Tóm tắt Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (524.98 KB, 23 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ KIM DUNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60420107
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hà Nội – Năm 2015
Công trình được hoàn thành tại:
Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) – Bộ Y
Tế
Người hướng dẫn khoa học: TS.
Đỗ Tuấn Đạt
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà
Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Vân Trang
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh
Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại:
Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia
Hà Nội, 14h00 ngày 21 tháng 12 năm 2015
Có thể tìm hiểu luận văn tại:
Trung tâm Thông tin Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
PHẦN MỞ ĐẦU
1. TÍNH CẤP THIẾT, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ
TÀI LUẬN VĂN
Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo nên
gánh nặng lớn đối với sức khỏe của cộng đồng, TCYTTG và hơn 40% quốc gia
trên Thế giới khuyến cáo sử dụng vắcxin phòng vi rút cúm. Do vậy, phát triển
các vắcxin cúm cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay.
Là một cơ sở nghiên cứu và sản xuất vắcxin cho người ở Việt Nam, Công ty
TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 đã tiến hành xây dựng các quy trình công
nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H5N1, cúm A/H1N1 và tiến tới là vắcxin cúm
A/H7N9 trên nuôi cấy tế bào. Một trong những thông số rất quan trọng để đánh
giá chất lượng vắcxin trong phòng thí nghiệm đó là đặc tính của kháng nguyên vi
rút cúm có mặt trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắcxin. Xây dựng các
phương pháp để đánh giá, từ đó đưa ra các tiêu chuẩn về chất lượng kháng
nguyên là một việc làm hết sức cần thiết. Điều này giúp cho việc đánh giá được
chất lượng vắcxin và kiểm tra độ ổn định của quy trình sản xuất. Do vậy, chúng
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu xây dựng phương pháp đánh giá
chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm” .
2. MỤC TIÊU, NHIỆM VỤ CỦA LUẬN VĂN
Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng
kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình
sản xuất vắcxin cúm..
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Trong nhiều thập kỷ qua, bên cạnh virus cúm mùa, thế giới liên tục phải
trải qua những đại dịch cúm với các chủng khác nhau, A/H5N1, A/H7N9,
A/H1N1 đại dịch. Sản xuất virus cúm vừa phải tuân thủ các quy định nghiêm
ngặt về chất lượng vắc xin, vừa phải đối diện với việc thay thế chủng hàng năm
cũng như các chủng mới gây đại dịch. Việc xây dựng quy trình và tiêu chuẩn
1
đánh giá chất lượng vắc xin chung cho các vắc xin cúm và riêng cho một số vắc
xin phòng các chủng cúm gây đại dịch là rất quan trọng, nhằm đảm bảo chất
lượng, tính an toàn và tính kháng nguyên của vắc xin. Những đánh giá này có thể
là cơ sở để áp dụng cho các vắc xin cúm mới khác, nhằm nhanh chóng đưa vắc
xin mới vào thử nghiệm và sử dụng5. KẾT CẤU LUẬN VĂN
Luận văn ngoài phần mở đầu, danh mục các hình, danh mục các bảng,
bảng ký hiệu các chữ viết tắt, kết luận, tài liệu tham khảo, phụ lục còn có 3
chương sau:
Chương 1. Tổng quan
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
2
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1TỔNG QUAN
1.1.
Đặc điểm chung của vi rút cúm
Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài,
genom là ARN đơn, (), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút
cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành
phổ biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên
gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và
thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống
nhau về cấu trúc
1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi
có hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80120 nm. Các hạt
virion của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn
gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một
số protein dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn,
ở typ A và B có 8 đoạn ARN() với tổng khối lượng 5x106, còn ở typ C có 7
đoạn. Trong virion có chứa enzyme ARN polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme
này cần cho quá trình phiên mã vì genom ARN chuỗi (). Protein capsit kết hợp
với ARN tạo nucleocapsit đối xứng xoắn.
1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7
đoạn gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu
nhờ kỹ thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc
gen của vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho
PB1, đoạn gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA,
đoạn 7 cho M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút
3
cúm PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982. Vi rút R8/34
có 13.588 nucleotit.
1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm
Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế
bào chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp
giữa vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H
chồi lên khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARN
polymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN polymeraza
của vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn
đơn, () của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của
mARN có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN
của tế bào chủ. Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử
mARN mới hoàn thiện của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao
chép genom trong nhân.
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên
phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình
sản xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận
khỉ tiên phát (PMKC) hay thận chó Madin Darby (MDCK) thường được dùng để
phân lập vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy
100% trong phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và
MRC5 là 57,1%.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (), vi rút cúm nhân lên trong
nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của
ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản
4
diễn ra tại đây, vARN sợi () không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà
vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp
polymeraza của vi rút. Trong quá trình tái bản vARN được sử dụng làm khuôn để
tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khuôn để tổng
hợp sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản
là vRNP.
1.7. Dịch tễ học bệnh cúm
Dịch cúm xảy ra theo xu hướng khác nhau ở các năm, thường xảy ra vào
mùa đông ở bắc và nam bán cầu, nhưng xuất hiện hàng năm ở khu vực nhiệt đới.
Vi rút cúm có khả năng tấn công cao, nên tỷ lệ mắc bệnh do vi rút cúm trong dân
số là tương đối cao. Tăng tỷ lệ mắc và tử vong do cúm xảy ra ở cực trị của nhóm
tuối và ở người đang mắc sẵn một bệnh khác.
Mô hình dịch tễ phản ánh sự thay đổi đặc điểm kháng nguyên của vi rút
cúm, và sự lây lan của bệnh phụ thuộc vào nhiếu yếu tố, bao gồm khả năng lây
nhiễm và sự mẫn cảm của nhóm dân cư. Đặc biệt ở vi rút cúm A có khả năng
thay đổi định kỳ lớp vỏ kháng nguyên glycoproteins như hemagglutinin và
neuraminidase. Trong số các vi rút cúm nhóm A ảnh hưởng đến sức khỏe ở
người có ba phân typ chính của hemagglutinin (H1, H2, và H3) và ba phân typ
chính của neuraminidase (N1 và N2) đã được công bố. Vi rút cúm B ít có sự thay
đổi về đặc điểm kháng nguyên.
TCYTTG ước tính hàng năm có khoảng 35 triệu người mắc và 250.000 –
500.000 người tử vong vì cúm.
1.8. Sinh bệnh học
Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên. Vi
rút phát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp và phá hủy nhung mao, nơi
được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô
hấp. Kèm theo sự nhân lên của vi rút, interferon được phát hiện trong giai đoạn
cấp tình của bệnh trong một thời gian ngắn là nguyên nhân của sự nguy hiểm do
nhiễm vi rút cúm.
5
1.9. Vắcxin cúm
Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm. Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp căn
bản để kiểm soát cúm ở mức độ cá nhân và cộng đồng. Vắcxin cúm được phát
triển và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và
vi rút bất hoạt. Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích
miễn dịch đối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do
đó thành phần của vắcxin cúm thường xuyên được thay đổi sao cho tương thích
nhất với chủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước. Vai trò kích thích
các đáp ứng miễn dịch khác của vắcxin trong phòng ngừa bệnh vẫn chưa được
hiểu biết một cách đầy đủ. Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, và được TCYTTG
khuyến cáo sử dụng cho phụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già,
người đang mắc bệnh “đặc biệt”, và cán bộ y tế.
Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuất
vắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phôi
(IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP. HCM), trong đó VABIOTECH đã
hoàn thành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1
do VABIOTECH sản xuất là an toàn trên người tình nguyện. Các chỉ số sinh hóa
học ở những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường. Vắcxin A/H5N1
sản xuất trên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất
cả các đối tượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu
Âu. Từ những kinh nghiệm có sẵn trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1
VABIOTECH cũng đã xây dựng được một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin
cúm A/H1N1 có tính ổn định và hiệu suất cao. Người Việt Nam sẽ được sử dụng
vắcxin cúm do Việt Nam sản xuất trong một ngày không xa.
1.10. Một số dạng vắcxin cúm
Hiện nay có nhiều cách tiếp cận công nghệ khác nhau để sản xuất vắcxin
cúm và cũng có nhiều loại vắcxin cúm khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp
và kỹ thuật sử dụng:
Vắcxin toàn tế bào (vi rút toàn phần)
6
Vắcxin hạt vi rút vỡ (split vaccine)
Vắcxin tiểu đơn vị (subunit vaccine)
Vắcxin bất hoạt sản xuất trên tế bào
Vắcxin tái tổ hợp và hấp phụ
Vắcxin sống giảm độc lực
1.11. Các phương pháp kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin cúm
Kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm
Nhận dạng: Xác định các kháng nguyên đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán
miễn dịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu.
Xác định hàm lượng kháng nguyên HA:
Thử nghiệm về các nguyên liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh các
nguyên liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế
bằng phương pháp chạy SDSPAGE nhưng vấn phải giữ nguyên đặc tính kháng
nguyên bằng phương pháp kính hiển vi điện tử.
Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry.
Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm
Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1
lọ cho mỗi loạt vắcxin.
Hàm lượng kháng nguyên HA.
Thử nghiệm an toàn chung
Thử nghiệm chất gây sốt
Thử nghiệm công hiệu.
7
CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Tế bào
Tế bào thận chó thường trực (Madin Darby Canine Kidney): MDCK
(London – Anh)
2.1.2. Mẫu thử nghiệm
Mẫu nước nổi sau gặt vi rút trong quy trình sản xuất vắc xin cúm.
Mẫu bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắc xin cúm.
2.1.3. Môi trường và hóa chất và các trang thiết bị
Các môi trường, hóa chất và trang thiết bị cần thiết
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu: Phương pháp chuẩn độ hiệu
giá vi rút cúm CCID50, chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật
ngưng kết hồng cầu, xá định nồng độ kháng nguyên HA bằng SRID, định lượng
protein tổng số, điện di trên gel SDSPAGE, kính hiển vi điện tử, phân tích xu
hướng tại Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1.
8
CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng
kháng nguyên vắcxin trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
3.1.1. Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm
CCID50
Tách tế bào MDCK từ chai ra phiến với mật độ 4x104 tế bào/ml. Sau 2
ngày nuôi cấy tế bào MDCK trên các phiến 96 giếng đều kín 1 lớp.
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 3 lần nhằm đảm bảo độ chính xác để
tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm:
nhiệt độ, môi trường và thời gian nuôi cấy vi rút. Các phiến trước khi tiến hành
thử nghiệm có mật độ tế bào tương đương nhau.
9
Hình 3.5. So sánh chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm 3 loại môi trường MEM,
DMEM, LH3E tại 32oC sau 3 ngày, 4 ngày và 5 ngày ( Giá trị trung bình của
3 lần thử nghiệm).
Qua các kết quả thu được sau 3 lần tiến hành lặp lại thử nghiệm chúng tôi
đã tìm được các điều kiện tối ưu cho quy trình chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm là:
Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC
Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM
Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày.
3.1.2. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm
Chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng các phương pháp kiểm tra chất lượng
kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cho 9 loạt vắcxin cúm
A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1.
Bảng 3.4. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
A/H5N1
Loạt 0112
Loạt 0212
CCID50
HA
SRID
Protein
(CCID50/ml)
107,5
107,8
(HAU)
1024
512
(µg/ml)
177,4
173,1
(µg/ml)
324,13
416,67
10
Loạt 0312
Loạt 0412
Loạt 0512
Loạt 0113
Loạt 0213
Loạt 0313
Loạt 0413
108,0
108,4
108,6
107,9
108,0
108,2
108,5
512
512
512
512
1024
1024
512
195,1
228,0
169,3
169,0
127,7
165,2
182,17
379,01
388,27
373,04
304,61
245,09
278,96
277,02
Bảng 3.5. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
A/H1N1
Loạt 0113
Loạt 0213
Loạt 0313
Loạt 0413
Loạt 0114
Loạt 0214
Loạt 0314
Loạt 0414
Loạt 0115
Loạt 0215
CCID50
HA
SRID
Protein
(CCID50/ml)
107,5
108,2
107,0
107,8
108,5
108,6
108,4
108,6
108,2
108,8
(HAU)
256
512
512
512
256
512
512
512
512
512
(µg/ml)
132,2
159,1
131,6
135,2
129,5
145,6
142,5
140,8
125,2
138,5
(µg/ml)
498,1
507,1
525,5
558,8
480,6
563,4
556,2
532,5
505,2
512,8
Sau bước tinh chế bán thành phẩm cúm, chúng tôi đã kiểm tra độ tinh
khiết của sản phẩm bằng phương pháp điện di mẫu trước siêu ly tâm và mẫu
sau siêu ly tâm trên gel SDSPAGE. Kết quả chạy SDSPAGE cho thấy sản
phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không còn lẫn
các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm.
Đồng thời, với các phương pháp thông dụng hiện vẫn được áp dụng trong
việc đánh giá chất lượng của kháng nguyên, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng
đã tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh các kháng
nguyên vi rút cúm. Phương pháp này được tiến hành trên các mẫu nuôi cấy vi rút
cúm trên tế bào để quan sát quá trình nhân lên của vi rút cúm Các vi rút cúm
A/H1N1 được tổng hợp đã nẩy chồi ra khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hoàn
toàn bị teo lại, quan sát thấy rất nhiều hạt vi rút hoàn chỉnh giải phóng ra bên
ngoài tế bào. Mẫu bán thành phẩm vắcxin cúm sau khi tinh chế để thấy được
11
tính toàn vẹn của hạt vi rút cúm với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi
rút.
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình
sản xuất vắcxin cúm.
Chúng tôi đã phân tích dữ liệu dựa trên kết quả của 9 loạt vắcxin đại dịch
cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm mùa A/H1N1 để xây dựng tiêu chuẩn đáng
giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm nhằm đảm
bảo chất lượng mà còn đảm bảo tính ổn định của sản phẩm.
3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Hàm lượng
CCID50 /ml
6.00E+08
Phân tích xu hướng hàm lượng CCID 50
5.00E+08
4.00E+08
3.00E+08
2.00E+08
1.00E+08
Loạt
0.00E+00
-1.00E+08
0112
0213
0313
0413
0513
0113
0213
0313
0413
-2.00E+08
-3.00E+08
CCID50
X-2SD
X
X+2SD
12
X-SD
X-3SD
X+SD
X+3SD
Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin
cúm A/H5N1
Hàm lượng
CCID50 /ml
1.00E+09
Phân tích xu hướng hàm lượng CCID 50
8.00E+08
6.00E+08
4.00E+08
2.00E+08
Loạt
0.00E+00
0113
0213
0313
0413
0114
0214
0314
0414
0115
0215
-2.00E+08
-4.00E+08
-6.00E+08
CCID50
X-2SD
X
X+2SD
X-SD
X-3SD
X+SD
X+3SD
Hình 3.10. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 10 loạt BTP vắcxin
cúm A/H1N1
Từ đồ thị trên chúng tôi nhận thấy các kết quả đều nằm trong khoảng (±
2SD) chứng tỏ các loạt BTP đều ổn định vể hiệu giá vi rút. Từ đó chúng tôi phân
tích dữ liệu và xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên.
3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng
cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
13
Hàm lượng HA
(HAU)
Phân tích hàm lượng HA
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-200
Loạt
0112
0212
0312
HA
X-2SD
0412
0512
0113
X
X+2SD
0213
0313
0413
X-SD
X-3SD
X+SD
X+3SD
Hình 3.12. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng
kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9
loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1
Phân tích hàm lượng HA
Hàm lượng HA
(HAU)
900
800
700
600
500
400
300
200
100
Loạt
0
0113
0213
0313
0413
0114
0214
0314
0414
0115
0215
HA
X
X-SD
X+SD
X-2SD
X+2SD
X-3SD
X+3SD
Hình 3.13. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá kháng nguyên HA bằng
kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10
loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1
Qua đồ thị trên, các kết quả hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật
ngưng kết hồng cầu đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều
có kết quả hiệu giá kháng nguyên HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi
đưa ra tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu
trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên.
14
3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID
Phân tích xu hướng hàm lượng SRID
Hàm lượng SRID
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
0112
SRID
X+2SD
0212
0312
0412
0512
X
X-3SD
0113
X-SD
X+3SD
0213
0313
0413
X+SD
Loạt
X-2SD
Hình 3.15. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA bằng
SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm
A/H5N1.
Hàm lượng SRID
Phân tích xu hướng hàm lượng SRID
180.0
170.0
160.0
150.0
140.0
130.0
120.0
110.0
100.0
90.0
80.0
0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215
SRID
X+2SD
X
X-3SD
X-SD
X+3SD
X+SD
Loạt
X-2SD
Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA
(SRID) trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm
A/H1N1.
Qua đồ thị trên, các kết quả đều nằm trong khoảng (± 2SD), chứng tỏ các
loạt BTP đều có kết quả hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID ổn định. Từ
các phân tích trên chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng
SRID trong quy trình sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 100 µg/ml trở lên.
15
3.2.4. Tiêu chuẩn hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng
Protein
Phân tích xu hướng hàm lượng Protein
600
500
400
300
200
100
0
Loạt
0112
Protein
X+2SD
0212
0312
X
X-3SD
0412
0512
0113
X-SD
X+3SD
0213
0313
X+SD
0413
X-2SD
Hình 3.17. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1
Hàm lượng
Protein
Phân tích xu hướng hàm lượng Protein
600
580
560
540
520
500
480
460
440
420
400
Loạt
0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215
Protein
X-2SD
X
X+2SD
X-SD
X-3SD
X+SD
X+3SD
Hình 3.18. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm A/H1N1
Qua đồ thị trên, các kết quả hàm lượng Protein tổng số đều nằm trong
khoảng (± 2SD), chứng tỏ các loạt BTP đều có kết quả hàm lượng Protein tổng
số ổn định. Từ các phân tích trên và dựa vào tiêu chuẩn protein tổng số của vắc
xin sản xuất trên trứng gà có phôi, chúng tôi đưa ra tiêu chuẩn hàm lượng Protein
tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 200 µg/ml đến 600 µg/ml.
3.2.5. Tiêu chuẩn của điện di trên gel SDSPAGE
16
Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm,
không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm.
3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử
Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt
đặc hiệu của vi rút.
17
KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng
kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm:
Tìm ra các điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm
CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là:
+ Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC
+ Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM
+ Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày
Đã áp dụng được các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm
như phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy
hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA bằng kỹ thuật
ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA
bằng SRID, phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số, phương
pháp điện di trên gel SDSPAGE, phương pháp kính hiển vi điện tử cho 9
loạt vắcxin cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1.
2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản
xuất vắcxin cúm nhằm đảm bảo tính ổn định cũng như chất lượng của
sản phẩm.
Hiệu giá vi rút trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml
trở lên.
Hiệu giá kháng nguyên HA bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu trong
quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ 128 HAU/50µl trở lên.
Hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID trong quy trình sản xuất vắcxin
cúm đạt từ 100 µg/ml trở lên.
Hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin cúm đạt từ
200 µg/ml đến 600 µg/ml.
Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm,
không còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút
cúm.
18
Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt
đặc hiệu của vi rút.
19
