ thống:
Tiêm 6 lần mẫu nifedipin chuẩn 150 µg/ml vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký
theo điều kiện đã chọn.
Bảng 4: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống.
Thời gian lưu
(phút)

Diện tích píc
(µV.s)

Hệ số bất đối xứng
(AF)

Số đĩa lý thuyết
(N)

1

8,661

12287964

1,138

10873

2

8,718

12303091

1,137

10833

3

8,768

12318713

1,136

10814

4

8,794

12270688

1,136

10809

5

8,803

12260808

1,135

10795

6

8,795

12271121

1,136

10789

TBC

8,757

12285398

1,136

10819

0,6

0,2

0,1

0,3

Mẫu

RSD (%)

Hệ thống HPLC hoạt động ổn định, có độ lặp lại tốt. Giá trị RSD (%) của thời gian lưu,
diện tích píc, hệ số bất đối xứng píc và số đĩa lý thuyết của nifedipin đều < 2,0%.
* Tính đặc hiệu:
Nguyên tắc: chuẩn bị 3 mẫu: mẫu trắng (hỗn hợp bột tá dược), mẫu chuẩn, mẫu thử.
Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký với các điều kiện đã lựa chọn.

Hình 12: Sắc ký đồ của mẫu trắng hỗn hợp bột tá dược.
12


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019

Hình 13: Sắc ký đồ mẫu nifedipin chuẩn nồng độ 150 µg/ml.

Hình 14: Sắc ký đồ mẫu thử nifedipin nồng độ 150 µg/ml.

Píc mẫu chuẩn cân đối, sắc nét, có thời gian lưu 8,874 phút. Trên sắc ký đồ của
mẫu trắng không xuất hiện píc trong khoảng thời gian 8 - 10 phút. Sắc ký đồ của mẫu thử
và mẫu chuẩn đều có một píc ở thời gian lưu xấp xỉ 8,8 phút. Từ đó đưa ra kết luận
phương pháp có tính đặc hiệu cao.
* Khoảng tuyến tính:
Pha các mẫu nifedipin chuẩn, nồng độ từ 30 - 240 µg/ml, mỗi nồng độ phân tích 3 lần,
từ diện tích píc thu được, xây dựng sự phụ thuộc của diện tích píc với nồng độ nifedipin.
Bảng 5: Kết quả xây dựng đường chuẩn (n = 3).
Nồng độ
(µ
µg/ml)

Diện tích píc (µV.s)

Mẫu

Nồng độ
(µ
µg/ml)

Diện tích píc (µV.s)

1

30

2233484,5 ± 12920,5

5

150

12282186,4 ± 5241,4

2

60

4757893,5 ± 3141,6

6

180

14819683,6 ± 17694,6

3

90

7274879,5 ± 8018,9

7

210

17343338,7 ± 35401,3

4

120

9786676,6 ± 12100,6

8

240

19868707,9 ± 28642

Mẫu

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 83930x - 284700
2
Hệ số tương quan: R = 1

13


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
Kết quả khảo sát cho thấy giá trị r = 1 chứng tỏ trong khoảng nồng độ đã khảo sát
có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ nifedipin với diện tích píc thu được.
Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương tác
dược chất - tá dược.
* Độ chính xác:
- Độ lặp lại:
Tiêm 6 mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình và tiêm vào hệ thống HPLC (do kiểm
nghiệm viên một làm). Tính hàm lượng bằng phương pháp so sánh với chuẩn và xác
định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của những lần
định lượng.

Bảng 6: Kết quả khảo sát độ lặp lại của mẫu thử.
STT

Khối lượng cân (g)

Diện tích píc (µV.s)

Hàm lượng (%)

1

0,6450

13239283

100,43

2

0,6560

13373746

99,75

3

0,6540

13291701

99,44

4

0,6528

13280630

99,54

5

0,6545

13349152

99,79

6

0,6520

13277960

99,64

13302079

RSD = 0,53

Trung bình

Với các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lặp lại kết quả định lượng trong ngày phân tích
cho RSD đạt 0,53% nhỏ hơn 2%. Như vậy, phương pháp đã chọn đảm bảo độ chính xác.
- Độ chính xác trung gian:
Tiêm 6 mẫu thử được chuẩn bị (do một kiểm nghiệm viên khác thực hiện) (kiểm
nghiệm viên hai) theo quy trình và tiêm vào hệ thống HPLC. Xác định độ chính xác
bằng cách tính độ lệch chuẩn tương đối giữa các giá trị của những lần định lượng.
Bảng 7: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian.
STT

Khối lượng cân (g)

Diện tích píc (µV.s)

Hàm lượng (%)

1

0,6547

13366813

99,77

2

0,6565

13424439

99,92

3

0,6555

13451567

100,28

4

0,6534

13354395

99,87

5

0,6550

13420425

100,13

6

0,6538

13330146

99,63

Trung bình

RSD = 0,24%

Với các điều kiện sắc ký đã chọn, độ lặp lại kết quả định lượng do từng kiểm nghiệm
viên phân tích cho RSD đạt 0,24% và 0,53% nhỏ hơn 2% và do cả hai kiểm nghiệm
viên là 0,3% nhỏ hơn 3%. Như vậy, phương pháp đã chọn đảm bảo độ chính xác.
14


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 9-2019
* Độ đúng:
Xác định tỷ lệ thu hồi (%) bằng cách tính toán lượng chất chuẩn của chất cần phân
phân tích thêm vào mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức
nồng độ (80%, 100%, 120%). Tại mỗi mức nồng độ, tiến hành 3 mẫu độc lập trong cùng
điều kiện khảo sát.
Bảng 8: Kết quả khảo sát độ đúng.
Mức
nồng độ

80%

100%

120%

Lượng chuẩn
thêm vào (mg)

Spíc thêm chuẩn
(µV.s)

Lượng tìm lại
được (mg)

Tỷ lệ
thu hồi (%)

41,8

10211936

41,5

99,28

41,4

10140050

41,2

99,52

42,0

10212840

41,5

98,81

51,9

12564631

51,1

98,46

51,3

12521695

50,9

99,22

51,7

12558812

51,1

98,84

60,5

14916732

60,7

100,33

61,2

14985984

60,9

99,51

61,8

15066105

61,3

99,19

Kết quả

Trung bình = 99,2
RSD = 0,36%

Trung bình = 98,84
RSD = 0,38%

Trung bình = 99,68
RSD = 0,59%

Lượng chất chuẩn thu hồi ở mỗi mức nồng độ khác nhau đều nằm trong khoảng
98 - 102% so với lượng chất chuẩn thêm vào, với RSD của tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức
nồng độ < 2%, chứng tỏ phương pháp sử dụng có độ đúng cao.
* Khoảng xác định:
Kết quả độ đúng cho thấy tại nồng độ
nifedipin bằng 80 - 120% so với nồng độ
định lượng có độ đúng và độ lặp lại tốt.
Như vậy, khoảng xác định của phương
pháp trong giới hạn 120 - 180 µg/ml.
* Giới hạn phát hiện và giới hạn định
lượng:
Bằng phương pháp dựa vào tỷ số giữa
tín hiệu (S) và nhiễu (N) đã xác định được
giới hạn phát hiện của phương pháp
LOD = 0,0375 µg/ml và giới hạn định lượng
của phương pháp LOQ = 0,105 µg/ml.

KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định
lượng nifedipin trong mẫu đánh giá
tương tác dược chất - tá dược bằng
phương pháp HPLC ở những điều kiện
sau: hệ thống HPLC Alliance Waters

2695D, cột Phenomenex LUNA (RP-C18,
5 µm, 100A0, 250 x 4,6 mm); detector:
PDA 237 nm; pha động: MeOH:nước,
tỷ lệ 65/35, v/v; thể tích tiêm 25 µl;
tốc độ dòng 1 ml/phút; nhiệt độ cột:
nhiệt độ phòng.
15


T¹P CHÝ Y - HäC QU¢N Sù Sè 9-2019
Phương pháp đã được thẩm định trên
các chỉ tiêu và đáp ứng yêu cầu của một
phương pháp phân tích theo quy định của
ICH và thông tư 32/2018 của Bộ Y tế.
Phương pháp này có thể áp dụng để định
lượng nifedipin trong mẫu đánh giá tương
tác dược chất - tá dược.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Thông tư 32/2018/TT-BYT. Quy định việc
đăng ký lưu hành thuốc, nguyên liệu làm thuốc.

16

2. Uday Y.A et al. Estimation of nifedipine
by reverse phase high performance liquid
chromatography tablet dosage form. IJPLS.
2011, pp.610-612.
3. Sweetman S.C et al. Martindale.
Pharmaceutical Press. 2014, pp.1447-1455.
4. Klaus Florey et al. Analytical profiles of

drug substances. Academic Press. InC. 1989,
Vol. 18, pp.245-253.
5. ICH Harmonised Tripartite Guideline.
Guidelines for validation of analytical procedures:
Q2 (R1). Text and Methodology. 2005.