Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LÀI

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN
GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM
(Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum
(Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LÀI
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT NHÂN
GIỐNG PHỤC VỤ BẢO TỒN HAI LOÀI LAN NGHỆ TÂM
(Dendrobium loddigesii Rolfe), HẠC VỸ (Dendrobium aphyllum
(Roxb.) Fisher) CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành:

Khoa học cây trồng

Mã số:

9 62 01 10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Vũ Mạnh Hải
2. TS. Phạm Hương Sơn

HÀ NỘI - 2019


i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa
học của GS. TS. Vũ Mạnh Hải và TS. Phạm Hương Sơn, sự giúp đỡ của lãnh đạo,
cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công
nghệ - Bộ Khoa học và Công nghệ; Trung tâm Tài nguyên thực vật. Các thông tin
trích dẫn sử dụng trong luận án đều được ghi rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lài

năm 2019


ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy,
cô giáo, các tập thể, cá nhân cùng bạn bè đồng nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Vũ Mạnh Hải và TS. Phạm Hương
Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn
thiện luận án.
Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo, các cán bộ
nghiên cứu Trung tâm Sinh học Thực nghiệm - Viện Ứng dụng Công nghệ, Trung
tâm Tài nguyên thực vật, Ban Đào tạo sau đại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt
Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên
cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên khích
lệ, giúp đỡ về vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày

tháng

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Lài

năm 2019


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................................... vi
DANH MỤC BẢNG........................................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................ ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 4

1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D.
aphyllum) của Việt Nam .................................................................................. 4
1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii)
và Hạc vỹ (D. aphyllum) .................................................................................. 4
1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) .............. 5
1.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và
Hạc vỹ (D. aphyllum) ở Việt Nam ................................................................... 6
1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới và ở
Việt Nam .......................................................................................................... 7
1.5.1 Sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới ............... 7
1.5.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam ......... 8
1.6 Cơ sở khoa học về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo ................................. 9
1.6.1 Bảo tồn hoa lan............................................................................................ 9
1.6.2 Các kỹ thuật về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo hoa lan ................. 10
1.7 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế

giới và ở Việt Nam ......................................................................................... 20
1.7.1 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên
thế giới ................................................................................................................ 20
1.7.2 Nghiên cứu thực vật học và nhân giống lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở
Việt Nam ............................................................................................................ 33
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................... 39
NGHIÊN CỨU ................................................................................................................... 39

2.1 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 39
2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 41


iv

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và
Hạc vỹ (D. aphyllum) ......................................................................................... 41
2.2.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro, kỹ thuật tạo hạt nhân tạo và nhân
giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc
vỹ (D. aphyllum) phục vụ cho công tác bảo tồn ................................................ 41
2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc
vỹ (D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm .................................................. 42
2.2.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D.
aphyllum) giai đoạn vườn sản xuất .................................................................... 42
2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 43
2.4 Các chỉ tiêu theo dõi ....................................................................................... 52
2.5 Điều kiện thí nghiệm ....................................................................................... 53
2.6 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 54
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................................ 55

3.1 Đặc điểm sinh học của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D.

aphyllum) ........................................................................................................ 55
3.1.1 Đặc điểm hình thái học của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ .............................. 55
3.1.2 Cấu tạo vi phẫu của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ .............................. 59
3.1.3 Một số thành phần hóa sinh cơ bản của lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc
vỹ (D. aphyllum) ................................................................................................ 67
3.2 Nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nhân giống in vitro, tạo hạt giống nhân tạo và
nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản hai loài lan Nghệ tâm (D.
loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) .............................................................. 69
3.2.1 Xác định chất khử trùng và thời gian khử trùng của mẫu nuôi cấy .......... 69
3.2.2 Nghiên cứu tạo vật liệu protocorm like bodies (PLBs) từ lát mỏng tế bào
nằm ngang (tTCL) .............................................................................................. 71
3.2.3 Tái sinh chồi từ protocorm like bodies (PLBs) ......................................... 74
3.2.4 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh .................................................... 79
3.2.5 Nghiên cứu kỹ thuật tạo hạt nhân tạo........................................................ 84
3.2.6 Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản hạt nhân tạo .............................................. 90
3.2.7 Nghiên cứu khả năng nhân giống in vitro của hạt nhân tạo sau bảo quản 99
3.2.8 Nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh từ hạt hạt nhân tạo sau bảo
quản .................................................................................................................. 103
3.3 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây con lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ
(D. aphyllum) in vitro giai đoạn vườn ươm ................................................. 108


v

3.3.1 So sánh sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân
giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ..................................................... 109
3.3.2 Nghiên cứu xác định thời vụ ra ngôi cây con in vitro giai đoạn vườn
ươm .................................................................................................................. 111
3.3.3 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây con in vitro ở giai đoạn vườn
ươm .................................................................................................................. 112

3.3.4 Nghiên cứu bổ sung chế phẩm dinh dưỡng cho cây con in vitro ở giai đoạn
vườn ươm ......................................................................................................... 115
3.4 Nghiên cứu kỹ thuật chăm sóc cây lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ (D.
aphyllum) giai đoạn vườn sản suất ............................................................... 118
3.4.1 Nghiên cứu xác định giá thể cho cây ở giai đoạn vườn sản xuất ............ 118
3.4.2 Nghiên cứu chế độ dinh dưỡng cho cây lan ở giai đoạn vườn sản suất .. 120
3.4.3 Nghiên cứu bổ sung Superthrive cho cây lan ở giai đoạn vườn sản
xuất ................................................................................................................... 122
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 128
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 130
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 131
PHỤ LỤC.......................................................................................................................... 148


vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic Acid

ADN

Axit DeoxyriboNucleic

BA

6-Benzylaminopurine

CITES

Convention on International Trade in Endangered Species

CV (%)

Hệ số biến động (Coeffient of Variants)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetate

FDA

Fluorescein Diacetate

HV

Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher)

IBA

Indole Butyric Acid

IUCN

International Union for Conservation of Nature

2iP

2-isopentyl Adenine

αNAA

α-Naphthalene Acetic Acid

Kin

Kinetin (6-furfuryl-aminopurine)

KC

Knudson C (1946)

LSD

Least significiant difference (Sai số tối thiểu có ý nghĩa)

MS

Murashige and Skoog (1962)

ND

New Dogashima (1998)

NT

Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe)

OD

Optical Density

PAA

Phenoxy Acetic Acid

PLBs

Protocorm like bodies

SH

Schenk and Hildebrandt (1972)

TCLs

Thin cell layers – Các lát mỏng tế bào

tTCL

Traverse thin cell layer- Lát mỏng tế bào nằm ngang

TDZ

Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)

TTC

Tetrazolium

TNDTTV

Tài nguyên di truyền thực vật

THT

Than hoạt tính

UNCED

United Nations Conference on Environment and
Development (Hội nghị Liên Hiệp quốc về môi trường
và phát triển)
Vacin and Went (1949)

VW


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu .................................. 4
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái rễ, lá và thân của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ................. 56
Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái hoa của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ................... 57
Bảng 3.3 Kích thước các lớp mô trong cấu tạo vi phẫu rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ ...... 61
Bảng 3.4 Cấu tạo vi phẫu thân Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................ 63
Bảng 3.5 Cấu tạo vi phẫu lá Nghệ tâm và Hạc vỹ .................................................... 64
Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số thành phần hóa sinh cơ bản có trong hai loài lan
Nghệ tâm và Hạc vỹ ....................................................................................... 68

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl lên mẫu cấy .......................... 69
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của chất kháng sinh cefotaxime (cef) và 3% NaOCl đến khả
năng sống và vô trùng của mẫu cấy ................................................................ 70
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của BA .................................................................................... 72
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + αNAA) đến khả năng tạo PLBs từ lát mỏng
tế bào nằm ngang (tTCL) ................................................................................ 73
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tổ hợp (BA + IBA) đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 75
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của dịch nghiền bí ngô đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs 76
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của bột tảo Spirulina đến khả năng tái sinh chồi từ PLBs ... 77
Bảng 3.14 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ chồi lan Nghệ tâm và Hạc vỹ in
vitro ................................................................................................................. 79
Bảng 3.15 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ chồi Nghệ tâm và Hạc vỹ .... 80
Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch sodium alginate và CaCl2.2H2O đến sự
hình thành vỏ hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ...................................... 86
Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate (%) và CaCl2.2H2O (mM) đến tỷ
lệ nảy mầm của hạt nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ................................... 86
Bảng 3.18 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến
khả năng nảy mầm và khả năng sinh trưởng của hạt nhân tạo ....................... 87
Bảng 3.19 Ảnh hưởng của BA, tổ hợp BA + IBA đến khả năng nảy mầm và sinh
trưởng của hạt nhân tạo .................................................................................. 89
Bảng 3.20 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo .......... 91
Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan
Nghệ tâm ......................................................................................................... 93


viii

Bảng 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ ABA đến thời gian bảo quản của hạt nhân tạo lan
Hạc vỹ ............................................................................................................. 94
Bảng 3.23 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng

sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Nghệ tâm ................................... 96
Bảng 3.24 Ảnh hưởng của natri benzoat, topsin - M và carbendazim đến khả năng
sống sót của hạt nhân tạo sau bảo quản lan Hạc vỹ........................................ 97
Bảng 3.25 Ảnh hưởng của tổ hợp BA + PAA đến quá trình nhân nhanh protocorm và
chồi sau bảo quản.......................................................................................... 100
Bảng 3.26 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm
và chồi của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản .......................................... 102
Bảng 3.27 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi ............................... 104
Bảng 3.28 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro truyền thống và cây nhân giống
in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản ............................................................ 109
Bảng 3.29 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng
của cây in vitro giai đoạn vườn ươm ............................................................ 111
Bảng 3.30 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro ở giai
đoạn vườn ươm ............................................................................................. 113
Bảng 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng khác nhau đến khả năng
sinh trưởng của cây in vitro giai đoạn vườn ươm......................................... 116
Bảng 3.32 Ảnh hưởng của loại giá thể đến khả năng sinh trưởng của lan Nghệ tâm và
Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất .................................................................... 118
Bảng 3.33 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng
của lan Nghệ tâm giai đoạn vườn sản suất ................................................... 120
Bảng 3.34 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của
lan Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất .............................................................. 121
Bảng 3.35 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh
trưởng của lan Nghệ tâm ở giai đoạn vườn sản suất .................................... 123
Bảng 3.36 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến khả năng khả năng sinh
trưởng của lan Hạc vỹ ở giai đoạn vườn sản suất ......................................... 124


ix

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cây hoa lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................................. 5
Hình 3.1 Thân, lá và rễ cây Nghệ tâm (D. loddigesii) .............................................. 55
Hình 3.2 Thân, lá và rễ cây Hạc vỹ (D. aphyllum) ................................................... 55
Hình 3.3 Lát cắt ngang qua rễ Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................. 60
Hình 3.4 Lát cắt ngang qua thân Nghệ tâm và Hạc vỹ ............................................. 62
Hình 3.5 Lát cắt ngang qua lá Nghệ tâm và Hạc vỹ ................................................. 64
Hình 3.6 Đặc điểm hình thái và cấu tạo hoa của Nghệ tâm và Hạc vỹ..................... 66
Hình 3.7 Mẫu nảy chồi sau 6 tuần nuôi cấy .............................................................. 71
Hình 3.8 Khả năng phát sinh PLBs từ tTCL ............................................................. 74
Hình 3.9 Tái sinh chồi từ PLBs ................................................................................. 78
Hình 3.10 Tạo cây lan Nghệ tâm in vitro hoàn chỉnh ............................................... 81
Hình 3.11 Tạo cây lan Hạc vỹ in vitro hoàn chỉnh ................................................... 81
Hình 3.12 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Nghệ tâm bằng phương pháp nuôi
cấy mô tế bào .................................................................................................. 83
Hình 3.13 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống lan Hạc vỹ bằng phương pháp nuôi cấy
mô tế bào......................................................................................................... 84
Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O đến
khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo ............................................................... 88
Hình 3.15 A - protocorm like bodies; B, C - hạt nhân tạo; D - Hạt nhân tạo được bảo
quản (sau 24 tuần) ........................................................................................... 98
Hình 3.16 Sơ đồ tóm tắt quy trình tạo hạt giống nhân tạo hai loài lan Nghệ tâm và
Hạc vỹ ............................................................................................................. 99
Hình 3.17 Ảnh hưởng của dịch nghiền cà chua đến khả năng nhân nhanh protocorm
của hạt nhân tạo sau quá trình bảo quản ....................................................... 103
Hình 3.18 Nhân nhanh protocorm và chồi sau quá trình bảo quản hạt giống nhân
tạo.................................................................................................................. 103
Hình 3.19 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của chồi lan Nghệ tâm ........ 105
Hình 3.20 Ảnh hưởng của PAA đến khả năng tạo rễ của lan Hạc vỹ ..................... 105
Hình 3.21 Cây in vitro đưa ra vườn ươm ................................................................ 106

Hình 3.22 Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống in vitro sau bảo quản hạt nhân tạo lan
Nghệ tâm và Hạc vỹ ..................................................................................... 108


x

Hình 3.23 Sinh trưởng của cây nhân giống in vitro từ hạt nhân tạo sau bảo quản và
cây nhân giống in vitro thông thường ........................................................... 110
Hình 3.24 Ảnh hưởng của các thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống của cây in vitro ........ 112
ở giai đoạn vườn ươm ............................................................................................ 112
Hình 3.25 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn vườn
ươm ............................................................................................................... 114
Hình 3.26 Cây in vitro lan Nghệ tâm giá thể rêu + đá bọt (50:50) ......................... 114
Hình 3.27 Cây in vitro lan Hạc vỹ trên giá thể rêu + xơ dừa (70:30) ..................... 115
Hình 3.28 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến chiều cao của cây in vitro
giai đoạn vườn ươm ...................................................................................... 116
Hình 3.29 Ảnh hưởng của loại chế phẩm dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của
cây in vitro giai đoạn vườn ươm................................................................... 117
Hình 3.30 Ảnh hưởng của loại giá thể đến chiều cao cây của lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
giai đoạn vườn sản suất ................................................................................ 119
Hình 3.31 Ảnh hưởng của một số loại chế phẩm dinh dưỡng đến đường kính thân của
lan Nghệ tâm và Hạc vỹ giai đoạn vườn sản suất......................................... 122
Hình 3.32 Ảnh hưởng của liều lượng phun Superthrive đến chiều cao cây của lan
Nghệ tâm và Hạc vỹ ở giai đoạn vườn sản suất ........................................... 124
Hình 3.33 Thí nghiệm phun Superthrive trên cây lan Nghệ tâm ........................... 125
Hình 3.34 Thí nghiệm phun Superthrive trên cây lan Hạc vỹ ................................ 125
Hình 3. 35 Sơ đồ tóm tắt quy trình kỹ thuật trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ in
vitro ở giai đoạn vườn ươm và vườn sản xuất .............................................. 127

1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) là một trong những chi lớn nhất của họ Lan
(Orchidaceae), ước tính có khoảng 1.184 loài (Leitch et al., 2009) và được phân bố
từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á Thái Bình Dương đến New Zealand
(Govaerts et al., 2011). Ở Việt Nam, chi lan Hoàng thảo có khoảng 110 loài (Leonid
et al., 2013) và được đánh giá cao vì hoa có sự đa dạng về kiểu dáng, màu sắc, hoa
nở vào nhiều thời điểm khác nhau với độ bền dài, có thể lên đến 10 tuần. Cũng chính
vì vậy mà nhiều loài lan thuộc chi Dendrobium ở Việt Nam đã bị khai thác cạn kiệt
phục vụ nhu cầu trang trí, thưởng ngoạn. Ngoài giá trị làm cảnh, một số loài
Dendrobium còn được sử dụng làm thực phẩm, đồ uống, gia vị, hương thơm, thuốc
chữa bệnh và cả trong đời sống tinh thần như nghệ thuật, tôn giáo (Arditti and
Pridgeon, 2013).
Nghệ tâm (Dendrobium loddigesii Rolfe) và Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum
(Roxb.) Fisher) thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) là hai loài lan rừng đẹp, có giá
trị y học và giá trị thương mại cao. Theo y học cổ truyền Trung Quốc, Nghệ tâm có
tác dụng ngăn ngừa tế bào ung thư dạ dày, ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai
et al., 2010); ung thư tuyến giáp, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư thực quản, ung thư
tuyến tụy, có tác dụng điều trị bệnh tiểu đường (Veronika Cakova et al., 2017); làm
trắng da (Ho Kyung Jung et al., 2015). Hạc vỹ dùng trị ho, đau họng, bỏng lửa, toàn
cây điều trị kinh phong trẻ em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).
Trong xu thế nhu cầu sử dụng làm cây hoa cảnh và dược liệu tăng mạnh những
năm gần đây, hai loài Nghệ tâm và Hạc vỹ đã bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên
liệu đang trở nên cạn kiệt. Mặt khác, do tỷ lệ nảy mầm từ hạt trong tự nhiên rất thấp
và vùng phân bố của Nghệ tâm và Hạc vỹ bị thu hẹp nên hai loài lan này đang trong
tình trạng gần như mất dần trong tự nhiên và được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam năm
2007 (Nguyễn Tiến Hiệp et al., 2009) và hạng mục IUCN (Romand-Monnier,
2013) phải được bảo vệ. Vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ nhân giống phục vụ cho

công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan này là rất cần thiết. Một trong các biện
pháp hữu hiệu để nhân nhanh và bảo tồn các loài lan quý hiếm nói chung và Nghệ


2

tâm, Hạc vỹ nói riêng là kỹ thuật nhân giống in vitro và tạo hạt giống nhân tạo, kéo
dài quá trình bảo quản và cung cấp hạt giống cho sản xuất. Nhằm góp phần làm
phong phú nguồn dược liệu quý của Việt Nam, làm đẹp môi trường cảnh quan, nâng
cao thu nhập cho người trồng lan, chúng tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm
sinh học và kỹ thuật nhân giống phục vụ bảo tồn hai loài lan Nghệ tâm (Dendrobium
loddigesii Rolfe), Hạc vỹ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) Fisher) của Việt Nam”.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu đánh giá các đặc điểm sinh học cơ bản và biện pháp kỹ thuật nhân
giống in vitro phục vụ công tác bảo tồn và phát triển hai loài lan quý Nghệ tâm và
Hạc vỹ, từng bước góp phần vào sản xuất cây dược liệu, cây cảnh có giá trị của Việt
Nam.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Các kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị về một
số biện pháp kỹ thuật nhân giống dựa trên các đặc điểm sinh học của hai loài lan
Nghệ tâm và Hạc vỹ, góp phần bảo tồn, khai thác và phát triển chúng một cách phù
hợp trong điều kiện Việt Nam.
Các kết quả nghiên cứu có tính hệ thống về đặc điểm nông sinh học, dược tính
và công nghệ tạo hạt giống nhân tạo lan Nghệ tâm và Hạc vỹ là nguồn tư liệu có giá
trị, làm cơ sở cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo, bổ sung vào tài liệu giảng
dạy chuyên ngành trong các trường đại học, các chương trình phổ biến kiến thức cho
cộng đồng.
3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả đề tài đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn hai loài lan dược liệu

quý Nghệ tâm và Hạc vỹ của Việt Nam thông qua việc thu thập và lưu giữ với đầy
đủ các thông tin bộ giống gốc bản địa.
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, đề tài đã nhân giống và tạo được hạt giống
nhân tạo cùng số lượng lớn cây giống sạch bệnh, khỏe với hệ số nhân cao, góp phần
mở rộng diện tích trồng hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ cho mục đích sản xuất dược
phẩm và mỹ phẩm phục vụ nội tiêu và hướng tới xuất khẩu với hiệu quả kinh tế cao.


3

4. Những đóng góp mới của đề tài
- Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống về các đặc điểm hình thái, cấu trúc
vi phẫu và thành phần hóa sinh của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ
(D. aphyllum) có giá trị làm thuốc và làm cảnh cao.
- Đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho hai loài lan quý Nghệ tâm
và Hạc vỹ phù hợp với điều kiện của Việt Nam, dễ áp dụng với nguồn nguyên vật
liệu trong nước nên có tính khả thi cao.
- Quy trình tạo hạt giống nhân tạo và nhân giống in vitro sau bảo quản hạt hai
loài lan đã kéo dài được thời gian bảo quản với tỷ lệ hạt nảy mầm từ 68% đến 70%,
chi phí thấp và giữ được đặc tính giống.
- Đã xác định được các biện pháp kỹ thuật cơ bản trong sản xuất cây giống in
vitro và vườn sản xuất làm cơ sở để xây dựng quy trình công nghệ hoàn chỉnh về kỹ
thuật sản suất hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ ở Việt Nam.


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Nguồn gốc và phân bố của hai loài lan Nghệ tâm (D. loddigesii) và Hạc vỹ
(D. aphyllum) của Việt Nam

Chi Hoàng thảo (Dendrobium) được đặt tên vào năm 1799, Dendrobium được
hiểu là lan sống trên cây, tiếng Việt Nam gọi là lan Hoàng thảo (Trần Duy Quý, 2005).
Theo Trần Hợp (1998); Leitch et al., (2009) lan Hoàng thảo thuộc chi Hoàng thảo
(Dendrobium), họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), phân lớp Hành
(Liliidae), lớp một lá mầm (Liliopsida).
Các loài lan Hoàng thảo có mặt ở tất cả các vùng sinh thái trong cả nước, phân
bố chủ yếu ở vùng núi suốt từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển Việt Nam.
Các đại diện của chi Hoàng thảo chủ yếu sống phụ sinh trên thân hoặc các cành cây
ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên đá, thường ở nơi ẩm, mọc ở độ cao 500 1500m so với mực nước biển, nhưng đôi khi mọc ở độ cao 200m hoặc tới 2000m
(Dương Đức Huyến, 2007).
Trên thế giới lan Nghệ tâm phân bố ở Trung Quốc, Lào. Ở Việt Nam phân bố tại
Thái Nguyên, Hà Giang, Lai Châu, Nghệ An (Averyanov et al., 2005). Lan Hạc vỹ
phân bố ở Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào, Malaixia và
ở Việt Nam phân bố tại Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai, Bắc Cạn, Ninh Thuận
(Averyanov et al., 2005; Sách đỏ Việt Nam, 2007).

1.2 Một số đặc điểm thực vật học chính của hai loài lan Nghệ tâm (D.
loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum)
Một số đặc điểm thực vật chính của hai loài lan Nghệ tâm và Hạc vỹ được trình
bày ở bảng 1.1 và minh họa ở hình 1.1.
Bảng 1.1 Đặc điểm thực vật chính của hai loài lan nghiên cứu
Đặc điểm
Thân

Nghệ tâm (D. loddigesii)

Hạc vỹ (D. aphyllum)

Lan sống phụ sinh, mọc bụi

Lan sống phụ sinh, thân

nhỏ, thân mềm buông xuống dài buông xuống, mảnh dài 100
cm. (Trần Hợp, 1998).


5

10 - 20 cm, có đốt thưa (Trần
Hợp, 1998).
Lá thuôn hình giáo, dài 4 - 6

Lá xếp thành hình mác

cm, rộng 1 - 2 cm, dễ rụng (Trần nhọn, dài 6 - 8 cm, rộng 1,5 - 2

Lá

Hợp, 1998).

cm (Sách Đỏ Việt Nam, 2007).

Cụm hoa mọc ở nách lá, 1 - 2

Cụm hoa bên, 1 - 3 hoa,

hoa, mọc trên các thân mang lá, mọc suốt dọc chiều dài thân
màu hơi đậm (gân đỏ) có đốm không mang lá, màu tím nhạt
đậm. Cánh môi tròn, mép có hay hơi trắng. Cánh môi màu

Hoa

nhiều lông mịn và ở giữa có màu vàng nhạt có 3 gân. Mùa hoa
vàng nghệ. Mùa hoa tháng 4 - 8 tháng 4 - 5 (Trần Hợp, 1998;
(Trần Hợp, 1998; Zhu Guanghua Sách Đỏ Việt Nam, 2007).
et al., 2009).

Lan Nghệ tâm (D. loddigesii)

Lan Hạc vỹ (D. aphyllum)

Hình 1.1 Cây hoa lan Nghệ tâm và Hạc vỹ
(Nguồn ảnh: Nguyễn Thị Lài - Trung tâm Sinh học Thực nghiệm)

1.3 Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của chi lan Hoàng thảo (Dendrobium)
- Nhiệt độ
Lan Hoàng thảo thuộc loại cây ưa ấm, sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 24 - 330C. Dưới


6

120C và trên 370C đều làm chậm và ảnh hưởng lớn đến sự ra hoa của cây, do đó ở các
tỉnh phía Bắc có mùa đông lạnh và mùa hè nóng phải hạn chế tác động xấu của nhiệt
độ, như mùa đông che phủ nilon quanh nhà trồng lan hoặc bổ sung ánh sáng nhân
tạo...mùa hè che lưới phản quang, có hệ thống tưới phun thích hợp, để tạo điều kiện
thông thoáng trong nhà lan giúp cho cây sinh trưởng phát triển tốt (Nguyễn Thị Kim
Lý, 2009).
- Ẩm độ
Độ ẩm thích hợp cho lan Hoàng thảo từ 50 - 75%. Độ ẩm dưới 50% Hoàng thảo
phát triển kém. Nhiệt độ, ánh sáng và độ ẩm có liên quan hài hòa và mật thiết với

nhau để cây sinh trưởng và phát triển tối ưu. Trong những tháng mùa hè cần tăng độ
ẩm lên bằng cách phun nước thường xuyên (Sushanta Kumar Naik and Usha
Bharathi, 2012).
- Ánh sáng
Chi lan Hoàng thảo thuộc loại cây ưa sáng, có thể chịu được ánh nắng trực tiếp.
Cường độ ánh sáng để cây tăng trưởng và ra hoa tốt nhất là 25.000 - 30.000 lux. Nơi
có cường độ ánh sáng quá cao, cần che bóng. Ánh sáng tối ưu sẽ làm cho hoa nở đẹp
và bền, thiếu ánh sáng sẽ làm cho lá chuyển sang màu xanh nhạt. Ánh sáng quá cao
sẽ làm các đầu lá chuyển từ màu vàng - trắng rồi tới màu nâu, mặt dưới của lá xuất
hiện những vết đốm gọi là vết cháy nắng (Sushanta Kumar Naik and Usha Bharathi,
2012).

1.4 Giá trị sử dụng và thực trạng khai thác hai loài lan Nghệ tâm (D.
loddigesii) và Hạc vỹ (D. aphyllum) ở Việt Nam
Chi Hoàng thảo (Dendrobium) lớn thứ hai trong họ lan, có khoảng 1.184 loài và
đã được lai tạo thêm rất nhiều loài mới, phân bố ở các vùng nhiệt đới, tập trung nhiều
ở Châu Á và Châu Úc. Nếu ở các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc chi Cattleya
tuyệt đẹp, thì các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện về chi Hoàng thảo vô cùng
phong phú, đa dạng về kiểu dáng hoa, nhiều loài có hương thơm, hoa rất bền từ 45 60 ngày, có loài tới 70 ngày, thậm chí có loài nở suốt quanh năm bởi các chồi hoa
mới luôn thay thế các chồi hoa cũ. Chi lan Hoàng thảo có khả năng thích nghi rộng
với điều kiện sống, phân bố rất rộng nên có ý nghĩa thương mại lớn.


7

Trong y học cổ truyền lan Nghệ tâm có tác dụng chống tế bào ung thư dạ dày và
ung thư phổi, chất chống đông máu (Tsai et al., 2010), điều trị bệnh tiểu đường type
2 (Zhang et al., 2011). Lan Hạc vỹ có tác dụng trị ho, đau họng, trị phong kinh ở trẻ
em, ăn uống bị ngộ độc (Sách Đỏ Việt Nam, 2007). Bộ phận được sử dụng làm dược
liệu của hai loài lan này chủ yếu là thân lá. Lan Nghệ tâm và Hạc vỹ không chỉ được

tiêu thụ trong nước mà còn được các thương lái Trung Quốc thu gom và xuất khẩu
tiểu ngạch. Giá của các cây lan này được bán trên thị trường từ 700.000 - 900.000
đồng/kg cây tươi.
Trên thị trường các loại thực phẩm chức năng có nguồn gốc tự nhiên từ lan Hạc
vỹ, Tam bảo sắc và Thạch hộc rỉ sắt, được bán với giá rất cao 2.000 - 4.000 USD/kg
(Weichao Zhang et al., 2009).
Do có giá trị làm hoa cảnh, dược liệu và giá trị kinh tế cao nên lan Nghệ tâm và
Hạc vỹ trong một số năm gần đây đã bị khai thác quá mức dẫn đến nguy cơ mất hẳn
trong tự nhiên. Năm 2007 lan Hạc vỹ đã có trong danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt
Nam”. Lan Nghệ tâm được báo cáo tại “Hội nghị Sinh thái và Tài nguyên sinh vật,
2009 - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật” là loài thực vật bị đe dọa.

1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới
và ở Việt Nam
1.5.1 Sản xuất và tiêu thụ lan Hoàng thảo (Dendrobium) trên thế giới
Hoa Lan chiếm một phần lớn trong thương mại toàn cầu về hoa chậu và hoa cắt
cành. Ước tính khoảng 10% hoa tươi cắt cành được thương mại trên thị trường quốc
tế. Giá trị thương mại trung bình của hoa lan cắt cành từ năm 2007 đến năm 2012 là
483 triệu USD (Jayarama Reddy, 2016). Hawaii, California và Florida là những vùng
trồng Dendrobium trong chậu lớn tại Mỹ. Giá trị mặt hàng này ở Hawaii đã được xác
nhận trong nhiều thập kỷ và doanh thu tăng từ 2,4 triệu USD năm 1991 lên 5,6 triệu
USD trong năm 2000 (De and Debnath Correct, 2011). Năm 2012, trên thế giới đã có
hơn 40 nước xuất khẩu hoa lan và 60 nước nhập khẩu hoa lan với tổng giá trị thương
mại toàn cầu là 504.740.644 USD (Jayarama Reddy, 2016).
Hà Lan là nước dẫn đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan (39,7%), tiếp
theo là Thái Lan (28,4%), Đài Loan (10%), Singapore (10%) và New Zealand (6%).


8

Các nước nhập khẩu chủ yếu là Nhật Bản (30%), Anh (12%), Ý (10%), Pháp (7%)
và Mỹ (6%). Tổng số lan cắt cành thương mại trên thế giới chủ yếu các loài lan
Dendrobium chiếm 85% và Phalaenopsis, Cymbidium chiếm 15% (Cheamuangphan
et al., 2013; De et al., 2014). Tại Hà Lan, việc sản xuất hoa lan Dendrobium trong
chậu đã tăng ổn định đạt 40 đến 50 triệu cây (De et al., 2014).
Thái Lan là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới về các loài lan cắt cành nhiệt đới và
là nhà cung cấp lớn thứ hai chiếm 22% nguồn cung vào thị trường EU. Thái Lan có
vị thế mạnh trong sản xuất lan Hoàng thảo (De et al., 2014). Năm 2012, tại Thái Lan
ước tính 46% sản lượng hoa lan đã được tiêu thụ trong nước và 54% được xuất khẩu
(Thammasiri, 2015).
1.5.2 Sản xuất và tiêu thụ hoa lan Hoàng thảo (Dendrobium) ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên chủng loại
lan rừng rất phong phú, đặc biệt có điều kiện khí hậu thuận lợi thích hợp phát triển
các loài lan thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium), chi Cát lan (Cattleya), chi lan Vũ
nữ (Oncidium). Diện tích trồng hoa lan ở Việt Nam còn ở mức hết sức khiêm tốn, chỉ
chiếm 10% tổng diện tích các loại hoa đang được trồng. Sản xuất hoa lan ở Việt Nam
tập trung theo 2 hướng chính là sản xuất theo quy mô công nghiệp các loài lan mới
lai tạo hoặc được nhập nội (lan công nghiệp); Khai thác và nuôi trồng các loài hoa
lan bản địa (lan rừng).
Lan bản địa (lan rừng) chủ yếu được nuôi trồng nhỏ lẻ ở quy mô hộ gia đình, tập
trung chủ yếu ở Hà Nội và một số vùng phụ cận. Xã Đông La, La Phù, La Khê thuộc
huyện Hoài Đức - Hà Nội những năm gần đây trở nên nổi tiếng với nghề trồng lan.
Đây được coi là trung tâm nuôi trồng phong lan rừng lớn nhất miền Bắc và chủ yếu
là chi lan Hoàng Thảo. Bên cạnh Hoài Đức, một số địa phương như Gia Lâm, Đông
Anh (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên), Mộc Châu (Sơn La), Phổ Yên (Thái Nguyên)
cũng đã có nhiều hộ gia đình tập trung đầu tư vào sản xuất và nuôi trồng phong lan
bản địa, với quy mô từ 300 - 500m2,…(Hoàng Xuân Lam, 2014).
Ở TP. Hồ Chí Minh chủ yếu trồng các loài lan của chi Hoàng thảo, Cát lan, Vũ
nữ…với diện tích khoảng 200ha, bằng 5,4% diện tích so với hoa lan của Thái Lan.
Ở miền Bắc, một số cơ quan nghiên cứu như Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện

9

Nghiên cứu Rau quả, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Viện Ứng dụng Công nghệ,...
trong những năm vừa qua đã tập trung nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính
in vitro. Kết quả đã sản xuất mỗi năm được hàng vạn cây con các loài hoa lan có giá
trị trong đó có lan Hoàng thảo.
Năm 2015, Viện Di truyền Nông nghiệp đã xây dựng mô hình nhân giống các
giống hoa lan Hoàng thảo ở Văn Giang - Hưng Yên với diện tích 1.000m2 quy mô
30.000 cây/năm, mô hình sản xuất hoa thương phẩm diện tích 15.000m2, sản xuất
được 60.000 cây giống. Doanh thu đạt 280 triệu/1.000m2.
Đối với thị trường trong nước, sản lượng hoa phong lan cũng chưa đáp ứng được
nhu cầu của người tiêu dùng. Các cơ sở sản xuất hoa lan cũng chỉ đáp ứng được 30 40% nhu cầu lan cắt cành còn lại phải nhập từ các nước khác. Hiện nay, mỗi năm
Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ đồng để nhập phong lan từ các nước láng giềng cho
nhu cầu nội địa. Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của Việt Nam trong thời
gian qua là Thái Lan với gần 90% lượng lan cắt cành (Dendrobium) và lan chậu
(Cattleya, Oncidium) (Minh Trí và cs., 2010).
Ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nào công bố về sản xuất sản phẩm chức
năng và thuốc từ lan Hoàng thảo (Dendrobium). Chỉ có một số người dân tộc vùng
núi lấy quả tươi ngâm rượu hoặc lấy cây tươi và cây khô để sắc uống chữa bệnh.
Như vậy, vấn đề sản xuất, kinh doanh, hoa lan ở Việt Nam từ trước đến nay vẫn
ở dạng tiềm năng. Trong khi đó, sức cạnh tranh trên thị trường thế giới là rất lớn.
Những hoạt động kinh doanh và xuất khẩu trong thời gian qua chỉ mới có ý nghĩa
khởi động, hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những điều kiện thuận
lợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan.

1.6 Cơ sở khoa học về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo
1.6.1 Bảo tồn hoa lan
Trên thế giới nhiều loài lan đang có nguy cơ tuyệt chủng, hiếm và được liệt kê

trong phụ lục II của CITES, do nhiều nguyên nhân như biến đổi khí hậu, khai thác
quá mức, buôn bán bất hợp pháp và lấn chiếm đất đai. Hoa lan được biết đến như là
cây cảnh quan trọng ở Việt Nam, đặc biệt là lan rừng. Các loài lan rừng của Việt Nam
nổi tiếng với vẻ đẹp và tính năng riêng biệt của chúng và đang có nhu cầu sử dụng


10

làm cảnh và làm thuốc cao trên toàn thế giới. Do đó cần có các biện pháp kỹ thuật để
nhân giống, bảo tồn và phát triển loài lan có giá trị của Việt Nam.
Hoa lan, có thể được duy trì trong tự nhiên (bảo tồn in situ) và chuyển khỏi môi
trường sống của chúng (bảo tồn ex situ). Bảo tồn in situ là cách tốt nhất để bảo tồn sự
đa dạng di truyền các loài lan, nhưng nó rất khó khăn để duy trì trong một thời gian
dài và có nguy cơ bị mất do bị sâu bệnh, sinh học và stress phi sinh học. Ngoài ra, rất
tốn kém do sử dụng lao động và đất. Bảo tồn nguồn gen bằng nuôi cấy mô có thể mất
một thời gian dài và phải cấy chuyển nhiều lần. Việc duy trì lan trong ống nghiệm rất
tốn kém, mất thời gian, có thể xảy ra biến dị soma và mất nguyên liệu do bị nhiễm.
Để khắc phục những vấn đề này, tạo hạt giống nhân tạo và bảo quản lạnh được sử
dụng để bảo tồn đa dạng di truyền của chúng (Montakarn Pimsen, 2014). Đây là cơ
sở khoa học để đề tài ứng dụng kỹ thuật này trong công tác bảo tồn hai loài lan Nghệ
tâm và Hạc vỹ.
1.6.2 Các kỹ thuật về nhân giống và tạo hạt giống nhân tạo hoa lan
1.6.2.1 Nhân giống hữu tính
Hạt lan rất nhỏ, có cấu tạo không hoàn chỉnh. Một quả lan có thể chứa 1.300 4.000.000 hạt. Hạt lan có hình dạng, kích thước và màu sắc rất khác nhau. Hầu hết
các hạt lan có chiều rộng 0,09 - 0,27 mm và chiều dài 0,25 -1,2 mm. Trọng lượng hạt
từ 0,0003 - 0,0014 mg (0,3 - 1,4 µg). Các hạt có chứa một phôi nhỏ, thiếu nội nhũ,
do đó muốn hạt nảy mầm phải tạo đủ điều kiện dinh dưỡng và môi trường. Mặt khác,
trong tự nhiên hạt lan phải được nhiễm nhiều loại nấm kí sinh thuộc chi Rhizoctonia
mới có thể nảy mầm được. Quá trình nhân giống từ gieo hạt cho đến khi cây ra hoa
mất thời gian rất dài có thể từ 3 - 4 năm. Tuy nhiên, nhân giống hữu tính thường xảy

ra biến dị nên sẽ không thuận lợi cho việc sản xuất hạt đồng nhất về mặt di truyền
(Montakarn Pimsen, 2014).
1.6.2.2 Nhân giống vô tính
Một số phương pháp nhân giống vô tính bằng tách chồi vượt, giâm hom nhưng
đều cho hệ sống nhân giống thấp, cần diện tích lớn, cần nhiều cây mẹ, cây dễ bị bệnh,
nhanh bị lão hóa, khả năng sinh trưởng kém, rất khó sử dụng vào mục đích thương
mại. Kỹ thuật nuôi cấy mô đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài lan, nhờ


11

kỹ thuật này, những giống lan quý đã có thể nhân giống dễ dàng với hệ số nhân giống
cao, cây đồng đều, ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, có sức sống cao. Có thể dùng
nhiều bộ phận của hoa lan làm bộ phận nuôi cấy như: đỉnh sinh trưởng, mắt ngủ trên
thân, phương pháp lớp mỏng tế bào…
a) Các phương pháp nhân giống in vitro
- Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo
các đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh (Morel, 1960). Khi nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như một số giống cây khác là hình
thành cấu trúc protocorm để sau đó có thể biệt hóa thành cây. Nhân các protocorm
sẽ tạo thành các protocorm mới gọi là protocorm like body (Morel, 1964). Không như
trong nuôi cấy mô sẹo in vitro của những loài thực vật khác, việc thiết lập gen của
protocorm được xác định ngay từ protocorm hình thành ban đầu (Neumann et al.,
2009).
- Thể tiền chồi (Protocorm like body)
Protocorm like body (PLB) là thuật ngữ đề chỉ những cấu trúc giống với
protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh
của chồi bất định ở các loài lan (Joseph and Robert, 1992). Đây là cấu trúc lần đầu
tiên được đặt ra bởi Morel khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những cây

sạch virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là từ hạt.
Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocorm like body
(Morel, 1964). Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về kiểu gen
vừa cho tỷ lệ nhân giống cao.
- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ chức
thực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới lá
mầm, vùng đỉnh hay phôi). Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang (tTCL).
Các 1TCL chỉ chứa một loại mô như tầng các tể bào biểu bì nhưng các tTCL lại bao
gồm các tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ, tầng phát sinh gỗ,
quanh mạch và lõi, nhu mô. Nuôi cấy các TCL có thể phân lập các tế bào, các tầng


12

mô và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngoài gen, các điều kiện sinh
trưởng có kiểm soát (ánh sáng, nhiệt độ, pH, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, các
chất bổ sung vào môi trường...) dẫn tới sự cảm ứng in vitro phát sinh hình thái. Khả
năng phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu tố như: sự nhận biết các dấu
hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để đáp ứng và phản ứng với các
dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay tổ chức) của TCL, các yếu tố
stress, các trạng thái im lặng của gen. Các tế bào trong TCL có thể phản biệt hóa dẫn
đến việc thiết kế các kiểu hình. Trong các TCL, con đường phát sinh hình thái của
những mô chuyên trách xuất phát từ các tế bào, các mô có thể được điều khiển và
kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về sự thay đổi phân tử, sinh lý, sinh hóa có
thể xảy ra. Các TCL cũng sử dụng trong tăng cường trao đổi các hợp chất thứ cấp,
dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức chuyển gen, nuôi cấy thực vật tự dưỡng bằng
bioreactor (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Các lớp tế bào mỏng đã được sử dụng thành công trong thể tiền chồi (protocormlike body) và tạo callus ở Aranda, Coelogyne cristata, Cymbidium spp., Dendrobium
spp., Doritaenopsis, Paphiopedilum, Renanthera, Rhynchostylis, Spathoglottis và

Xenikophyton. (Jaime A. Teixeira da Silva, 2013b).
b) Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro
Có nhiều loại môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi nhân giống hoa lan như:
Knuson C (1946), Murashige & Skoog (MS) (1962), Vacin & Went (VW)
(1949)…Mỗi loại môi trường đều có chất vi lượng và đa lượng, vitamin khác nhau.
Nói chung, sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro đều phụ thuộc vào môi trường
nuôi cấy.
- Các hợp chất hữu cơ tự nhiên
Một số lượng lớn các chất hữu cơ tự nhiên như: peptone, nước ép cà rốt, nước ép
cà chua, chiết xuất từ thịt bò, dịch khoai tây, nước dừa và dịch chuối, dịch bí ngô,
tảo,…thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng rất tốt trong việc
phát triển cây giống đã được báo cáo ở nhiều loài lan như: Nước dừa được bổ sung
vào môi trường nuôi cấy hoa lan để kích thích mô sẹo hoặc hình thành protocorm và
thường được sử dụng là 10 - 25%. Nước dừa 30% cho tỷ lệ phôi nảy mầm tối đa với


13

lan D. ovatum (Willd.) (Thejaswini et al., 2017).
Dịch nghiền cà chua thường được bổ sung vào môi trường vi nhân giống hoa lan
và có hiệu quả với một số loài lan như: D. noblie (Soares et al., 2013, D. ovatum
(Willd.) (Thejaswini et al., 2017). Bổ sung bột tảo Spirulina ở nồng độ 50 mg/l có
tác động hiệu quả đến tỷ lệ sống của chồi và số chồi đạt của lan Paphiopedilum
delenatii (Nguyễn Thị Cúc và cs., 2014).
Than hoạt tính được bổ sung vào môi trường giúp làm giảm độc tố bằng cách đào
thải các hợp chất độc phenolic tiết ra trong thời gian nuôi cấy. Bổ sung than hoạt tính
có tác dụng hiệu quả lên sự phát sinh và tăng sinh mô sẹo, sự phát sinh phôi và nhân
phôi cũng được đề cập trên đối tượng D. dixanthum (Su et al., 2014).
Không chỉ có các chất hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy,
các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy

hoa lan. Có hai nhóm chính của điều hòa sinh trưởng thực vật: cytokinin và auxin.
Các cytokinin thường được dùng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật: BA, kinetin
và TDZ để kích thích sự phân chia tế bào, gây ra sự hình thành chồi và sự gia tăng
chồi nách và làm chậm sự hình thành rễ. Các Auxin (2,4-D, αNAA, IAA và IBA)
thường được dùng trong nuôi cấy hoa lan để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá
rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ. Ngoài ra, Axit
abscisic (ABA) được bổ sung để ức chế hoặc kích thích sự phát triển mô sẹo, thúc
đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân phôi thứ cấp, ngăn cản sự
nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng (Saad et al., 2012).
- Các hợp chất chứa carbon
Carbon là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy cho sự tăng trưởng
và phát triển của các mô. Hiện nay cacbon được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vì
thiếu ánh sáng và nồng độ CO2 thấp trong điều kiện in vitro. Đường đã được sử dụng
như một nguồn carbon và như là cơ quan quản thẩm thấu trong môi trường nuôi cấy.
Có nhiều loại đường được sử dụng trong nuôi cấy in vitro như: sucrose, glucose,
maltose, fructose, lactose và sorbitol. Sucrose ở nồng độ 20 và 30 g/l được sử dụng
phổ biến nhất trong nghiên cứu nuôi cấy mô hoa lan (Montakarn Pimsen, 2014).
1.6.2.3 Tạo hạt nhân tạo và ứng dụng trong nhân giống cây trồng