Nghiên cứu định lượng amantadin hydrochlorid bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG AMANTADIN HYDROCHLORID
BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN
Nguyễn Văn Thịnh*; Vũ Thị Thanh Hằng*; Nguyễn Phương Dung**
Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu**
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến
(UV-VIS) để định lượng amantadin hydrochlorid (AM) trong môi trường thử độ hòa tan. Đối tượng
và phương pháp: khảo sát, lựa chọn các điều kiện của phản ứng tạo phức bromophenol blue (BB)
với amantadin. Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng với các chỉ tiêu: độ đặc hiệu,
độ chính xác, độ đúng, đường chuẩn và khoảng tuyến tính theo hướng dẫn của ICH. Kết quả:
đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp cho quy trình định lượng như: pH dung dịch đệm,
nồng độ dung dịch BB, thời gian phản ứng và số lần chiết dẫn xuất tạo thành. Phương pháp
định lượng đã được thẩm định với khoảng tuyến tính ở nồng độ 20 - 250 µg/ml. Độ chính xác
trong ngày và khác ngày lần lượt nhỏ hơn 5,12% và 5,31%. Độ đúng của phương pháp trong
khoảng 95,96 - 102,96%. Kết luận: đã xây dựng phương pháp phù hợp để định lượng AM trong
phép thử độ hòa tan.
* Từ khóa: Amantadin hydrochlorid; Bromophenol blue; UV-VIS; Phương pháp thử độ hoà tan.

Study on Spectrophotometric Method for Determination of Amantadine
Hydrochloride
Summary
Objectives: To develop and validate an UV-VIS method for determination of amantadine
hydrochloride (AM) in drug dissolution testing. Materials and methods: Factors of complex reaction
of amantadine with bromophenol blue (BB) were investigated and adapted. Validation of the
method was conducted with criteria of specificity, precision, accuracy, linearity and calibration curve,
according to ICH guidelines. Results: The appropriate procedure for the quantitation was adopted
with regard to such factors as pH of buffer, concentration of BB, reaction time, and number of
extraction. The quantitative method was validated with a linear range from 20 to 250 µg/mL.
Intra- and inter-day precision were less than 5.12% and 5.31%, respectively. The accuracy was

from 95.96% to 102.96%. Conclusion: The developed method is suitable for determination of
AM in dissolution testing.
* Key words: Amantadine hydrochloride; Bromophenol blue; UV-VIS; Drug dissolution testing.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Năm 1966, Cục Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận amantadin
là một thuốc dự phòng cúm và điều trị virut

cúm A ở người lớn. Năm 1969, thuốc được
sử dụng trong điều trị giảm các triệu chứng
của bệnh Parkinson, hội chứng ngoại tháp
do thuốc và chứng ngồi nằm không yên
(akathisia).

* Học viện Quân y
** Đại học Bách khoa Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Thịnh ()
Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/08/2016
Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016

74


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Hiện nay, trên thị trường có một số chế
phẩm chứa AM như amazolon (Sawai);
mantadan (Boehringer, Ing.); mantadin
(DuPont Pharma); mantadix (DuPont
Pharma); symmetrel (DuPont Pharma).

Việc định lượng các thuốc này gặp nhiều
khó khăn vì amantadin không hấp thụ tia
UV, cũng như không có khả năng phát
bức xạ huỳnh quang. Trên thế giới, đã có
một số nghiên cứu về phương pháp định
lượng AM bằng đo quang phổ hấp thụ,
quang phổ huỳnh quang [1], phương
pháp HPLC [2], TLC [3], GC-MS [4]...
Phương pháp định lượng dựa trên các
phản ứng tạo dẫn xuất có khả năng bức xạ
UV hoặc bức xạ huỳnh quang. Các chất
phản ứng tạo dẫn xuất được sử dụng gồm
iod [1], 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol
[2], 2,3-diphenylquinolizinium bromid [5].
Nghiên cứu này, chúng tôi trình bày
kết quả: Nghiên cứu xây dựng và thẩm
định phương pháp định lượng AM bằng
phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
có sử dụng chất tạo dẫn xuất có khả năng
hấp thụ ánh sáng tại 408 nm. Phương pháp
xây dựng được có độ đúng và chính xác
cao, đơn giản, phù hợp cho các phép thử
độ hòa tan trong bào chế viên nén và
nghiên cứu định lượng khác.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

kali dihydrophosphat, natri dihydrophosphat
axít boric, axít chlohydric, natri hydroxyd.
* Thiết bị nghiên cứu:

- Máy đo quang phổ hấp thụ UV-VIS
(Biochrom Ltd, Anh).
- Máy đo pH (Mettler - Toledo group,
Thụy Sỹ).
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Xây dựng quy trình định lượng dựa
vào phản ứng giữa AM và BB:
Vì độ hấp thụ của dẫn xuất tạo thành
của phản ứng giữa AM và BB quyết định
đến độ đúng, độ chính xác của phương
pháp nên cần khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng đến hiệu suất phản ứng gồm: pH
môi trường phản ứng, nồng độ thuốc thử,
thời gian thực hiện phản ứng, cũng như
phương pháp chiết xuất dẫn chất thu
được sau phản ứng. Để tiến hành khảo
sát, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch sau:
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn: pha các
dung dịch chuẩn có nồng độ 250 µg/ml,
200 µg/ml, 150 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml,
20 µg/ml từ dung dịch chuẩn gốc.
- Pha dung dịch đệm: pha các dung dịch
đệm có nồng độ 0,1 M gồm: đệm phosphat
H3 PO 4/KH2 PO 4 có pH 2,5; đệm acetat
CH3COOH/CH3COONa có pH 3,5, 4,5; 5,5;
đệm KH2PO4/Na2HPO4 có pH 7,5, đệm borat
NaOH/H3BO3 có pH 9,5; 10,5.

AM chuẩn (Wako Pure Chemical Industries,
Ltd., Nhật Bản, số lô: AWF0974), thuốc

thử BB (Merck, Đức).

- Pha dung dịch thuốc thử BB: cân
0,15 g BB vào bình định mức 100 ml,
thêm 10 ml dung dịch NaOH 0,05 M. Lắc
trong 5 phút tới tan hoàn toàn. Thêm nước
cất tới vạch định mức, thu được dung dịch
BB có nồng độ 0,15%.

Các hóa chất tinh khiết khác:
dichloromethan, natri acetat, axít phosphoric,

- Khảo sát quy trình định lượng trong:
lấy chính xác 1 ml mẫu thử đã pha loãng

1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị.
* Nguyên liệu, hóa chất:

75


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
về khoảng nồng độ định lượng vào bình
gạn, thêm 5 ml dung dịch BB 0,15% và
4 ml đệm acetat pH 3,5. Lắc trong 3 phút.
Thêm 10 ml CH2Cl2, lắc, gạn lấy phần
dung dịch CH2Cl2, đem đo lại bước sóng
tại 408 nm. Khảo sát lựa chọn các điều
kiện thích hợp về pH dung dịch đệm,
nồng độ dung dịch BB, thời gian lắc phản

ứng, số lần chiết với CH2Cl2.
* Thẩm định quy trình định lượng AM:
Thẩm định phương pháp định lượng
đã xây dựng được theo hướng dẫn của
ICH Q2(R1) theo các chỉ tiêu: độ đặc hiệu,
độ đúng, độ chính xác, đường chuẩn và
khoảng tuyến tính [6].

pH của phản ứng tạo phức ảnh hưởng
rất lớn tới độ hấp thụ của sản phẩm sau
phản ứng. Khoảng pH từ 2,5 - 4,5 cho kết
quả độ hấp thụ cao. Với pH > 4,5 độ hấp
thụ giảm mạnh. Ở pH 3,5, độ hấp thụ cao
nhất.
* Khảo sát nồng độ BB:
Pha các mẫu thuốc thử BB có nồng độ
khác nhau từ 0,05 - 0,2%. Thực hiện phản
ứng với dung dịch AM nồng độ 250 µg/ml
và xử lý mẫu theo quy trình trên.
Bảng 2: Ảnh hưởng của nồng độ dung
dịch BB tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3).
Số thứ tự

Nồng độ BB (%)

Độ hấp thụ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN

1

0,050

0,332 ± 0,015

2

0,075

0,639 ± 0,032

1. Kết quả xây dựng quy trình định
lượng.

3

0,100

0,945 ± 0,028

4

0,125

1,257 ± 0,039

5

0,150

1,299 ± 0,036

6

0,175

1,310 ± 0,045

7

0,200

1,297 ± 0,031

* Khảo sát pH của dung dịch đệm trong
phản ứng giữa AM và BB tới độ hấp thụ:
Pha các dung dịch đệm có pH trong
khoảng 2,5 - 10,5. Thực hiện phản ứng
tạo dẫn xuất với dung dịch AM 250 µg/ml
và dung dịch BB 0,15% theo quy trình
trên. Đo độ hấp thụ của mẫu thu được.
Bảng 1: Ảnh hưởng của pH dung dịch
đệm tới phản ứng tạo dẫn xuất (n = 3).
Số thứ tự

pH

Độ hấp thụ

1

2,5

0,810 ± 0,025

2

3,5

1,279 ± 0,035

3

4,5

0,774 ± 0,021

4

5,5

0,087 ± 0,023

5

7,5

0,037 ± 0,013

6

9,5

0,005 ± 0,002

7

10,5

0,005 ± 0,002

76

Kết quả khảo sát cho thấy khi tăng
nồng độ BB, độ hấp thụ tăng. Từ nồng độ
0,125%, độ hấp thụ tăng không đáng kể,
lượng BB đã đủ dư cho phản ứng tạo dẫn
xuất. Dựa vào kết quả của bảng 2, chúng
tôi lựa chọn nồng độ 0,15% để thực hiện
phản ứng tạo dẫn xuất.
* Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
đến độ hấp thụ:
Thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất của
dung dịch AM 250 và BB 0,15% theo quy
trình xử lý trên. Lắc kỹ trong các khoảng
thời gian khác nhau. Sau đó chiết với
CH2Cl2 và đo quang tại bước sóng 408 nm.

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
Bảng 3: Ảnh hưởng của của thời gian
phản ứng đến độ hấp thụ.

CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ trong 3 phút.
Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2 và đo độ
hấp thụ tại bước sóng 408 nm. Từ quy
trình đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành
thẩm định phương pháp để định lượng AM.

Số thứ tự

Thời gian

Độ hấp thụ

1

2 phút

1,285 ± 0,025

2

3 phút

1,293 ± 0,048

2. Thẩm định phương pháp định lượng.

3

5 phút

1,304 ± 0,022

* Độ đặc hiệu, chọn lọc:

4

10 phút

1,296 ± 0,011

Phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra nhanh,
giá trị độ hấp thụ đo được không khác
biệt nhiều giữa các khoảng thời gian phản
ứng. Dựa vào kết quả đo được, chúng tôi
lựa chọn khoảng thời gian thực hiện phản
ứng là 3 phút.

Tiến hành pha dung dịch chuẩn AM.
Cho dung dịch này phản ứng và chiết xuất
theo quy trình trên.

a

* Khảo sát hiệu suất chiết trong quy
trình định lượng:
Thực hiện đo quang phổ các mẫu được

xử lý theo quy trình đã lựa chọn. Chiết 4
lần các mẫu đo bằng 10 ml CH2Cl2.
Bảng 4: Hiệu suất chiết dẫn xuất tạo
thành trong phản ứng (n = 3).
b
Số thứ tự

Độ hấp thụ

Hiệu suất chiết (%)

Lần chiết 1

1,326 ± 0,050

85,23 ± 4,09

Lần chiết 2

0,182 ± 0,064

11,73 ± 3,88

Lần chiết 3

0,041 ± 0,021

2,65 ± 1,27

Lần chiết 4

0,006 ± 0,002

0,39 ± 0,13

Kết quả cho thấy trong lần chiết 1,
phần lớn dẫn xuất tạo thành đã được
chiết khỏi dung dịch phản ứng (85,23%).
Từ kết quả của các khảo sát trên, chúng
tôi lựa chọn quy trình định lượng như
sau: lấy 1 ml mẫu thử bằng pipet chính
xác vào bình gạn, thêm 5 ml dung dịch
BB 0,15% và 4 ml đệm acetat pH 3,5,
lắc trong 3 phút. Thêm chính xác 10 ml

Hình 1: Phổ hấp thụ của mẫu trắng (a) và
mẫu thử (b).
Kết quả cho thấy phổ hấp thụ của mẫu
thử sau quá trình xử lý mẫu có cực đại tại
408 nm. So với các mẫu trắng, không có
đỉnh cực đại tại bước sóng này. Do đó, có
thể dựa vào bước sóng này để định
lượng AM trong các mẫu thử.
77


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính:
Pha dung dịch AM chuẩn có nồng độ trong khoảng 20 - 250 µg/ml. Tiến hành xử lý
mẫu như điều kiện đã chọn.

Bảng 5: Đường chuẩn và khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng.
Nồng độ (µg/ml)

Độ hấp thụ

Độ đúng (%)

250

1,296

98,23

200

1,053

98,65

150

0,820

100,66

100

0,570

101,30

50

0,317

102,05

20

0,160

99,11

Kết quả khảo sát cho thấy: độ hấp thụ (A) và nồng độ (C, µg/ml) của mẫu đo có sự
tương quan tuyến tính với hệ số tương quan R là 0,999. Phương trình đường chuẩn
được xây dựng: A = 0,005043C + 0,06026.
Độ đúng của các điểm nồng độ trong đường chuẩn được xác định từ 98,23 102,05%. Như vậy, phương pháp định lượng có độ tuyến tính cao giữa độ hấp thụ và
nồng độ từ 20 - 250 µg/ml với độ đúng 98,23 - 102,05%.
* Độ chính xác:
Xác định bằng cách đo dung dịch chuẩn AM tại 3 nồng độ 50, 100, 150 µg/ml. Mỗi điểm
nồng độ làm lặp lại 6 lần. Xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn. Thực hiện phân tích
các mẫu trong ngày và khác ngày để xác định độ chính xác trong ngày (độ lặp lại) và độ
chính xác khác ngày (độ chính xác trung gian).
Bảng 6: Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày.
Trong ngày
Mẫu

Nồng độ
( X ± SD)

RSD (%)

Khác ngày
Độ đúng

Nồng độ

( X %)

( X ± SD)

RSD (%)

Độ đúng
( X %)

LQC (µg/ml)

50,38 ± 2,58

5,12

100,99

49,90 ± 2,65

5,31

100,01

MQC (µg/ml)

102,73 ± 3,46

3,37

102,96

101,92 ± 3,64

3,57

102,14

HQC (µg/ml)

143,62 ± 4,35

3,03

95,96

144,39 ± 4,98

3,45

96,47

Tại cả 3 nồng độ (50; 100 và 150 µg/ml), phương pháp đều cho độ đúng tốt (96,96 103,96%) và độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,45 - 5,31%), chứng tỏ
phương pháp định lượng có độ đúng, độ chính xác, đảm bảo yêu cầu cho phân tích

định lượng trong mẫu thử độ hòa tan và những nghiên cứu định lượng khác.
78


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016
KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình
định lượng AM dựa trên phản ứng tạo
dẫn xuất giữa amantadin và BB. Các điều
kiện đã được khảo sát cho quy trình định
lượng là: lấy 1 ml mẫu thử bằng pipet
chính xác vào bình gạn, thêm 5 ml dung
dịch BB 0,15% và 4 ml đệm acetat pH
3,5. Lắc trong 3 phút. Thêm chính xác
10 ml CH2Cl2 vào bình gạn, lắc kỹ trong
3 phút. Tách lấy phần dung dịch CH2Cl2,
đem đo độ hấp thụ tại bước sóng 408 nm.

1. IA Darwish et al. Simple and sensitive
spectrophotometric methods for determination
of amantadine hydrochloride. Journal of Applied
Spectroscopy. 2006, 73 (6), pp.792-797.

Phương pháp định lượng đã được
thẩm định có độ đặc hiệu, độ đúng và độ
chính xác cao. Độ hấp thụ (A) và nồng độ
(C) của mẫu đo có tương quan tuyến tính

trong khoảng nồng độ 20 - 250 µg/ml với
hệ số tương quan R là 0,999, phương
trình đường chuẩn được xây dựng:
A = 0,005043C + 0,06026. Kết quả cho
thấy phương pháp xây dựng và thẩm định
này phù hợp cho định lượng AM trong
các mẫu thử độ hòa tan và nghiên cứu
định lượng khác.

2. Y Higash et al. Simultaneous liquid
chromatographic assay of amantadine and its
four related compounds in phosphate-buffered
saline using 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole
as a fluorescent derivatization reagent. Biomedical
Chromatography. 2006, 20 (5), pp.423-428.
3. HF Askal et al. Quantitative thin-layer
chromatographic method for determination of
amantadine hydrochloride. International Journal
of Biomedical Science. 2008, 4 (2), pp.155-160.
4. HJ Leis, G Fauler, W Windischhofer.
Quantitative analysis of memantine in human
plasma by gas chromatography/negative ion
chemical ionization/mass spectrometry. Journal
of Mass Spectrometry, 2002, 37 (5), pp.477-480.
5. MA Martin, B Del Castillo. 2,3-diphenylquinolizinium
bromide as a fluorescent derivatization reagent
for amines. Analytica Chimica Acta. 1991, 245 (2),
pp.217-223.
6. ICH Q2(R1). International Conference on
Harmonisation. Validation of analytical procedures.

Methodology. 2005.

79