Tóm tắt Luận án tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM) của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ MINH HẰNG 

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, 
GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN 
SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ 
BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ 
AGROBACTERIUM

Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 9420116

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


HÀ NỘI – 2019


Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:  1. TS. Nguyễn Trung Nam 
                Viện Công nghệ sinh học
            2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
                 Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: PGS. TS. Đồng Huy Gới
Phản biện 2: GS. TS. Đậu Ngọc Hào
Phản biện 3: GS. TS. Chu Hoang Mậu

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính 
thức tại Viện Công nghệ sinh học
Vào hồi ……giờ….., ngày…..tháng…..năm 2019.

Có thể tìm hiểu luận án tại:


­ Thư viện Quốc gia Việt Nam
­ Thư viện Viện Công nghệ sinh học
­ Trang web của Bộ GD & ĐT
NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyên Thi Minh Hăng
̃
̣
̀ , Hô Thi Th
̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich
̃
̣
́  

Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha (
̣
̃
̀
̀ 2017).  Tách dòng và đồng biểu 
hiện gen mã hóa hai loại kháng nguyên vỏ  GP5ecto (vùng ngoại bào) và M 
của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Tap chi Khoa hoc
̣
́

̣  
ĐHQGHN: Khoa hoc T
̣ ự nhien va Cong ngh
̂ ̀ ̂
ẹ, T
̂ ạp 33(1S): 150­158.
̂
2. Nguyên Thi Minh Hăng
̃
̣
̀ , Hô Thi Th
̀ ̣
ương, Nguyên Thu Giang, Pham Thi
̃
̣
̣ 

Vân, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha (
̣
́
̣
̃
̀
̀ 2017).   Biểu 
hiện và tinh sạch protein M của virus PRRS gây bệnh lợn tai xanh bằng công 
nghệ  biểu hiện tạm thời trong lá thuốc lá Nicotinana benthamiana. Tap chí
̣
 
Công nghệ Sinh hoc̣  15(3): 547­554.
3. Nguyên Thi Minh Hăng

̃
̣
̀ , Hô Thi Th
̀ ̣ ương, Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung
̣
́
̣
̃
 

Nam, Chu Hoang Ha (
̀
̀ 2018). Xác định khả năng kích thích tạo kháng thể đặc 
hiệu của kháng nguyên tái tổ  hợp GP5­ELP của virus PRRS gây hội chứng 
rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn trên động vật thí nghiệm. Tạp chí Khoa  
học kỹ thuật thú y. Tập 25(5): 35­42.
4. Nguyên Thi Minh Hăng
̃
̣
̀ , Hô Thi Th
̀ ̣ ương, Nguyễn Thu Giang, Pham Bich
̣
́  

Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha (
̣
̃
̀
̀ 2018).  Nghiên cứu tối  ưu các 
điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M của virus PRRS  

trong lá cây thuốc lá  Nicotinana benthamiana.  Tap chí Công ngh
̣
ệ  Sinh hoc̣  
16(2): 293­300.
5. Nguyên Thi Minh Hăng
̃
̣
̀ , Pham Bich Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha
̣
́
̣
̃
̀
̀ 

(2018).  Đánh   giá   khả   năng   kích   thích   đáp   ứng   kháng   thể   đặc   hiệu   của   kháng  


nguyên M và GP5ectom/PRRSV được sản xuất từ  thực vật trên chuột bạch. Hội  
nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2018: 194­199.
6. Nguyên Thi Minh Hăng
̃
̣
̀ , Hô Thi Th
̀ ̣ ương, Nguyên Thu Giang, Pham Bich
̃
̣
́  

Ngoc, Nguyên Trung Nam, Chu Hoang Ha (

̣
̃
̀
̀ 2016). Đánh giá sự biểu hiện tạm 
thời   kháng nguyên  GP5  tái  tổ  hợp của  virus  PRRS  trong mô   lá thuốc  lá 
Nicotinana tabacum. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc lần thứ IV, khu  
vực phía nam, 2016: “Ứng dụng Công nghệ  sinh học vào thực tiễn”; P1­
14:57.
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hội   chứng   rối   loạn   sinh   sản   và   hô   hấp   ở   lợn   (Porcine   reproductive   and  
respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm nguy hi ểm trên lợn do virus 
gây ra. Ở Việt Nam, bệnh còn đượ c gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (theo ngôn ngữ đại 
chúng) do lợn mắc bệnh th ường b ị xung huy ết  ở tai, lúc đầu đỏ sẫm, sau tím xanh. 
PRRS gây thiệt hại kinh t ế r ất l ớn  ở nh ững n ước có bệnh. PRRS đượ c phát hiện ở 
Mỹ vào năm 1987. Hàng năm nướ c Mỹ phải chịu những thi ệt hại do b ệnh này ướ c 
tính khoảng 664 tri ệu USD cho vi ệc tiêu huy l
̉ ợn chêt, l
́ ợ n ôm, chi phi chông dich
́
́
́
̣  
va x
̀ ử ly môi tr
́
ươ ̀ng.
Ở  Việt Nam, dich PRRS do virus th
̣
ể độc lực cao xuất hiện lần đầu tiên vào  

năm 2007. Từ đo đên nay, dich đa
́ ́
̣
̃ xuât hi
́ ện  ở  hâu hêt cac đia ph
̀
́ ́ ̣
ươ ng trong cả 
nươ ́c. Theo thống kê của Cục Thú y, từ  cuối tháng 4/2016 đến tháng 11/2016, đã 
xuất hiện 14  ổ  dịch PRRS t ại 8 huy ện c ủa 4 t ỉnh là Quảng Trị, Hậu Giang, Ngh ệ 
An và Hà Tĩnh, làm 3.433 con lợn mắc b ệnh, trong đó có 1.242 con lợn bị tiêu huỷ. 
PRRS đã anh hu
̉
̛ở ng nặng nê t
̀ ới nganh chan nuoi l
̀
̆
̂ ợn trong n ước. B ệnh v ẫn xu ất  
hiện  ở  một số  địa phươ ng và có tính chất 2­3 năm một lần. Điều này cũng cho  
thấy nguy cơ xuất hiện tr ở l ại c ủa d ịch b ệnh này trong thời gian tới.
Hiện nay, các vaccine phòng PRRS chủ  yếu là vaccine vô hoạt và nhượ c  
độc. Cac vaccine vô ho
́
ạt thươ ̀ng an toan nh
̀
ưng kh ả năng bao h
̉ ộ thâp. Cac vaccine
́
́
 

nhượ c độc bao h
̉ ộ  tốt hơn nhưng còn nhiều lo ngại về  tính an toàn của các loaị 
vaccine này. Vaccine nhược độc có thể  giam dân m
̉
̀ ức bao h
̉ ộ  do giam m
̉
ưc t
́ ương  
đông v
̀
ới chung m
̉
ới (nếu có) va ban thân virus vaccine sau nhiêu lân truyên nhi
̀ ̉
̀ ̀
̀
ễm  
cũng co thê
́ ̉  đột biên tr
́ ở  thanh c
̀
ường độc. Mặc dù vậy, phòng chống PRRS tại  
Việt Nam đã đạt hiệu quả  cao. Hiện nay, d ịch ch ỉ  xu ất hi ện l ẻ  t ẻ, trong nh ững  
năm gần đây hầu như  không có dịch, một phần là nhờ  biện pháp chủ  động tiêm 
phòng cho lợn.
Virus gây Hội chứng rối loạn sinh s ản và hô hấp  ở  lợn  ở  nướ c ta hiện nay  
được xác định là thể  độc lực cao và chưa có thuốc đặc trị. Việc phòng chống dịch 
chủ  yếu vẫn là tiêm phòng vaccine kết hợp các biện pháp thú y (Tiêu độc khử 
trùng, vệ  sinh tru ồng tr ại, cách ly và tiêu huỷ  lợn bệnh ...). Để  phòng chống virus 

thể  độc lực cao đang lưu hành tại Việt Nam cần phải có thêm vaccine phù hợp.  


Nhu cầu về  các loại vaccine PRRS th ế h ệ m ới trong đó có vaccine tiểu đơn vị, an 
toàn và hiệu quả hơn là vấn đề cấp thiết. 
Protein GP5 và M là những protein c ấu trúc chính của virus PRRS (PRRSV) 
được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị chống  
PRRSV. Các kháng thể  kháng GP5 và M  ở  lợn là các kháng thể  có khả  năng trung  
hoà PRRSV. Sự  kết hợp đoạn peptit miền ngoài của  kháng nguyên GP5 (GP5ecto) 
được cho là chứa các epitope trung hoà của GP5 với protein M với mong muốn sẽ tạo  
được protein tái tổ  hợp heterodimer GP5ectoM có khả  năng kích thích tạo đáp  ứng 
miễn dịch mạnh và trở  thành một trong những  ứng viên tiềm năng để  phát triển sản 
xuất vaccine chống PRRSV.
Kháng nguyên của virus PRRS có thể  đượ c sản xuất trong hệ  thống th ực  
vật nhằm phát triển vaccine tiểu đơn vị  phòng PRRS thông qua phươ ng pháp biểu  
hiện gen tạm thời. H ệ th ống bi ểu hi ện gen t ạm th ời  ở th ực v ật b ằng ph ương pháp  
thẩm lọc nhờ   Agrobacterium nhằm sản xuất kháng nguyên có nhiều  ưu điểm như:  
Mức độ  biểu hiện kháng nguyên cao, có thể  sản xuất  ở quy mô lớn, phươ ng pháp 
thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị   ảnh hưở ng bởi vị  trí gắn gen đích 
trong tế bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong các mô đã biệt hóa hoàn 
toàn như  lá, cung cấp kháng nguyên cho mục đích sản xuất vaccine chống ch ủng  
virus mới xuất hiện một cách nhanh chóng khi dịch bệnh xảy ra.
Căn cứ vào các luận cứ khoa học và tình hình thực tiễn nêu trên, luận án được  
thực hiện với đề  tài “Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên (M, GP5, GP5ectoM)  
của virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn trong cây thuốc lá 
bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium” với mục đích tạo cơ  sở  khoa 
học và thực nghiệm để  biểu hiện các  gen mã hoá kháng nguyên của chủng virus 
PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp  ở  lợn đang lưu hành  ở  Việt Nam 
bằng phương pháp biểu hiện gen tạm thời trong thực vật phục vụ  cho định hướng 
phát triển sản xuất vaccine thế hệ mới.

2. Mục tiêu nghiên cứu 
Mục tiêu chung
Nghiên cứu cơ  sở  khoa học và thực nghiệm của việc sản xuất kháng nguyên 
tái tổ  hợp M/GP5/GP5ectoM của chủng virus PRRS (PRRSV) đang gây bệnh lợn tai  
xanh  ở Việt Nam bằng công nghệ  biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá phục vụ  cho 
định hướng phát triển vaccine thế hệ mới.
Mục tiêu cụ thể
Thiết kế được 3 cấu trúc vector chuyển gen mang gen m, gp5optimize (gp5opt) 
và gp5ecto­m của chủng virus thể độc lực cao gây Hội chứng rối loạn sinh sản  
và hô hấp ở lợn dưới sự điều khiển biểu hiện bởi promoter CaMV 35S. 
Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá 3 loại kháng nguyên M , 
GP5 và GP5ectoM của chủng PRRSV thể độc lực cao trong lá cây thuốc lá và  
tinh sạch được kháng nguyên M, GP5 và GP5ectoM tái tổ hợp từ mô lá thuốc lá.
Đánh giá được tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp M, GP5 và GP5ectoM 
trên động vật thí nghiệm.  
 3. Nội dung nghiên cứu


(1) Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang các  gen m/gp5opt/gp5ecto­m  
mã   hoá  kháng   nguyên   M­ELP/   GP5­ELP   /GP5ectoM­ELP   và   tạo   chủng 
Agrobacterium  mang vector tương  ứng; (2) Tối  ưu các điều kiện biểu hiện tạm  
thời  gen  m/  gp5opt/ gp5ecto­m  ở  lá cây thuốc lá  N. benthamiana.  Biểu hiện tạm 
thời và tinh sạch các kháng nguyên M­ELP/ GP5­ELP/ GP5ectoM­ELP tái tổ  hợp; 
(3)  Đánh giá tính sinh miễn dịch dịch thể  của kháng nguyên  M­ELP/ GP5­ELP/ 
GP5ectoM­ELP tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm.
4. Đóng góp mới của luận án
Luận án đã tiến hành thực hiện nghiên cứu một cách tổng thể, từ việc thiết kế 
vector chuyển gen mang các gen mã hóa kháng nguyên của virus PRRS gây bệnh lợn 
tai xanh, tối ưu các điều kiện biểu hiện gen tạm thời trong thực vật, biểu hiện và tinh 
sạch kháng nguyên và đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên tái tổ  hợp trên 

động vật thí nghiệm. 
Luận án là  công trình  nghiên cứu thành công đầu tiên tại Việt Nam về  việc  
thiết kế  vector chuyển gen và biểu hiện tạm thời các gen  m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã 
hoá kháng nguyên tái tổ  hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus 
PRRS gây bệnh lợn tai xanh đang lưu hành tại Việt Nam trong lá cây thuốc lá  N.  
benthamiana bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. 
Kết quả của luận án cũng đã chứng minh được các kháng nguyên tái tổ hợp M­
ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP có khả  năng kích thích sinh kháng thể  đặc hiệu  
kháng virus PRRS trên động vật thí nghiệm. Trong đó,  kháng nguyên GP5ecto (vùng 
ngoại bào của GP5) dung hợp với kháng nguyên M (GP5ectoM­ELP) kích thích đáp 
ứng kháng thể  đặc hiệu tốt hơn kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP riêng lẻ. Kháng  
nguyên GP5ectoM­ELP và GP5­ELP là hai  ứng viên tiềm năng để  sản xuất vaccine 
tiểu đơn vị chống PRRSV thể độc lực cao đang gây bệnh ở Việt Nam.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Luận án cung cấp cơ  sở khoa học quan trọng trong việc thiết kế các cấu trúc 
vector chuyển gen mang gen m/gp5opt/gp5ecto­m mã hóa cho các kháng nguyên tái tổ 
hợp M, GP5 và GP5ectoM của PRRSV dung hợp Elastin ­ like polypeptide (ELP); biểu 
hiện tạm thời kháng nguyên tái tổ hợp trên cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm lọc 
nhờ  Agrobacterium;  tách chiết, tinh sạch và đánh giá khả  năng kích thích đáp  ứng 
miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp này trên động vật thí nghiệm. Kết 
quả  đề  tài luận án là bằng chứng khoa học về  tiềm năng của việc sản xuất, phát  
triển vaccine tiểu đơn vị phòng PRRS trong thực vật. 
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m mã 
hóa các kháng nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP của chủng virus  
PRRS đang lưu hành ở Việt Nam và các chủng  A. tumefaciens mang các vector này có 
thể được sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất và phát triển vaccine tiểu đơn vị 
phòng PRRS.
Quy trình biểu hiện gen tạm thời trên lá cây thuốc lá bằng phương pháp thẩm  

lọc nhờ  A. tumefaciens với các điều kiện tối  ưu của đề tài luận án có thể ứng dụng 


để sản xuất các kháng nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP, GP5ectoM­ELP hoặc các 
protein tái tổ hợp khác.
Kháng nguyên tái tổ hợp GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được tạo ra trong đề tài  
luận án là hai ứng viên tiềm năng cho sản xuất vaccine tiểu đơn vị phòng bệnh lợn tai  
xanh ở Việt Nam.
6. Cấu trúc của luận án
Luận án gồm 131 trang (Từ Mở đầu đến Kết luận và kiến nghị, không bao gồm  
Danh mục các công trình công bố, Tóm tát luận án bằng Tiếng Anh, tài liệu tham  
khảo và các phụ  lục), được chia thành các phần: Mở  đầu gồm 5 trang; Chương 1:  
Tổng quan tài liệu, 37 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp, 17 trang; Chương  
3: Kết quả nghiên cứu, 47 trang; Chương 4: Bàn luận kết quả  nghiên cứu, 22 trang;  
Kết luận và đề nghị: 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; 
Tóm tắt luận án bằng tiếng anh: 7 trang; Luận án có 7 bảng số liệu, 51 hình. Ngoài ra,  
tài liệu tham khảo: 229 tài liệu tham khảo, trong đó 14 tài liệu tiếng Việt và 215 tài liệu  
tiếng Anh; Phụ lục: 5 trang; 
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 16 tài liệu trong nước, 217 tài liệu nước ngoài 
với các nội dung liên quan, bao gồm: (1) Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn,  
như: Sơ  lược tình hình dịch bệnh; bệnh tích của PRRS; virus PRRS; (2) Vaccine  
phòng PRRS: Vaccine sống ­ nhược độc; vaccine vô hoạt; các dạng vaccine thử nghiệm 
dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV;  (3) Biểu hiện tạm thời kháng nguyên 
của PRRSV ở thực vật bằng phương pháp thẩm lọc nhờ  Agrobacterium, như: Lợi thế 
của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ  A. tumefaciens; quá trình thẩm lọc nhờ 
A. tumefaciens; một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật. 
Với các dẫn liệu thu thập được, kết quả phân tích cho thấy Hội chứng rối loạn sinh  
sản và hô hấp  ở  lợn (PRRS) do virus PRRS (PRRSV) gây ra, là một bệnh truyền 

nhiễm nguy hiểm  ở lợn, được phát hiện lần đầu tiên  ở  Mỹ  vào năm 1987 và đã lây 
lan  ở  nhiều quốc gia trên thế  giới, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi 
lợn. PRRSV là loai virus RNA không ôn đinh, thay đôi nhanh chóng ca vê đ
̣
̉
̣
̉
̉ ̀ ặc tính di  
truyêǹ  và kháng nguyên, có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong số các virus RNA. Điều  
này, gây ra nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng PRRS. Hiện 
nay, trên thế  giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng PRRS. Các vaccine  
được sản xuất từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ dưới hai dạng chủ 
yếu là vaccine sống – nhược độc và vaccine vô hoạt. Vaccine vô hoạt thường an toàn, 
có khả năng phòng ngừa các triệu chứng lâm sàng nhưng hiệu quả bảo hộ không cao.  
Vaccine nhược độc tạo ra miễn dịch bảo hộ  tốt với các chủng tương đồng nhưng  
mức bảo hộ có thể giảm dần do giảm mức tương đồng với các chủng mới, có nguy  
cơ  phát triển độc tính trở  lại, bản thân virus vaccine sau nhiều lần truyền nhiễm có 
thể đột biến trở thành cường độc.
Ở Việt nam, phát hiện bệnh PRRS lần đầu tiên vào năm 1996 trên đàn lợn giống 
51 con nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam và dịch bệnh nặng xuất hiện từ năm 2007 
cho đến nay. Công ty  Hanvet đã nghiên cứu và sản xuất thành công vaccine PRRS 


nhược độc chủng Hanvet 1.VN để phòng chống PRRS ở Việt Nam. Tuy nhiên, do sự 
biến đổi di truyền phức tạp c ủa PRRSV, các loại vaccine đang lưu hành trên thực 
địa hiện nay đang mất dần hiệu lưc. Virus gây dịch tai xanh  ở  nước ta hi ện nay  
được xác định là thể  độc lực cao,  thuọc ch
̂ ủng PRRSV Băc My type II, 
́
̃

tương đồng 
với chủng virus gây bệnh thể  độc lực cao  ở  Trung Quốc nên việc phòng bệnh khó 
khăn, dịch cũng nguy hiểm hơn và cần phải có vacxin phù hợp. 
Để   nâng   cao   hiệu   quả   phòng   chống   PRRS,   việc   nghiên   cứu   sản   xuất   các   loại  
vaccine thế hệ mới có sự bảo hộ cao với các biến chủng mới của PRRSV hiện nay  
là rất cần thiết.   Vaccine tiểu đơn vị  được sản xuất trong thực vật phòng PRRS là 
hướng nghiên cứu đã được đánh giá là có nhiều triển vọng và  ưu điểm như   ổn định 
và bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi  
phí sản xuất thấp.  Protein   GP5   và   M   là   những   protein  c ấu  trúc   chính  của   virus  
PRRS được lựa chọn là những ứng viên tiềm năng để sản xuất vaccine tiểu đơn vị 
chống virus PRRS. Nhi ều h ệ th ống bi ểu hi ện GP5 và M của PRRSV đã đượ c thử 
nghiệm.   Biểu   hiện   gen   tạm   th ời   ở   th ực   v ật   b ằng   ph ương   pháp   thẩm   lọc   nhờ 
Agrobacterium  là phươ ng pháp để  sản xuất kháng nguyên có nhiều  ưu điểm đã 
được   chứng   minh,   như:   Hàm  lượ ng   kháng  nguyên  cao,   có  thể   sản   xuất   với   số 
lượ ng lớn, chi phí thấp, thực hiện đơn giản, thời gian nhanh, không bị   ảnh hưởng  
bởi vị  trí gắn gen đích trong tế  bào thực vật và có thể  tiến hành biểu hiện trong  
các mô đã biệt hóa hoàn toàn như  mô lá.  Với sự hiểu rõ về cấu trúc phân tử hệ gen  
và tính kháng nguyên của virus  PRRS gây bệnh lợn tai xanh   và các thành tựu đạt 
được về  biểu hiện, sản xuất vaccine tiểu đơn vị  trong thực vật phòng chống bệnh  
virus là căn cứ để chúng tôi thực hiện đề tài luận án này.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi khuẩn
Chủng Escherichia coli DH5α; A. tumefaciens C58C1; chủng A.  tumefaciens C58C1 
mang vector pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY. 
2.1.2. Các vector và vật liệu thực vật, động vật 
Vector nhân dòng pRTRA chứa đoạn promoter 35S và đoạn 100xELP ( pRTRA 
35S­H5­Histag­Cmyc­100xELP) (Scheller và đồng tác giả, 2006; Hoang, 2012). Vector  

pCB301­Kan (Xiang  et al.,  1999); Plasmid pGEM­PRRS (VN07196) mang gen  m và  
gp5  phân lập từ  virus PRRS chủng Việt Nam; vector pBSK mang  đoạn gen  gp5opt 
(gp5  optimize)  đã được tối  ưu mã di truyền. Cây thuốc lá  Nicotiana benthamiana; 
Chuột bạch chủng BALB/C;   Lợn con 20 ngày tuổi;   tế  bào MARC ­145 và chủng  
virus PRRS 07196. 
2.1.3. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu
Cặp mồi nhân gen  gp5opt  là  GP5­optimize­BamHI F  và  GP5­optimize­BamHI R; 
cặp mồi nhân gen gp5ecto­m là GP5ecto­ NcoI­F và GP5ecto­ pspOMI­R, M­pspOMI­F 
và M­BamHI­R; cặp mồi nhân gen  m  là M­BamHI­F và M­BamHI­R; cặp mồi giải 
trình tự vector là 35S­SQF và 35S­Term.


2.1.4. Hóa chất
Kit tách chiết plasmid, kit thôi gel và kit tinh sạch DNA (QIAGEN), thang DNA 1  
Kb, thang protein (Fermentas), cac loai enzyme c
́
̣
ắt giới hạn cua Fermentas.
̉
  Các hoá 
chất   Yeast   extract,   Agarose,   Trypton,   v.v.   các   loại   kháng   sinh   kanamycin,  
rifamycine và các hóa chất thông dụng khác của các hãng Merck, Sigma,v.v.  Kháng 
thể  kháng Cmyc, kháng thể  anti­mouse IgG cộng hợp HRP (Promega ­ USA), kháng 
nguyên scFv (50 ng/µl), kháng thể  rabit anti­pig  IgG  cộng hợp  Peroxidase,  hóa chất 
hiện màu TMB, DAB, kit hiện phim (Thermo Scientific), Protein (H5­pII)3 v.v.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nhân dòng gen m, gp5opt và gp5ecto­m và ghép nối vào vector pRTRA
Đoạn gen m và gp5ecto­m được nhân dòng bằng PCR sử  dụng khuôn là plasmid 
pGEM­PRRS (VN07196) và đoạn gen  gp5opt được nhân dòng từ  khuôn là plasmid 
pBSK mang gen gp5opt với các mồi đặc hiệu tương ứng. Thành phần phản ứng PCR  

bao gồm 0,3 μM primer, 0,2 μM dNTPs, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 5 μl  
đệm 10X Pwo SuperYield PC, 20 ng DNA khuôn trong tổng số  50 µl hỗn hợp. Chu 
trình nhiêt nh
̣
ư  sau: 940C/ 3 phút; 32 chu kỳ với 940C/ 30 giây, 550C/ 50 giây, 720C/ 1 
phút; tiếp đó là 720C/ 10 phút và sản phẩm được giữ   ở  40C. Sản phẩm PCR được 
điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được tinh sạch và xử lý với enzyme cắt giới hạn  
đã được thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35S­Histag­Cmyc­100xELP và biến 
nạp vào E. coli  theo phương pháp sốc nhiệt của Sambrook và đtg (2012). 
Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung 
kháng sinh 50 mg/l  kanamycin. Vector tái tổ  hợp được tách chiết từ  các khuẩn lạc  
dương tính (Colony­PCR) được giải trình tự và phân tích kiểm tra tính chính xác bằng 
phần mềm BioEdit 7.0 và Lasergen 7 (DNAstarinc, Madison, WI, USA).
2.2.2. Thiết kế cấu trúc vector pCB301 mang gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m 
Vector nhân dòng pRTRA tái tổ  hợp mang gen m, gp5opt và gp5ecto­m và vector 
pCB301   cùng   được   phân   cắt   bằng   enzyme  HindIII.   Các   sản   phẩm   cắt   từ   vector 
pRTRA  bao gồm  35S­m­Histag­Cmyc­100xELP;  35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP; 
35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP và được ghép nối vào vector pCB301 sử dụng  
T4 DNA ligase và được biến nạp vào tế  bào  E. coli  DH5α  khả  biến bằng phương 
pháp sốc nhiệt (Sambrook et al., 2012). Việc chọn các dòng khuẩn lạc mang vector tái 
tổ  hợp được thực hiện trên môi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin và bằng 
phản ứng Colony­PCR. Các vector tái tổ hợp  pCB301 mang gen  m/ gp5opt/gp5ecto­m, 
được tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính và kiểm tra bằng phản ứng cắt với 
enzyme giới hạn HindIII và NcoI. Các vector chuyển gen sau đó được biến nạp vào 
chủng A. tumefaciens C58C1 bằng phương pháp xung điện. 
Tách chiết và tinh sạch plasmid: Plasmid được tách chiết theo phương pháp của 
Sambrook và cộng sự  (2012).  Sử  dụng bộ  Kit do hãng Fermentas cung cấp để  tinh 
sạch plasmid. Phương pháp xử lý DNA bằng enzyme cắt giới hạn:  Thành phần phản 
ứng cắt được thực hiện theo sự hướng dẫn của  hãng sản xuất bộ Kit sử dụng enzyme.
2.2.3. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá 

2.2.3.1. Chuẩn bị dịch khuẩn
Chủng  A.  tumefaciens  mang vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP hoặc 
pCB301   35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP   hoặc   pCB301   35S­gp5ecto­m­Histag­
Cmyc­100xELP và chủng A.  tumefaciens C58C1 mang vector pIBT­35S­2bCMV hoặc 
vector  pIBT­35S­HC­Pro PVY  được nuôi trong môi trường YEB có bổ  sung kháng 
sinh, nuôi lắc 200 v/ph, 12­18h  ở 280C cho đến khi mật độ  vi khuẩn OD600 đạt 0,5 ­ 
1,0.  Vi khuẩn được thu nhận sau khi ly tâm dịch nuôi  ở  tốc độ  5.000 v/ph trong 15  
phút. Cặn khuẩn của 2 chủng được hòa tan trong đệm MES tới OD600  = 0,5 để  dùng 
cho biến nạp. Dịch khuẩn có thể  dùng riêng rẽ  hay trộn với nhau theo tỷ lệ 1:1, tùy  
theo mục đích của thí nghiệm. 
2.2.3.2. Phương pháp biến nạp gen đích vào lá cây thuốc lá 
Quá trình biến nạp được tiến hành với cây thuốc lá trồng từ 3 ­ 8 tuần. Cây được 
úp ngược và nhấn chìm toàn bộ phần lá vào bình chứa dịch khuẩn đã được chuẩn bị ở 
trên, tiếp theo chuyển hệ  thống này vào bình hút chân không. Áp suất bình hút chân  
không được chỉnh tới tới 27 inches Hg, hút trong 1,5 phút, sau đó giảm áp suất bình về 
áp suất không khí và mở nắp. Các cây thuốc lá sau khi biến nạp được tiếp tục nuôi và 
chăm sóc trong buồng sinh trưởng.   
2.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ 
biểu hiện protein tái tổ hợp trong lá cây thuốc lá
2.2.4.1. Đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ biểu hiện gen 
Để đánh giá ảnh hưởng của vector hỗ trợ đến mức độ  biểu hiện của các gen m, 
gp5opt và gp5ecto­m trong lá thuốc lá, dịch A. tumefaciens mang vector pCB301 chứa 
gen m/ gp5opt/ gp5ecto­m được lây nhiễm vào lá hoặc dịch vi khuẩn này kết hợp với 
dịch  A. tumefaciens  mang  vector hỗ  trợ  pIBT­35S­2bCMV/  pIBT­35S­HC­Pro PVY, 
với lệ dịch (1:1) (xâm nhiễm kép). Mẫu lá được thu sau 3, 4, 5, 6 ngày sau biến nạp,  
tách chiết protein tổng số  để  đánh giá mức độ  biểu hiện của gen chuyển. Mức độ 
biểu hiện gen chuyển được đánh giá bằng phương pháp lai Western blot sử  dụng  
kháng thể kháng Cmyc.

2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone
Thí nghiệm được bố trí với dịch A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu 
và A. tumefaciens chứa vector pIBT­35S­HC­Pro PVY, không được bổ sung AS và bổ 
sung AS với nồng độ 450 µM và 600 µM. 
2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn dùng cho biến nạp
Thí nghiệm đánh giá mật độ khuẩn được tiến hành với với dịch khuẩn có giá trị OD600 
từ    0,2; 0,5; 1,0 (gồm chủng   A. tumefaciens  mang vector chuyển gen mục tiêu và 
chủng A. tumefaciens mang vector hỗ trợ pIBT­35S­HC­Pro PVY, lượng dịch 2 lít với  
tỷ lệ 1:1) và bổ sung AS ở nồng độ 450 µM). 
2.2.4.4. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi của lá được xâm nhiễm
Thí nghiệm: Lá non gồm các lá thứ 1, 2, 3  từ ngọn xuống; lá bánh tẻ gồm những  
lá tại vị trí chính giữa của thân cây; lá già gồm những lá 1, 2, 3 từ gốc lên. 


2.2.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của tuổi cây
Cây thuốc lá 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi ; các lá non và lá bánh tẻ được cho xâm 
nhiễm với dịch khuẩn (gồm chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen mục tiêu 
và chủng A. tumefaciens mang vector pIBT­35S­HC­Pro PVY, OD600 = 0,5) với nồng 
độ AS 450 µM. 
2.2.5. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số  
Protein tổng số  từ  mẫu lá được tách chiết bằng dịch chiết PBS  và bảo quản  ở 
o
­20 C. Hàm lượng protein tổng số  được đo  ở  bước sóng 595 nm theo phương pháp 
của Bradford (1976) với đường chuẩn được xây dựng dựa vào protein BSA chuẩn đã 
biết trước nồng độ.
2.2.6. Điện di SDS­PAGE và lai Western blot
Protein hòa tan tổng số  được phân tách trên gel polyacrylamide (10%) theo phương  
pháp của Laemmli (1970). 
Sau khi điện di protein tổng s ố  trên gel SDS­PAGE, sau đó đượ c chuyển lên  
màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng  ở  25V, 1.3A trong 20 phút. Màng chứa  

kháng nguyên đượ c  phủ  bằng  sữa   tách  bơ   5%  (pha  trong  dung  d ịch  PBS  0,05%  
Tween) trong 5h; màng đượ c  ủ  với kháng thể  kháng Cmyc qua đêm; sau đó, màng 
được  ủ  với kháng thể  2 anti­mouse IgG có gắn HRP (đối với mẫu huyết thanh 
chuột) hoặc anti­pig IgG g ắn peroxidase (đối với các mẫu huyết thanh lợn). Phát 
hiện sự  có mặt của kháng nguyên tái tổ  hợp bằng cách ngâm màng lai trong dung 
dịch hiện màu có chứa cơ chất DAB trong 15 phút (Phan, 2012). 
2.2.7. Tinh sạch protein M, GP5 và GP5ectoM 
2.2.7. 1. Tối ưu nồng độ PEG trong quá trình thu nhận protein đích
Thí nghiệm: PEG 8000 được bổ  sung  ở  dải nồng độ  (2% ­ 10%) vào 2 ml dịch  
chiết lá thực vật chuyển gen. Dịch chiết lá sau đó được ly tâm ở 13.000 v/p, trong 30  
phút,  ở  4oC. Protein dịch được biến tính và kiểm tra mức độ  thu nhận protein đích 
bằng lai Western blot. 
2.2.7.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp mITC 
Protein tái tổ  hợp gắn ELP được tinh sạch bằng phương pháp mITC theo phương 
pháp của Phan, 2012.
2.2.7.2. Phương pháp tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch
Tính hiệu suất thu hồi protein tinh sạch dựa sử dụng protein chuẩn (ScFv­cmyc)  
đã biết trước hàm lượng và đo bằng phương pháp Bradford.

2.2.8. Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên tái tổ hợp trên  
động vật  thí nghiệm
2.2.8.1. Gây miễn dịch trên chuột
Kháng nguyên tái tổ hợp sau khi tinh sạch được sử dụng để gây miễn dịch trên chuột 
bạch 6 tuần tuổi với hàm lượng 5 µg/con chuột. Kháng nguyên được trộn đều, đồng nhất 
với chất bổ  trợ  với tỷ  lệ  1:1 . Chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm 1: Tiêm vaccine 
PRRS nhược độc (đối chứng dương); nhóm 2: Tiêm PBS (đối chứng âm), nhóm 3: 
Tiêm kháng nguyên M­ELP; nhóm 4: Tiêm kháng nguyên GP5­ELP; nhóm 5: Tiêm 
kháng nguyên GP5ectoM­ELP. Nhóm 1 được tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng  

Hanvet 1.VN một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3, 4, 5 được tiêm nhắc lại 3 lần. Mẫu  
máu được lấy để chiết huyết thanh tại ba thời điểm: Ngày 0 (Trước khi tiêm), 21 và  
35.  Phân tích huyết thanh chuột sau 2 lần tiêm và sau 3 lần tiêm bằng ELISA và 
Western blot. 
2.2.8.2. Gây miễn dịch trên lợn
Lợn con 3 tuần tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể  kháng PRRSV được chia  
thành bốn nhóm, mỗi nhóm 3 con lợn. Nhóm 1: Tiêm vaccine PRRS nhược độc chủng  
Hanvet 1.VN; nhóm 2: Tiêm dịch chiết lá thuốc lá không chuyển gen (WT); nhóm 3: 
Tiêm dịch chiết thô chứa protein GP5­ELP (150 µg/ml); nhóm 4: Tiêm dịch chiết thô 
chứa protein GP5ectoM­ELP (150 µg/ml).  Nhóm 1 được tiêm vaccine  PRRS nhược 
độc một lần duy nhất. Các nhóm 2, 3 và 4 được tiêm nhắc lại 3 lần: ngày 0, 14 và 28.
2.2.8.3. Xác định kháng thể kháng GP5­ELP và GP5ectoM­ELP trong huyết thanh lợn
Mẫu máu của lợn được lấy để  chiết huyết thanh tại bốn thời điểm: Ngày 0, 14, 
28, 35 và 49. Các huyết thanh chiết từ các mẫu máu của lợn thí nghiệm được sử dụng  
với vai trò là kháng thể  1 cho việc xác định kháng thể  IgG đặc hiệu bằng ELISA, 
Western blot và phản  ứng IPMA. Tất cả  các huyết thanh lợn đã được pha loãng 20  
lần. Khả  năng sản sinh kháng thể  IgG đặc hiệu của từng loại kháng nguyên tương  
ứng được tính toán sau lần tiêm thứ 2 và thứ 3.
Phương   pháp   ELISA:  Để   kiểm   tra   các   kháng   thể   có   mặt   trong   huyết   thanh  
chuột/lợn, sử dụng các phiến ELISA giám sát dịch tễ  huyết thanh học của PRRS đã  
được gắn sẵn các kháng nguyên của PRRSV tự  nhiên. Tiếp theo đĩa được phủ  với  
huyết thanh (đã được pha loãng 100 lần), trong 2 giờ; rửa đĩa  5 lần với PBS 1X; phủ 
đĩa với kháng thể anti­mouse IgG có gắn HRP (kháng thể 2) với độ pha loãng 500 lần,  
trong 2 giờ; rửa lại bằng dung dịch PBS  1X 5 lần. Đĩa được hiện màu trong dung dịch 
hiện màu có chứa cơ  chất TMB, 15 phút, sản phẩm phản  ứng cho màu xanh, sau đó 
cố định màu bằng HCl 1N, màu của phản ứng được đo ở bước sóng 450 nm.
Phương pháp Western blot: Phản ứng lai Western được thực hiện như mục 2.2.6.2 
với thay đổi kháng thể thứ  nhất được dùng trong trường hợp này là kháng thể  trong  
huyết thanh của chuột/lợn. 
Lai miễn dịch chéo: Phản  ứng Western blot được thực hiện với kháng nguyên tái 

tổ hợp; kháng thể sơ cấp là kháng huyết thanh của nhóm chuột/lợn được tiêm vaccine  
PRRS nhược độc chủng Hanvet 1.VN; kháng thể thứ cấp là anti­mouse IgG gắn HRP  
(Đối với huyết thanh chuột)/ anti­pig IgG gắn peroxidase (Đối với huyết thanh lợn).
  Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế  bào một lớp (IPMA):  
Phương pháp thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400­21:2014 về Bệnh động  
vật.
Xử  lý và phân tích thống kê kết quả  thực nghiệm : Phân tích thống kê được thực 
hiện trên chương trình Ecxel sử  dụng phương pháp Student’ t­test p ≤ 0,05 là có ý 
nghĩa thống kê.
2.3. Địa điểm nghiên cứu:  Phòng Công nghệ  Tế  bào thực vật, Phòng thí nghiệm  
trọng điểm Công nghệ gen, Phòng thử nghiệm sinh học ­ Viện Công nghệ sinh học và  
Trung tâm chẩn đoán thú y TƯ. 
Chương 3


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thiết kế  vector chuyển gen thực vật mang gen   m,  gp5, gp5ecto­m  và tạo 
chủng Agrobacterium mang vector 
3.1.1. Vector pCB301 mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp Elastin like 
­polypeptide (M­ELP)
3.1.1.1. Tạo vector pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP
Gen m (528 bp) được khuếch bằng PCR và ghép nối thành công vào vector pRTRA 
tạo thành vector tái tổ hợp pRTRA 35S­ m­Histag­Cmyc­100xELP; sau đó vector được 
biến nạp tế bào E. coli. Kết quả đã được kiểm tra bằng kỹ thuật colony­PCR và bằng 
cắt   enzyme   giới   hạn   (Hình   3.1).  Vector   pRTRA   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP   và 
vector chuyển gen pCB301 được xử  lý bằng cùng  HindIII; sản phẩm thu được là: 
Đoạn DNA gồm cấu trúc 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP có kích thước khoảng 3,0 kb 
và khung vector pCB301 mở vòng có kích thước khoảng 5,5 kb.

Hình 3.1. Tao vector tách dòng pRTRA 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP. (A): Sản phẩm 
PCR nhân gen  m; (B): Sản phẩm colony­PCR chọn dòng vi khuẩn; (C): Sản phẩm 
cắt pRTRA tái tổ  hợp bằng BamHI.3.1.1.2. Thiết kế  vector pCB301 35S­ m­Histag­
Cmyc­100xELP 
Khung vector pCB301 được ghép nối với cấu trúc cassette 35S­ m­Histag­Cmyc­
100xELP   tạo   vector   chuyển   gen   pCB301   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP.   Kết   quả 
kiểm tra bằng kỹ  thuật colony­PCR và bằng cắt enzyme giới hạn (3.2) cho thấy đã  
thiết kế  thành công vector pCB301 mang cassette 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP đảo 
chiều   với   cassete   gen   chọn   lọc   (Nos   pro­ nptIII­Nos   ter).  Vector   chuyển   gen   có 
cassette đảo chiều này được dùng để  biến nạp vào  A. tumefacines phục vụ  cho thí 
nghiệm biểu hiện tạm thời.

Hình 3.2. Kết quả thiết kế vector pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP . (A): Vector 
chuyển gen pCB301 tái tổ hợp được cắt bằng HindIII; (B): Vector pCB301 tái tổ hợp 
cắt   bằng  NcoI;   (C):   Sơ   đồ   vector  pCB301   mang  cassette  35S­m­Histag­Cmyc­
100xELP đảo chiều với cassete Nos pro­nptIII­Nos ter. 


Vector   chuyển   gen   pCB301   35S­m­Histag­Cmyc­100xELP   được   biến   nạp   vào 
chủng A. tumefaciens C58C1. Kết quả đã tạo thành công chủng A. tumefaciens C58C1 
mang vector chuyển gen pCB301 35S­m­Histag­Cmyc­100xELP. 
3.1.2. Vector chuyển gen mã hoá kháng nguyên GP5­ELP
3.1.2.1. Tạo vector pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP
Gen gp5opt (510 bp) được khuếch đại bằng PCR và ghép nối vào vector  pRTRA; 
sau đó vector được biến nạp tế bào E. coli. 

Hình 3.3. Thiết kế  vector tách dòng pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP. (A): 
PCR nhân gen gp5opt; (B): Sản phẩm colony­PCR chọn dòng vi khuẩn mang pRTRA  
tái tổ hợp; (C): Sản phẩm cắt pRTRA tái tổ hợp bằng BamHI. 
Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật colony­PCR và bằng cắt enzyme giới hạn cho  

thấy đã tạo thành công pRTRA 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP (Hình 3.3).
3.1.2.2. Thiết kế vector pCB301 35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP
Kết quả  đã thiết kế  thành công  vector  pCB301có  cassette gen 35S­gp5opt­Histag­
Cmyc­100xELP đảo chiều so với cassette gen NOS pro­nptIII­NOS ter (Hình 3.4).

Hình   3.4.  Kết   quả   thiết   kế   vector   chuyển   gen   pCB301   35S­gp5opt­Histag­Cmyc­
100xELP.  (A): Vector chuyển gen pCB301 tái tổ  hợp được cắt bằng  HindIII;  (B): 
Vector pCB301 tái tổ  hợp cắt bằng  NcoI; (C): Sơ  đồ  vector  pCB301 mang  cassette 
35S­gp5opt­Histag­Cmyc­100xELP đảo chiều. 
Đã tạo được chủng  A. tumefaciens  C58C1 mang  vector pCB301  35S­gp5opt­
Histag­Cmyc­100xELP. Kết quả được kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR.
3.1.3. Vector chuyển gen mã hoá hỗn hợp kháng nguyên GP5ectoM­ELP
3.1.3.1. Tạo vector pRTRA 35S­ gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP
Đoạn gen gp5ecto (192 bp) mã hóa cho một đoạn protein GP5 vùng ngoại bào 
(GP5 ectodomain) và gen  m  (528 bp)  mã hóa protein M đượ c khuếch đại đơn lẻ 
bằng phản  ứng PCR v ới c ặp m ồi đặc hiệu tươ ng  ứng. Sản phẩm PCR nhân gen  


gp5ecto đượ c cắt bằng  NcoI và  pspOMI; sản phẩm PCR nhân gen   m  đượ c cắt 
bằng  pspOMI   và  BamHI   và   đồng   thời   cắt   vector   pRTRA   35S­Histag­Cmyc­
100xELP bằng NcoI và BamHI; sau đó, ghép nối 3 sản phẩm cắt này với nhau đã  
tạo  được   vector  tái  tổ   hợp   pRTRA 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP (Hình 
3.5). 

Hình 3.5. Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP.
3.1.3.2. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S­gp5ecto­m ­Histag­Cmyc­100xELP
Kết   quả   cắt   vector   pRTRA­35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP   và   vector 
pCB301  bằng  HindIII,   sau   đó   ghép   nối  cassette  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­
100xELP  với  khung vector pCB301 mở   vòng đã  tạo  được   vector     pCB301 mang 
cassette 35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP đảo chiều so với cassett e gen kháng 

kháng sinh (NOS pro­nptIII­NOS ter) (Hình 3.6). Đã tạo được chủng A. tumefaciens 
C58C1 mang  vector pCB301  35S­gp5ecto­m­Histag­Cmyc­100xELP. Kết quả  được 
kiểm tra bằng kỹ thuật Colony – PCR.

Hình 3.6. Kết quả phân tích kiểm tra vector pCB301 mang gen gp5ecto­m mã hóa  
kháng nguyên GP5ecto­M dung hợp ELP.
3.2. Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M, GP5,  
GP5ectoM dung hợp ELP trong cây thuốc lá 
3.2.1. Anh h
̉
ưởng của vector hỗ trợ đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã hoá  
các kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP 
Kết quả cho thấy, vector hỗ trợ pIBT­35S­HC­Pro PVY mang gen mã hóa protein 
Hc­Pro   PVY   hỗ   trợ   tăng   cường   biểu   hiện   kháng   nguyên   M­ELP,   GP5­ELP   và 
GP5ecto­M tốt hơn so vector hỗ  trợ pIBT­35S­2bCMV mang gen mã hóa protein 2b 
CMV (Hình 3.7). Vì vậy, Hc­Pro PVY được lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.


Hình 3.7. Ảnh hưởng của vector hỗ trợ pIBT­35S­2bCMV và pIBT­35S­HC­Pro PVY 
đến mức độ biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kế quả lai Western sử dụng  
kháng thể kháng Cmyc.
3.2.2. Anh h
̉
ưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các  
kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP
Thí nghiệm với 2 nồng độ  AS là 450 µM và 600 µM; kết quả  cho thấy sử dụng  
nồng độ AS 450 µM là phù hợp nhất cho biểu hiện tạm thời của các gen mã hoá các 
protein tái tổ hợp ở lá thuốc lá (Hình 3.8).

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến sự biểu hiện của các gen mã hóa các  

protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot sử dụng kháng thể kháng  
Cmyc.
3.2.3. Anh h
̉
ưởng của mật độ  vi khuẩn đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã  
hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP

Hình 3.9. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn (OD600) đến sự biểu hiện tạm thời của các  
gen mã hoá các kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được xác định bằng  
lai Western.


Thí nghiệm biến nạp được tiến hành với dịch khuẩn có các giá trị OD600 là 0,2; 0,5 
và 1,0. Kết quả thu được cho thấy mật độ vi khuẩn với giá trị OD600 = 0,5 là phù hợp 
nhất cho biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP  
và GP5ectoM­ELPở lá thuốc lá (Hình 3.9).
3.2.4. Anh h
̉
ưởng của tuổi sinh lý của lá đến sự  biểu hiện tạm thời các gen mã  
hoá các protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP
Kết quả thu được cho thấy tuổi sinh lý của lá ảnh hưởng rõ rệt đến hiểu quả biểu hiện  
gen tạm thời. Lá non và lá bánh tẻ là thích hợp nhất cho biểu hiện của các gen mã hóa các 
kháng nguyên M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP tái tổ hợp. 

Hình 3.10. Ảnh hưởng của tuổi sinh lý của lá đến biểu hiện tạm thời các gen mã  
hoá cho các protein tái tổ hợp được xác định bằng lai Western blot.
3.2.5. Anh h
̉
ưởng của tuổi cây đến  sự  biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các  
protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP

Kết quả thu được cho thấy, cây thuốc lá ở 4 ­ 6 tuần tuổi là thích hợp để sử dụng  
cho biểu hiện tạm thời các gen mã hóa các kháng nguyên nghiên cứu.

Hình 3.11. Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự biểu hiện tạm thời  các gen mã hóa các 
protein tái tổ hợp đượ c xác định bằng lai Western blot.
3.2.6. So sánh mức độ  biểu hiện các gen mã hoá các protein tái tổ  hợp (M­ELP,  
GP5­ELP, GP5ectoM­ELP) trong điều kiện đã được tối ưu


Hình 3.12. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tạm thời các gen mã hoá các kháng  
nguyên tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP bằng lai miễn dịch dựa vào  
protein chuẩn đã được định lượng H5­pII.
Kết quả  phân tích cho thấy mức độ  biểu hiện của các protein tái tổ  hợp M­ELP,  
GP5­ELP và GP5ectoM­ELP, tương  ứng là 0,75%; 0,48% và 0,95 % protein hòa tan 
tổng số, tương ứng là 52,4 mg/kg; 35 mg/kg và 66,8 mg/kg lá tươi (Hình 3.12).
3.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp M­ELP, GP5­ELP và GP5ectoM­ELP
3.3.1. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch  
Nồng độ  6% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch  
kháng nguyên M­ELP là tốt nhất (Hình 3.13). 

Hình 3.13. Kết quả tối ưu nồng độ PEG 8000 cho tinh sạch kháng nguyên M­ELP.
Kết quả  cho thấy, nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá  
trình tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP là tốt nhất (Hình 3.14). 

Hình 3.14. Kết  
quả tối ưu nồng  
độ PEG 8000 cho 
tinh sạch kháng nguyên GP5­ELP.
Nồng độ  8% PEG 8000 bổ  sung vào dịch chiết thực vật trong quá trình tinh sạch 
kháng nguyên GP5ectoM­ELP là tốt nhất (Hình 3.15). 

Hình 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ PEG8000 cho tinh sạch kháng nguyên GP5ectoM­
ELP.
3.3.2.   Tinh   sạch   protein   tái  tổ   hợp   M­ELP,   GP5­ELP   và   GP5ectoM­ELP  bằng  
phương pháp mITC
3.3.2.1. Tinh sạch protein M­ELP


Hình 3.16. Đánh giá sự  tinh sạch của protein M­ELP bằng SDS­PAGE và lai miễn  
dịch. A, B: 1: Dịch chiết thô trước xử  lý; 2: Dịch chảy qua màng; 3: Protein M­ELP  
tách rửa khỏi màng; (C): Protein M­ELP thu nhận được sau khi tinh sạch. 
Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein M­ELP tái tổ hợp (66 
kDa) bằng phương pháp mITC có độ tinh sạch cao (Hình 3.16). 
Định lượng protein thu nhận được bằng phương pháp đo Bradford, lai miễn dịch  
và phần mềm Image J, cho thấy đã tinh sạch và thu nhận đúng protein M­ELP (hình 
3.17) với hiệu suất thu hồi là 86,5%, mức độ tinh sạch là 82,1%.

Hình 3.17. Định lượng protein tái tổ hợp M­ELP bằng lai miễn dịch. ScFV-Cmyc
(đối chứng dương) được đưa vào giếng với các nồng độ 50, 100, 150, 200
ng/giếng.
3.4.2.2. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5­ELP 
Kết quả thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5­ELP tái tổ hợp bằng 
phương pháp mITC có độ  tinh sạch cao (Hình 3.18). Hiệu suất thu hồi protein GP5­
ELP là 98%, mức độ tinh sạch là 81,1%.

Hình 3.18. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5­ELP bằng lai Western blot và điện  
di SDS­PAGE.

1

2

3

4

5

6


Hình  3.19.  Định lượng protein tái tổ hợp GP5­ELP bằng lai Western blot và hàm  
lượng ScFV­Cmyc.
3.4.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp GP5ectoM­ELP 
Kết quả  thu được cho thấy, đã tinh sạch thành công protein GP5ectoM­ELP tái tổ 
hợp bằng phương pháp mITC có độ  tinh sạch cao (Hình 3.20).  Hiệu suất thu hồi 
protein GP5­ELP là 95%, mức độ tinh sạch là 98%.

Hình 3.20. Đánh giá sự tinh sạch của protein GP5ectoM­ELP bằng lai Western blot  và 
điện di SDS­PAGE.

Hình  3.21.  Định lượng protein tái tổ hợp GP5ectoM­ELP bằng lai Western blot và 
ScFV.
3.5. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật 
thí nghiệm       
3.5.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột
3.5.1.1. Khả năng kích thích tạo kháng thể IgG đặc hiệu của kháng M­ELP


Hình 3.22.  Xác định  kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh chuột  

được tiêm M­ELP bằng ELISA; Giá trị ELISA trung bình của huyết thanh chuột có độ 
lệch chuẩn được thể  hiện ở từng chấm đen. Một chấm đen là giá trị  ELISA của một  
con chuột. Thanh ngang là giá trị  trung bình của nhóm chuột (3 con chuột/nhóm) (*:  
P≤0.05).
Kết quả  cho thấy,  kháng nguyên M­ELP tái tổ  hợp được tạo ra có khả  năng kích 
thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột 
sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.22) và sau 3 lần tiêm phát hiện bằng lai  
Western blot (Hình 3.23).

Hình 3.23. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng M­ELP trong  
huyết thanh chuột. A: Lai miễn dịch chéo, kháng nguyên là M­ELP, kháng thể sơ cấp là 
huyết thanh thu từ nhóm được tiêm vaccine PRRS nhược độc, kháng thể thứ cấp là anti­
mouse IgG gắn HRP, B và C: Sau 2, 3 lần tiêm M­ELP và PBS.
3.5.1.2. Khả năng tạo kháng thể đặc hiệu IgG của kháng nguyên GP5­ELP
Kết quả  cho thấy, kháng nguyên GP5­ELP tái tổ  hợp được tạo ra có khả  năng kích 
thích phản ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trên chuột 
sau 2 lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.24) và lai Western blot (Hình 3.25).

Hình 3.24. Xác định kháng th ể IgG đặ c hiệ u kháng PRRSV trong huy ết thanh  
chuộ t đượ c tiêm GP5­ELP b ằng k ỹ thu ật ELISA.


Hình 3.25. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP  
trong huyết thanh chuột.
3.5.1.3. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng nguyên GP5ectoM­ELP
Kết quả cho thấy, kháng nguyên GP5ectoM­ELP tái tổ hợp được tạo ra có khả năng  
kích thích phản  ứng miễn dịch, sản sinh kháng thể  IgG đặc hiệu trên chuột sau 2  
lần tiêm phát hiện bằng ELISA (Hình 3.25) và lai Western blot (Hình 3.27).

Hình 3.26. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huy ết thanh  

chuột đượ c tiêm GP5ectoM­ELP bằng k ỹ thu ật ELISA.
Từ kết quả phát hiện kháng thể kháng PRRSV bằng ELISA và Western blot trong 
huyết thanh chuột, cho thấy 3 loại kháng nguyên có khả  năng kích thích hình thành  
kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột.

Hình 3.27. Kết quả Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP  
trong huyết thanh chuột.
3.5.2. Gây miễn dịch trên lợn
Dựa trên các kết quả đạt được trên chuột, hai loại kháng nguyên là GP5­ELP và 
GP5ectoM­ELP được lựa chọn để  tiếp tục đánh giá tính sinh miễn dịch trên lợn.  
Kháng nguyên GP5­ELP và GP5ectoM­ELP được định lượng   bằng lai Western blot 
dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5­pII)3 bằng kháng thể  kháng   Cmyc 


(Hình 3.28). Từ kết quả định lượng này, hai loại kháng nguyên được chuẩn về nồng  
độ 150 µg/ml mỗi loại và gây miễn dịch cho lợn thí nghiệm.

Hình 3.28. Kết quả định lượng các protein GP5­ELP, GP5ectoM­ELP bằng lai  
Western blot dựa vào protein chuẩn đã được định lượng (H5­pII)3 bằng kháng thể  
kháng Cmyc.
3.5.2.1. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP 

Hình 3.29. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh của lợn  
được tiêm GP5­ELP bằng phản ứng ELISA.
Kháng thể  IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn được phân tích  ở 
ngày thứ  28 (sau 2 lần tiêm kháng nguyên) và ngày thứ  35 (sau 3 lần tiêm kháng 
nguyên) được xác định bằng phản  ứng ELISA (Hình 3.32) và lai Western blot (Hình 
3.29). Giá trị  ELISA phân tích huyết thanh của nhóm chuột được tiêm GP5­ELP là 
thấp hơn so với vaccine PRRS nhược độc trên lợn.  Ở  nhóm lợn đối chứng âm WT  
không phát hiện được kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV.

Hình 3.30. Kết quả lai Western blot xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5­ELP  
trong huyết thanh của lợn.
3.5.2.2. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP 


Hình 3.31. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng PRRSV trong huyết thanh lợn  
được tiêm GP5ectoM­ELP bằng ELISA
Phản  ứng ELISA cho kết quả  dương tính với kháng thể  IgG đặc hiệu kháng  
PRRSV  ở  các mẫu huyết thanh của nhóm lợn được tiêm dịch chiết thực vật chứa  
protein GP5ectoM­ELP và vaccine PRRS nhược độc (Hình 3.31). 

Hình 3.32. Xác định kháng thể IgG đặc hiệu kháng GP5ectoM­ELP trong huyết thanh  
lợn bằng lai Western blot.
3.5.2.3. Xác định kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh lợn bằng phương pháp miễn  
dịch một lớp (IPMA)