Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC
TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B
Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm**
Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ**
TÓM TẮT
Mục tiêu: khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome
amphotericin B (AmB). Phương pháp: liposome AmB được bào chế theo phương pháp hydrat
hóa film và giảm KTTP bằng các phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm và đồng nhất hóa áp
suất cao kết hợp đùn qua màng. Kết quả: liposome AmB giảm KTTP bằng phương pháp đùn
tay với thiết bị mini extruder có độ đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP vẫn > 200 nm;
phương pháp dùng que siêu âm sau 4 phút có KTTP < 200 nm và phân bố KTTP đồng nhất
(PDI < 0,2); phương pháp dùng bể siêu âm đều cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) và
phân bố KTTP không đồng nhất (PDI > 0,5); phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp
đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng nhất hóa là 5000 psi, số chu kỳ đồng nhất hóa là 2,
màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn là 2 cho liposome AmB có hình cầu, đa số có 1 lớp,
KTTP < 200 nm và phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết luận: đã khảo sát được
một số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa áp
suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết quả tốt nhất. Đây là cơ sở để nghiên cứu giai đoạn tiếp
theo bào chế thuốc tiêm liposome AmB.
* Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước.

Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome
Amphotericin B
Summary
Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB.
Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle
size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of
high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method. Results:
Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with

miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater
than 200 nm; using ultrasonification probe method in 4 minutes enabled particle size to be
smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic
method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5);
* Học viện Quân y
** Đại học Dược Hà Nội
*** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang ()
Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/08/2016
Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016

39


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016
combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion
method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in
spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly 1 layer and particle size
distributed relatively evenly (PDI < 0.3). Conclusion: Several methods of particle size reduction
of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization
method with manual transmembrane extrusion method gave the best result. This is the basement
for further studies in preparing liposome AmB injection.
* Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Liposome là hệ mang thuốc có nhiều
ưu điểm nổi bật về kiểm soát giải phóng
và khả năng đưa thuốc tới cơ quan đích...
[2]. Để bào chế liposome, có nhiều phương
pháp khác nhau, trong đó phương pháp

hydrat hóa film thường được sử dụng do
có các ưu điểm như: kỹ thuật bào chế
tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng
cho tất cả các loại phospholipid, hiệu suất
liposome hóa với dược chất tan trong lipid
khá cao... Tuy nhiên, một trong những
hạn chế của phương pháp là liposome
thu được thường có kích thước lớn,
nhiều lớp và không đồng nhất (khoảng
50 - 1.000 nm) [2, 4]. Vì thế, nếu muốn
đưa liposome vào dạng bào chế thuốc
tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu được
liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất
hơn, nhằm giúp quá trình lọc vô khuẩn
thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích,
Liposome AmB đã được nghiên cứu
bào chế theo phương pháp hydrat hóa
film [1]. Nghiên cứu này nhằm: Trình bày
kết quả khảo sát một số phương pháp làm
giảm KTTP và đồng nhất hóa liposome
AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng
và có ý nghĩa quyết định đến quá trình
nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc
tiêm có chứa liposome AmB.
40

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên liệu và thiết bị.
- Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin

đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl
phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol
(Chol) và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn
USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tinh
khiết hóa học.
- Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor
R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32,
dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị
đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ);
thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin,
Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz
(Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht
(Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân
tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh);
kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
JEOL 1010 (Nhật Bản) và các thiết bị,
dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Phương pháp bào chế liposome AmB:
Liposome AmB được bào chế theo
phương pháp hydrat hóa film với các thành
phần chính gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol
[1].


T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016
* Phương pháp giảm KTTP và đồng nhất
hóa liposome AmB:
- Phương pháp đùn ép qua màng
polycarbonat bằng thiết bị mini extruder

[2, 3].
- Phương pháp siêu âm: bằng bể siêu
âm hoặc que siêu âm [2].
- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất
cao kết hợp đùn qua màng [2].
* Phương pháp đánh giá đặc tính của
liposome AmB:
- KTTP và độ đồng nhất: sử dụng
phương pháp tán xạ ánh sáng động với
thiết bị Zetasizer ZS90.
- Hình thái cấu trúc tiểu phân: bằng
phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền
qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
Tiến hành bào chế các mẫu liposome
AmB theo phương pháp hydrat hóa film
thu được kết quả có KTTP khoảng 738 1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 0,868. Các mẫu liposome AmB này được
dùng để khảo sát các biện pháp làm giảm
KTTP và đồng nhất hóa.
1. Kết quả khảo sát phương pháp đùn
qua màng bằng thiết bị mini extruder.
Liposome AmB sau khi bào chế được
đùn ép lần lượt qua màng polycarbonat
kích thước 1.000 - 400 - 200 nm bằng thiết
bị đùn tay mini extruder. Mỗi mẫu đùn
29 lần và giữ ở nhiệt độ 60oC trong suốt
quá trình đùn bằng bể điều nhiệt.

Bảng 1: KTTP và phân bố KTTP của các

mẫu liposome AmB trước và sau khi đùn tay.
Trước đùn

Sau đùn

KTTP (d.nm)

PDI

KTTP (d.nm)

PDI

738,8

0,495

207,5

0,122

750,0

0,566

211,6

0,111

761,6

0,686

233,5

0,227

Các mẫu liposome AmB sau đùn có
chỉ số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho
thấy phân bố KTTP đồng nhất. Tuy nhiên,
KTTP vẫn còn lớn (> 200 nm), thể tích
mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml nên khó áp
dụng ở quy mô lớn.
2. Kết quả khảo sát phương pháp
siêu âm.
* Phương pháp sử dụng que siêu âm:
Liposome AmB sau khi bào chế cho
vào cốc có mỏ. Sau đó, siêu âm bằng
máy siêu âm que UP200Ht. Sau thời gian
1, 2, 3… đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP
và phân bố KTTP.
Bảng 2: KTTP và phân bố KTTP của
các mẫu liposome AmB sử dụng que siêu
âm (n = 3).
Thời gian
siêu âm (phút)

KTTP
(d.nm)

PDI

Ban đầu

566,0 ± 11,5

0,607 ± 0,019

256,7 ± 5,3

0,453 ± 0,031

2

202,9 ± 4,3

0,411 ± 0,031

3

175,4 ± 4,5

0,303 ± 0,008

4

148,1 ± 0,1

0,255 ± 0,008

5

146,6 ± 1,3

0,212 ± 0,025

6

139,1 ± 0,1

0,220 ± 0,028

7

139,4 ± 0,1

0,227 ± 0,001

8

140,6 ± 0,4

0,248 ± 0,004

9

141,3 ± 4,7

0,253 ± 0,001

10

145,9 ± 1,0

0,272 ± 0,007

41


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016
Với phương pháp sử dụng que siêu
âm, sau 4 phút, các mẫu đã cho kết quả
có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương
đối đồng nhất (PDI < 0,3). Hạn chế của
phương pháp là thường đưa các tạp chất
vào chế phẩm [2] và chỉ áp dụng ở quy
mô nhỏ.
* Phương pháp sử dụng bể siêu âm:
Liposome AmB sau khi bào chế cho
vào cốc có mỏ và tiến hành siêu âm
trong bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình
siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây,
nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm 1 phút,
nghỉ 1 phút (mẫu A2); siêu âm 2 phút,
nghỉ 2 phút (mẫu A3) (trong quá trình siêu
âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt
cục bộ hỗn dịch liposome). Sau 20 phút,
lấy mẫu đo KTTP và phân bố KTTP.
Bảng 3: KTTP và phân bố KTTP của các
mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm

(n = 3).

Liposome AmB sau khi bào chế được
tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng
bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của
bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar).
Khảo sát số lần đùn khác nhau để tìm
ra điều kiện phù hợp. Sau đó, kết hợp
đùn qua màng 400 nm ở áp suất 500 psi
(35 bar).
* Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất
hóa:
Bảng 4: KTTP và phân bố KTTP của các
mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống
nhất hóa.
Số chu kỳ

KTTP (d.nm)

PDI

0

882,6

0,508

1

174,0

0,408

2

149,2

0,364

3

141,9

0,376

Mẫu

KTTP (d.nm)

PDI

4

135,1

0,382

A1

522,13 ± 26,05

0,727 ± 0,075

5

130,5

0,371

A2

507,97 ± 33,62

0,713 ± 0,104

6

121,1

0,376

A3

662,30 ± 59,01

0,542 ± 0,051

7

112,5

0,306

8

110,0

0,294

Sau 20 phút, các quy trình siêu âm
đều cho liposome AmB có KTTP lớn
(> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng
nhất (PDI > 0,5). Điều này cho thấy, hiệu
quả của việc giảm KTTP liposome AmB
bằng bể siêu âm cho kết quả thấp. Chỉ có
thể ứng dụng để sơ bộ giảm KTTP
liposome trước khi áp dụng các phương
pháp khác.
42

3. Kết quả khảo sát phương pháp
đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn
qua màng.

Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome
AmB đã giảm xuống dưới 200 nm. Tuy nhiên,
phân bố KTTP chưa đồng nhất (PDI > 0,4).
Từ chu kỳ thứ 2 trở đi, KTTP liposome
AmB có xu hướng giảm dần và PDI duy
trì khoảng 0,3. Vì vậy, cần kết hợp mẫu

đã giảm KTTP với đùn qua màng để tăng
độ đồng nhất.


T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016
* Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần đùn qua màng:
Các mẫu liposome AmB sau khi đồng nhất hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat
400 nm ở áp suất 500 psi.
Bảng 5: KTTP và phân bố KTTP các mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng.
Số lần

KTTP (d.nm)

PDI

0

149,2

0,364

1

134,3

0,337

2

134,9

0,281

3

131,8

0,274

4

131,6

0,275

Sau khi đùn qua màng 400 nm, ở chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đã đồng
nhất hơn. Sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP của mẫu giữa chu kỳ thứ 2 và các
chu kỳ tiếp theo không rõ rệt.
Hình ảnh chụp TEM các mẫu sau khi đồng nhất áp suất cao và đùn qua màng cho
thấy các tiểu phân vẫn có cấu trúc hình cầu, đa số có một lớp, KTTP nhỏ và đồng nhất
(hình 1).

(a) Ban đầu

(b) Sau giảm KTTP

Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm KTTP bằng
phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b).
43

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016
KẾT LUẬN
Đã tiến hành khảo sát các phương pháp
giảm KTTP liposome AmB, cụ thể:
- Với phương pháp đùn tay bằng thiết
bị mini extruder, liposome AmB có độ
đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP
vẫn lớn hơn 200 nm.
- Với phương pháp siêu âm dùng que
siêu âm, sau 4 phút đã cho liposome AmB
có KTTP nhỏ hơn 200 nm và phân bố KTTP
đồng nhất (PDI < 0,2).
- Với phương pháp siêu âm dùng bể
siêu âm, các quy trình siêu âm khác nhau
đều cho liposome AmB có KTTP lớn
(> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng
nhất (PDI > 0,5).
- Với phương pháp đồng nhất hóa áp
suất cao kết hợp đùn qua màng, áp suất
đồng nhất hóa là 5.000 psi, số chu kỳ đồng
nhất hóa là 2, màng polycarbonat 400 nm,
số lần đùn là 2 đã cho liposome AmB có
hình cầu, đa số có 1 lớp, KTTP < 200 nm

44

và phân bố KTTP tương đối đồng nhất
(PDI < 0,3).
Kết quả khảo sát này sẽ là cơ sở để

tiến hành các giai đoạn tiếp theo trong
quá trình nghiên cứu bào chế thuốc tiêm
liposome AmB.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Thị Minh Huệ, Nguyễn Văn Lâm,
Nguyễn Tuấn Quang. Nghiên cứu bào chế
liposome doxorubicin và AmB bằng phương
pháp hydrat hóa film. Tạp chí Khoa học và
Công nghệ Việt Nam. 2014, số 23, tr.61-64.
2. Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ. Kỹ
thuật nano và liposome ứng dụng trong dược
phẩm, mỹ phẩm. NXB Y học. 2013, tr.60-73.
3. Hope M J, Nayar R, Mayer L D, Cullis P.
R. Reduction of liposome size and preparation
of unilamellar vesicles by extrusion techniques.
Liposome Technology. 1993, 1, pp.123-139.
4. Wagner A et al. Liposomes technology
for industrial purposes. J Drug Del. 2011, 4,
pp.1-9.