Làm giàu trình tự toàn bộ exon của gen ARID1A trong u nguyên bào thần kinh

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

LÀM GIÀU TRÌNH TỰ TOÀN BỘ EXON CỦA GEN ARID1A
TRONG U NGUYÊN BÀO THẦN KINH
Lê Thị Kim Hòa*, Phạm Thị Hồng Đào*, Bùi Thị Thanh Huyền**, Nguyễn Thị Hà Giang***,
Bùi Chí Bảo***

TÓM TẮT
Giới thiệu: U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là dạng u đặc nguyên phát của mô thần kinh giao cảm, có
nguồn gốc từ tế bào mào thần kinh, thường gặp nhất trong các loại ung thư ở trẻ em, chiếm 15% các trường hợp
tử vong do ung thư ở trẻ em. Gần đây, những nghiên cứu về giải trình tự gen thế hệ mới (high-throughput next
generation sequencing) đã phát hiện các đột biến liên quan đến điều hòa ngoại di truyền trong ung thư trẻ em, đặc
biệt là gen ARID1A ở UNBTK. ARID1A là một tiểu phần của phức hợp SWI/SNF tham gia điều hòa phiên mã
gen thông qua thay đổi cấu trúc chromatin. Do đó, việc xây dựng quy trình giải trình tự gen thông qua làm giàu
sản phẩm các exon ARID1A là cần thiết.
Mục tiêu: Tối ưu hóa quy trình PCR khuếch đại toàn bộ 20 exon và vùng tiếp giáp exon-intron của gen
ARID1A.
Phương pháp: Khảo sát mồi in silico, khảo sát nhiệt độ bắt cặp, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng PCR, kiểm
chuẩn bằng phương pháp giải trình tự. Áp dụng quy trình khảo sát trên DNA được tách chiết từ máu nhóm đối
chứng và từ khối u của 3 bệnh nhân UNBTK. Toàn bộ sản phẩm khuếch đại được xác định bằng kỹ thuật giải
trình tự Sanger.
Kết quả: Tối ưu được phản ứng PCR của các cặp mồi của 20 exon từ một phần exon 1 (1b) đến exon 20.
Tuy nhiên, exon 1a chưa được tối ưu hóa thành công do sản phẩm gen chứa nhiều vùng giàu GC.
Kết luận: Quy trình tối ưu hóa PCR thành công là bước đầu xây dựng quy trình giải trình toàn bộ exon của
gen ARID1A thành công.
Từ khóa: U nguyên bào thần kinh, làm giàu sản phẩm PCR, ARID1A.

ABSTRACT
TARGETED GENE ENRICHMENT FOR SEQUENCING OF ARID1A IN NEUROBLASTOMA

Le Thi Kim Hoa, Pham Thi Hong Dao, Bui Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Ha Giang, Bui Chi Bao
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 1 - 2016: 136 - 143
Background: Neuroblastoma (NB) is a primitive solid tumor of sympathetic system which originates from
neural crest. NB is the most common tumor of children, accounting for 15% cases of death in pediatric cancer.
Recent studies using high-throughput next generation sequencing identified mutations that involved in epigenetic
regulations, particularly ARID1A gene in neuroblastoma. ARID1A is a subunit of SWI/SNF complex which
participates in transcriptional regulation through chromatin remodeling. Until now, there is no ARID1A
sequencing data reported of NB cases in Vietnam. Therefore, establishing the process of ARID1A sequencing
through enriching ARID1A exon products is required.
Objective: To identify all 20 exons and exon-intron boundary regions of ARID1A gene.
Methods: Optimizing all PCR parameters for 20 exons of ARID1A gene. DNA was extracted from blood of




Đại học khoa học tự nhiên TP. HCM
Bệnh viện Nhi Đồng 2
Đại học Y Dược TP. HCM
Tác giả liên lạc: TS. Bùi Chí Bảo,
ĐT: 09097008225
Email:

136

Chuyên Đề Nội Khoa II


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Nghiên cứu Y học

healthy people and tumors of neuroblastoma patients. All PCR products were confirmed by Sanger method.
Results: PCR products showed specific for all primer designs of ARID1A from exon 2 to 20, and partial exon
1 (1b). Exon 1a was unqualified due to high GC contents.
Conclusion: Successful optimization for 20 exons of ARID1A and ready to step in next sequencing of the
whole exomes.
Key words: Neuroblastoma, enrichment, sequencing, ARID1A.
hóa và phát triển của tế bào. BAF250a tương tác
ĐẶT VẤN ĐỀ
với vùng methyl hóa nhằm làm “im lặng” các
U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là một
gen phiên mã trong một số ung thư ở người. Đột
dạng u đặc ở trẻ em, chứa các tế bào ung thư
biến gen ARID1A cũng được tìm thấy ở nhiều
hình thành từ mô thần kinh của tuyến thượng
loại ung thư khác nhau với tần số đột biến cao
thận, cổ, ngực, hoặc cột sống. Hầu hết các trường
như: ung thư tế bào ác tính ở tử cung (49,1%),
hợp UNBTK xảy ra ở trẻ em dưới 5 tuổi .UNBTK
ung thư nội mạc tử cung (39%), ung thư dạ dày
chiếm khoảng 8-10% các trường hợp ung thư ở
(18,7%), ung thư bàng quang (14,3%) , ung thư
trẻ em và là nguyên nhân gây tử vong cho 15%
ruột kết (9,7%) và ung thư phổi (9,7%)(6). Như
số ca tử vong ung thư ở trẻ em(1). Bệnh nhân
vậy việc khảo sát các đột biến gen ARID1A trên
thường được phát hiện bệnh ở giai đoạn trễ khi
các trường hợp mắc UNBTK - là hoàn toàn cần
u đã di căn. Bệnh nhân UNBTK có tỷ lệ tái phát
thiết, giúp xác định vai trò của gen này trong

sau khi điều trị và tử vong cao. Nguyên nhân là
việc hình thành và phát triển khối u. Ở giai đoạn
do thiếu cơ sở di truyền để tiên lượng bệnh, chẩn
đầu tiên của nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tối
đoán và điều trị hiệu quả. Do đó, việc nghiên
ưu hóa quy trình PCR toàn bộ exon của gen
cứu sự biến đổi của gen nhằm xây dựng cơ sở di
ARID1A nhằm thu nhận các sản phẩm PCR đủ
truyền của UNBTK qua đó cung cấp các dấu ấn
chất lượng tạo tiền đề cho quá trình giải trình tự.
sinh học hỗ trợ chẩn đoán, điều trị, phát hiện dư
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
lượng bệnh và theo dõi tình trạng bệnh là rất cần
thiết. Ở Việt Nam, có hai công trình nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
UNBTK tại bệnh viện Nhi Trung Ương và Đại
Mẫu mô UNBTK được thu nhận từ bệnh
học Y Dược TP HCM nhằm sàng lọc nhóm nguy
viện Nhi Đồng 2. Tiêu chuẩn chọn mẫu: bệnh
cơ MYCN(11,12). Nhiều nghiên cứu mới về
nhân chưa phát hiện khối u nào khác và chưa
UNBTK bằng giải trình tự gen thế hệ mới đã
qua điều trị, đồng thời không mắc hội chứng
giúp phát hiện các nhóm gen thường xuyên đột
Coffin-siris (vì liên quan đến di truyền đột biến
biến trên các bệnh nhân như: MYCN, ALK,
trên gen ARID1A).
ATRX,(1,2)… đồng thời cũng ghi nhận sự tác
Thu nhận mẫu
động của các yếu tố điều hòa ngoại di truyền

Máu được thu nhận từ tình nguyện viên
(epigenetic), nổi bật trong đó là ARID1A và vai
khỏe
mạnh.
trò của chúng trong sự thất bại trong điều trị ở
giai đoạn sớm và tiên lượng xấu trên ở bệnh
nhân UNBTK vào năm 2013(8).
ARID1A (AT-rich interactive domain –
containing protein 1A) là gen ức chế khối u, nằm
trên cánh ngắn NST số 1 (1p35.3). ARID1A mã
hóa protein BAF250a, là tiểu phần lớn trong
phức hợp SWI/SNF có chức năng điều hòa biến
đổi chromatin trong quá trình tăng trưởng, biệt

Thần kinh

Mẫu mô được thu nhận tại bệnh viện Nhi
Đồng 2. Mô sau khi phẫu thuật được giữ trong
môi trường DMEM (Invitrogen), 10% FBS, 5% PS
(Kháng sinh).

Tách chiết DNA
DNA bộ gen được ly trích bằng Wizard
Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).

137


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Nghiên cứu Y học

Đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA, những
mẫu có giá trị tỷ lệ về mật độ quang đo ở bước
sóng 260/280 đạt từ 1,8 – 2,0 mới được sử dụng
để tiến hành phản ứng PCR.

Thiết kế mồi
Mồi được thiết kế bằng phần mềm CLC
Main Workbench 5.5 dựa trên trình tự tham
khảo của gen ARID1A trên NCBI (NG_029965.1).
Độ đặc hiệu của mồi được kiểm tra bằng phần
mềm Primer-BLAST trên NCBI.
Chương trình trực tuyến SNPCheck
( />được sử dụng để kiểm tra vị trí đa hình đơn
nucleotide
(SNP
–
Single
Nucleotide
Polymorphism) cần tránh ở đầu 3’ của mồi.

Khuếch đại exon của gen ARID1A bằng kỹ
thuật PCR
Thiết lập điều kiện cho phản ứng PCR với
mỗi phản ứng PCR có chứa thành phần phản
ứng của Kit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase
(TaKara, Nhật Bản) và chu trình luân nhiệt được
thực hiện trên máy Mastercycler@ProS
(Eppendorf, Đức) như bảng 1. Các phản ứng

luôn kèm theo một chứng âm không chứa DNA
để kiểm soát ngoại nhiễm.
Bảng 1: Điều kiện phản ứng PCR ban đầu
Thành phần phản ứng
PCR buffer 10X
dNTP (250µM mỗi loại )
Mồi xuôi (10 µM)
Mồi ngược (10 µM)
Taq Polymerase (5 U/µl)
DNA (50 ng – 100 ng)
H2O
Tổng thể tích

Thể tích (µl)
1,5
1,5
0,75
0,75
0,1
1
9,4
15

Chu trình luân nhiệt
Nhiệt độ
Thời gian
o
98 C
3 phút
o

98 C
10 giây
o
56 C
20 giây
o
72 C
90 giây
o
72 C
10 phút

Giai đoạn
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài

o

72 C

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên
gel agarose
Sử dụng gel agarose 2% có nhuộm ethidium
bromide và quan sát dưới màn soi gel GelDoc-It
TS 310 (UVP, USA), sản phẩm PCR cho một
băng duy nhất đúng kích thước.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng phương pháp
Sanger

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng
illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification Kit (GE Healthcare, USA). Sản phẩm
PCR sau khi tinh sạch được thực hiện phản ứng
cycle sequencing với BigDye® version 3.1 Cycle
Sequencing kit (Applied Biosystems, USA), theo
2 chiều xuôi và ngược. Trình tự DNA được đọc
bằng máy ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystem, Mỹ). Kết quả giải trình tự được phân
tích bằng phần mềm CLC Main Workbench 5.5
và so sánh kết quả giải trình tự với trình tự tham
khảo NG_029965.1 trên NCBI.

KẾT QUẢ
Kết quả thiết kế mồi và thử nghiệm chạy
mồi
Gen ARID1A nằm trên cánh ngắn NST số 1
(1p35.3) gồm 20 exon với chiều dài hơn 86 kb
được thiết kế với 14 cặp mồi - Một số các exon có
kích thước ngắn và nằm gần nhau sẽ được
khuếch đại chung một cặp mồi.

Bảng 2: Trình tự mồi để khuếch đại 20 exon của gen ARID1A
STT Mồi
1
2
3
4

138

Tên mồi
1Fa
1Ra
1Fb
1Rb
2F
2R
3F

Trình tự (5’ -> 3’)
GGTAAAATGGCAGTGCTGAG
TTCCCGTTCGAGTTCTTCAG
TCGGAGCTGAAGAAAGCCGA
GAGAGAAGAGCCAGACAATG
AGGTTACTAGGTTGGTCTCA
ATTCCTGTCAAGAGGCTTGG
CATCAGTGCATAGCTTCTCA

Vị trí exon

Kích thướcPCR (bp)

1

1008

1

1217

2

466

3-4

1872

o

%GC

Tm ( C)

55
50
45
50
45

55,4
55,4
53,4
55,4
53,4

Chuyên Đề Nội Khoa II

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
STT Mồi
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

16

Tên mồi
4R
5F
6R
7F
8R
9F
11R
12F
12R
13F
17R
18F
18R

19F
19R
20Fa
20Ra
20Fb
20Rb
20Fc
20Rc
20Fc2
20Rc2
1Fa2
1Ra2

Trình tự (5’ -> 3’)
TTGCATTGGTTTCCTCTCTG
ACGAGTGAAACACTGTCTCA
CTGCATAGGGCACTCAAATG
CAGGATAAGGATGGAGAGCA
CTGGTTTAGGTCCAGAAGCA
ACAGCACTATTTGGCTCCAG
TACCACATGAAGCCAGTGAG
GATGAATACCTTACAGCCTG
ATCCTGAATAAGAGGCCAGG
TTCGTGTGTTTGTGTGAGAG
GCTTCTTAGACTTCAACACG
TGGCATCTGTGGGCTTTATG
TAAGGTGGAGGGAACAATGG
CAGAGTAGCTTCACTGATGG
CCAAGGTGGCTAAAGATGAG
CCTCTCCCAACTGATACAGA

CTCAAAGTCATTGCCTGGCA
AACCCCACAGTAAGGATGAG
AAGGAACAGAAAGGCGTGAG
AGAATCCAGTTTACCCTGTG
CTCACACTAAGGGAGGTTTG
TGACTGCTGAACTGTGTGTGG
TACAGCTTGCTGCTGACCCAG
GCAGAAAGCGGAGAGTCACA
CCCGTTCGAGTTCTTCAGGT

Kết quả khảo sát sự bắt cặp của mồi
DNA tách chiết từ mẫu máu được sử dụng
để tối ưu hóa phản ứng PCR. Tất cả 20 exon

Nghiên cứu Y học

Vị trí exon

Kích thướcPCR (bp)

5-6

869

7-8

1296

9 - 11

1939

12

368

13 - 17

1560

18

1031

19

305

20a

982

20b

1192

20c

1355
216

1a

689

%GC
45
45
50
50
50
50
50
45
50
45
45
50
50
50
50
50
50
50
50
45
50
55
55
55

55

o

Tm ( C)
53,4
53,4
55,4
55,4
55,4
55,4
55,4
53,4
55,4
53,4
53,4
55,4
55,4
55,4
55,4
55,4
55,4
55,4
55,4
53,4
55,4
57,2
57,8
57.8
57.4

được khuếch đại cùng thành phần phản ứng và
chu trình luân nhiệt theo bảng 1. Kết quả điện di
được thể hiện trong hình 1.

Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm 14 phản ứng PCR. M: Thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder. A.
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi số 1 đến 5 (giếng 1 đến 5). B. Kết quả điện di sản phẩm PCR với
cặp mồi số 6 đến 14 (giếng 6 đến 11)
đúng kích thước nhưng mờ. Do đó, cặp mồi số 1
Từ hình 1 cho thấy trong 14 giếng trừ giếng 1
và số 4 cần được tối ưu điều kiện phản ứng PCR.
và 4, tất cả các giếng còn lại đều cho vạch điện di
sáng rõ, kích thước các vạch đúng với kích mong
muốn, không có sản phẩm ký sinh chứng tỏ với
điều kiện như bảng 1 là tối ưu để khuếch đại
các trình tự đích. Trong khi đó, cặp mồi số 1 cho
kết quả âm tính và cặp mồi số 4 cho vạch điện di

Thần kinh

Đối với cặp mồi số 4 (3F/4R), chúng tôi bổ
sung Mg2+ 25 mM vào thành phần phản ứng.
Khảo sát nồng độ Mg2+ lần lượt là 1,5 mM (có sẵn
trong Kit nên không bổ sung); 2 mM (bổ sung 0,3
µl Mg2+ 25 mM); 2,5 mM (bổ sung 0,6 µl Mg2+ 25

139


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

mM) và 3 mM (bổ sung 0,9 µl Mg2+ 25 mM). Kết
quả cho thấy, ở nồng độ Mg2+ 2 mM (giếng 2) sản
phẩm PCR cho vạch điện di đúng kích thước,
không có băng phụ như, sáng rõ hơn so với sản
phẩm của phản ứng không bổ sung Mg2+ (giếng
1) (Hình 2). Như vậy, đối với cặp mồi (3F/4R) cần
bổ sung 0,3 µl Mg2+ 25 mM vào thành phần phản
ứng PCR để cho kết quả tối ưu.

Đối với cặp mồi số 1 (1Fa/1Ra), chúng tôi đã
tiến hành phản ứng PCR ở các nhiệt độ bắt cặp
khác nhau: 54oC, 56oC, 58oC, 60oC, 62oC, và lần
lượt bổ sung 1M Betaine và DMSO 5%, thậm chí
vùng exon 1a cũng thiết kế thêm cặp mồi số 16
(1Fa2/1Ra2) và tối ưu nhưng phản ứng PCR vẫn
không cho sản phẩm mục tiêu.
Áp dụng điều kiện tương tự trên DNA từ
mẫu NB06, NB25, NB46. Kết quả điện di sản
phẩm PCR của 3 mẫu được trình bày như hình 3.
Kết quả cho thấy hầu hết sản phẩm PCR của các
cặp mồi cho vạch điện di đúng kích thước, sáng
rõ; trừ cặp mồi số 2 (1Fb/1Rb), 4 (3F/4R), 7
(9F/11R), 10 (18F/18R) cho vạch phụ có kích
thước thấp hơn và mờ hơn so với vạch của sản
phẩm PCR mục tiêu (hình 3). Tuy nhiên, khi
tăng nhiệt độ bắt cặp của phản ứng lên 58oC đối
với cặp mồi 4, 7, 10 (hình 4A) và 62oC đối với cặp

mồi số 2 (hình 4B), kết quả sản phẩm PCR không
còn sản phẩm ký sinh, vạch điện di sáng rõ,
đúng kích thước (hình 4).

Hình 2: Hình kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp
mồi 3F/4R. Giếng 1: Mg2+ 1,5Mm; Giếng 2: Mg2+
2mM; Giếng 3: Mg2+ 2,5mM; Giếng 4: Mg2+ 3mM;
M: thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder.

Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR với
cặp mồi số 2 đến 14 trên mẫu NB06. M:
thang chuẩn GeneRuler 1 kb Plus DNA
Ladder

140

Hình 4: Kết quả điện di cặp mồi 2, 4, 7,10. A. Kết quả điện di
sản phẩm PCR với cặp mồi số 4, 7, 10. B. Kết quả điện di sản
o

phẩm PCR với cặp mồi số 2 và nhiệt độ bắt cặp là 56 C (giếng
o

o

o

1), 58 C (giếng 2), 60 C (giếng 3) , 62 C (giếng 4)

Chuyên Đề Nội Khoa II

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

Nghiên cứu Y học

Bảng 3: Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR của từng exon.
Thành phần phản ứng
(Tổng thể tích là 15 µl)
PCR buffer 10X :
dNTP (250 µM mỗi loại )
Mồi xuôi (10 µM)
Mồi ngược (10 µM)
Taq Polymerase (5 U/µl)
DNA (50 ng – 100 ng)
Nước cất hai lần

1,5 µl
1,5 µl
0,75 µl
0,75 µl
0,1 µl
1 µl
9,4 µl

Giai đoạn
o
Biến tính : 98 C
o
98 C

o
Bắt cặp:
62 C
o
Kéo dài: 72 C
o
72 C

3 phút
10 giây
20 giây
90 giây
10 phút

40
chu kỳ

2F/2R, 5F/6R, 7F/8R,
12F/12R, 13F/17R, ,
19F/19R, 20Fa/20Ra,
20Fb/20Rb, 20Fc/20Rc

PCR buffer 10X
dNTP (250µM mỗi loại )
Mồi xuôi (10 µM)
Mồi ngược (10 µM)
Taq Polymerase (5 U/µl)
DNA (50 ng – 100 ng)
Nước cất hai lần

1,5 µl
1,5 µl
0,75 µl
0,75 µl
0,1 µl
1 µl
9,4 µl

Giai đoạn
o
Biến tính : 98 C
o
98 C
o
Bắt cặp:
56 C
o
Kéo dài: 72 C
o
72 C

3 phút
10 giây
20 giây
90 giây
10 phút

40
chu kỳ

9F/11R, 18F/18R

PCR buffer 10X
dNTP (250µM mỗi loại )
Mồi xuôi (10 µM)
Mồi ngược (10 µM)
Taq Polymerase (5 U/µl)
DNA (50 ng – 100 ng)
Nước cất hai lần

1,5 µl
1,5 µl
0,75 µl
0,75 µl
0,1 µl
1 µl
9,4 µl

Giai đoạn
o
Biến tính : 98 C
o
98 C
o
Bắt cặp:
58 C
o
Kéo dài: 72 C
o
72 C

3 phút
10 giây
20 giây
90 giây
10 phút

40
chu kỳ

PCR buffer 10X
dNTP (250 µM mỗi loại)
Mồi xuôi (10 µM):
Mồi ngược (10 µM)
Taq Polymerase (5 U/µl)
DNA (50 ng – 100 ng):
2+
Mg 25 mM
Nước cất hai lần

1,5 µl
1,5 µl
0,75 µl
0,75 µl
0,1 µl
1 µl
0,3µl
9,1 µl

Giai đoạn

o
Biến tính : 98 C
o
98 C
o
Bắt cặp:
58 C
o
Kéo dài: 72 C
o
72 C

3 phút
10 giây
20 giây
90 giây
10 phút

40
chu kỳ

Exon
1Fb/1Rb

3F/4R

Chu trình luân nhiệt

Kết quả giải trình tự

Hình 5: Vùng poly A của exon 20c của mẫu NB06
Các sản phẩm PCR của mẫu NB06, NB25,
NB46 của 13 cặp mồi (từ exon 1b đến 20) đã tối
ưu hóa , không có cặp mồi số (1Fa/1Ra) sau khi
tinh sạch được tiến hành giải trình tự chuỗi

Thần kinh

DNA. Toàn bộ kết quả giải trình tự chuỗi DNA
đều cho kết quả trùng với các vùng gen ARIDA
từ GenBank. Tuy nhiên, vùng trình tự được
khuếch đại với cặp mồi 14 (20Fc/20Rc) (nằm trên

141


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016

exon 20) có hai vùng poly A dài hơn 10
nucleotide nên không đọc được kết quả sau
vùng poly A (hình 5).
BÀN LUẬN
Thành phần phản ứng và chu trình luân
nhiệt được thiết lập ban đầu (Bảng 1) thích hợp
để khuếch đại đa số các exon của gen ARID1A.
Tuy nhiên, cặp mồi 3F/4R cho kết quả vạch điện
di mờ nên tối ưu nồng độ Mg2+. Hầu hết DNA
polymerase cần một cation hóa trị II như là một

đồng yếu tố để thực hiện chức năng. Phần lớn
các trường hợp tối ưu hoá phản ứng PCR đều sử
dụng Mg2+ để tăng hoạt động của Taq
polymerase. Tuy nhiên, Mg2+ tạo thành phức hợp
với dNTP, primer, DNA mạch khuôn mang điện
tích âm. Nếu lượng Mg2+ quá nhiều sẽ làm tăng
khả năng bắt cặp sai của primer (mismatched
primer), đồng thời làm giảm độ nhạy của
enzyme trong việc gắn nucleotide vào mạch
khuôn tạo sản phẩm không đặc hiệu(5). Chính vì
vậy khi nồng độ Mg2+ 2 mM thì sản phẩm PCR
cho vạch điện di sáng rõ, không băng phụ; lên
2,5 mM và 3 mM thì xuất hiện sản phẩm không
đặc hiệu.
So sánh kết quả PCR giữa mẫu máu và mẫu
mô nhận thấy có sự khác biệt ở các exon 1b, 3 - 4,
9 - 11 và 18 là khi sử dụng DNA mẫu mô thì kết
quả PCR cho sản phẩm ký sinh. Sự khác biệt này
có thể do các chất ức chế PCR xuất phát từ mẫu
hoặc trong Kit tách DNA. Các chất ức chế này có
thể bất hoạt Taq polymerase, phá hủy hoặc bắt
trên DNA, hoặc can thiệp vào bước ly giải tế bào.
Đối với mô ung thư có thể chứa collagen, heme,
hemoglobin,… là một trong những nguyên nhân
làm giảm hiệu quả PCR. Thông thường, để ức
chế các chất này thì cần bổ sung albumin từ
huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin)(9)
- hoặc có thể gia tăng nhiệt độ bắt cặp nhằm tăng
khả năng bắt đặc hiệu của mồi vào DNA mạch
khuôn. Do đó, khi tăng nhiệt độ bắt cặp lên 58oC

thì các cặp mồi 3F/4R, 9F/1R, 18F/18R bắt đặc
hiệu với DNA và cho sản phẩm PCR tốt nhất;

142

trong khi đó cặp mồi 1Fb/1Rb hoạt động tốt nhất
ở 62oC.
Vùng exon 1 có trình tự GC chiếm giàu GC
tới 77% nên dễ tạo cấu trúc thứ cấp ảnh hưởng
đến phản ứng PCR. Đây cũng là một trong
những nguyên nhân chính gây thất bại trong
khuếch đại vùng exon 1 Nghiên cứu đã tiến
hành tách riêng vùng trình tự này thành hai
vùng nhỏ, đồng thời khảo sát nhằm tối ưu nhiệt
độ bắt cặp, nồng độ Mg2+ và thậm chí tối ưu nồng
độ Betaine và DMSO, phối hợp 1M Betaine và
DMSO 5% vì betaine và DMSO giúp ổn định
mạch khuôn, hạn chế tạo cấu trúc thứ cấp(6,5,10),
tuy nhiên vẫn không cho kết quả khả quan. Vấn
đề này có thể được giải quyết bằng cách sử dụng
Kit PCR chuyên cho vùng giàu GC để khuếch
đại exon 1a.
Kết quả giải trình tự các exon đã được tối ưu
hóa PCR, cho thấy các vùng khuếch đại trên 1kb
(3F/4R, 7F/8R, 9F/11R, 13F/17R, 20Fc/20Rc) cần
giải trình tự bằng cả mồi xuôi và mồi ngược
nhằm thu nhận toàn bộ trình tự với kết quả tối
ưu. Một số trình tự có chứa cấu trúc poly A/T
(exon5, 6) nên tránh sử dụng mồi xuôi mà thay
thế bằng mồi ngược để thu nhận kết quả. Ngoài

ra, exon 20c, hai trình tự poly A dài hơn 10
nucleotide nằm ở giữa hai mồi cách nhau 216
nucletotide gây nhiễu tín hiệu giải trình tự. Do
đó, vùng exon 20c được thiết kế thêm mồi xuôi
(20Fc2) và mồi ngược (20Rc2) (bảng 2) giữa 2
vùng poly A để có thể đọc được toàn bộ exon.
Kết quả giải trình vùng poly A cho thấy với cặp
mồi 20Fc2 và 20Rc2 cho thấy đọc hết toàn bộ
giữa 2 vùng poly A. Như vậy, 20 exon của gen
ARID1A trừ exon 1a đều cho kết quả giải trình tự
sóng tốt.
Trong nghiên cứu này, DNA được tách chiết
từ mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh
để tối ưu phản ứng PCR. Quy trình tối ưu được
áp dụng lên đối tượng nghiên cứu là ba mẫu
DNA tách chiết từ mẫu mô UNBTK. Tuy nhiên,
kết quả giải trình tự không cho thấy bất thường
nào trên gen ARID1A.

Chuyên Đề Nội Khoa II


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 1 * 2016
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã tối ưu phản ứng PCR cho hầu
hết 20 exon của gen ARID1A (trừ 1a). Tạo nền
tảng cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát
hiện đột biến của gen ARID1A trên bệnh nhân
UNBTK ở Việt Nam. Nghiên cứu này được tài
trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ

Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106YS.06-2014.48.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.
4.

5.

Cheung NK, et al. (2013). Neuroblastoma: developmental
biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev
Cancer, 13(6): 397-411.
Daniel A, et al. (2014). Neuroblastoma. In: Graham Dellaire.
Cancer Genomics, 1st edition, pp. 357-376. Academic Press,
San Diego.
Jennifer N, et al. (2013 ). ARID1A mutations in cancer: another
epigenetic tumor suppressor?. Cancer Discov, 3(1): 35-43.
Jensen MA (2010). DMSO and betaine greatly improve
amplification of GC-rich constructs in de novo synthesis. PLoS
One, 5(6): e11024.
Kuslich CD, et al. (2008). Overview of PCR. In: Sean RG,
Emily AW (eds). Current Protocols Essential Laboratory

Thần kinh

6.

7.

8.

9.
10.
11.

12.

Nghiên cứu Y học

Techniques, 1st edition, pp. 10.2.1-10.2.31. Jonh Wile & Sons,
New Jersey.
Masliah-Planchon J, et al. (2015). SWI/SNF chromatin
remodeling and human malignancies. Annu Rev Pathol, 10:
145-71.
Radstrom P, et al. (2004). Pre-PCR processing: strategies to
generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol, 26(2): 13346.
Sausen M, et al. (2013). Integrated genomic analyses identify
ARID1A and ARID1B alterations in the childhood cancer
neuroblastoma. Nat Genet, 45(1): 12-7.
Schleiermacher G, et al. (2014). Recent insights into the biology
of neuroblastoma. Int J Cancer, 135(10): 2249-61.
Susan Frackman, et al. (1998). Betaine and DMSO: Enhancing
Agents for PCR. Promega Notes, 65: 27.
Trương Đinh Kiều Diễm và cs. (2015). Xây dựng quy trình
phân loại nhóm nguy cơ cao của U nguyên bào thần kinh
khuếch đại MYCN. Y học TP Hồ Chí Minh, tập 19: 1-7.
Vũ Đình Quang và cs. (2013). Đánh giá sự khuếch đại gen

MYCN trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh. Y Khoa, 6 (1):
68-73.

Ngày nhận bài báo:

24/11/2015

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

30/11/2015

Ngày bài báo được đăng:

15/02/2016

143