Phát hiện các điểm đột biến trên gen gyra và parc của các chủng vi khuẩn lậu phân lập

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

PHÁT HIỆN CÁC ĐIỂM ĐỘT BIẾN TRÊN GEN GYRA VÀ PARC
CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LẬU PHÂN LẬP
Lê Văn Hưng
Trường Đại học Y Hà Nội
Nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh và giải thích cơ chế đề kháng của vi khuẩn lậu là rất cần thiết.
Tiến hành giải trình tự gen của 71 chủng vi khuẩn lậu được phân lập từ những bệnh nhân có hội chứng tiết
dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương nhằm tìm hiểu cơ chế đề kháng với
kháng sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu. Kết quả cho thấy các chủng nhạy cảm có nồng độ ức chế tối thiểu
(Minimum Inhibitory Concentratation - MIC) 0,002 - 0,060 µg/ml không có đột biến gen. Các chủng có MIC
càng cao càng xuất hiện nhiều đột biến trên gen gyrA và parC. Trên gen gyrA: 100% số chủng có đột biến
tại codon 91 (Ser thành Phe). 63,8% số chủng có đột biến tại codon 95 (Asp thành Ala), các đột biến ở vị trí
khác có tần số thấp hơn. Trên gen parC: 44,9% số chủng có đột biến tại codon 87 (Ser thành Asn). Đột biến
ở codon 86 và 91 xuất hiện với tần số thấp hơn.
Từ khóa: vi khuẩn lậu, kháng kháng sinh, ciprofloxacin, đột biến gen

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ciprofloxacin là một kháng sinh được chỉ
định điều trị bệnh lậu với liều uống duy nhất
(500 mg), vì vậy kháng sinh này được thầy
thuốc và bệnh nhân rất ưa chuộng. Do đó,
việc lạm dụng kháng sinh này đã dẫn tới tốc
độ đề kháng đang tăng nhanh và nếu không
có biện pháp can thiệp hữu hiệu, ciprofloxacin
có thể trở thành kháng sinh không có tác dụng
đối với vi khuẩn lậu trong thời gian tới. Nhiều
nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới
như Trees D. L và cộng sự (1998) tại Trung
tâm phòng chống bệnh xã hội Atlanta, Mỹ [1],
Su X. và Lind I. (2001) tại Đan Mạch [2]... về

những chủng vi khuẩn lậu kháng ciprofloxacin
cho thấy: những chủng đề kháng với
ciprofloxacin đều có những thay đổi trên gen
gyrA và gen parC. Đó là các gen có liên quan
đến kháng ciprofloxacin. Gen gyrA có độ dài
Địa chỉ liên hệ: Lê Văn Hưng - Bộ môn Da liễu - Trường
Đại học Y Hà Nội
Email:
Ngày nhận: 26/03/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013

TCNCYH 83 (3) - 2013

2.751 nucleotide, mã hoá 916 amino acid;
vùng quyết định đề kháng quinolon dài khoảng
279 nucleotide, mã hoá 93 amino acid. Gen
parC có độ dài 2.307 nucleotide, mã hoá 768
amino acid; vùng quyết định đề kháng
quinolon dài khoảng 255 nucleotide, mã hoá
85 amino acid. Những nghiên cứu về tình hình
kháng kháng sinh, cơ chế đề kháng của vi
khuẩn lậu là rất cần thiết và phải được tiến
hành thường xuyên nhằm đóng góp hữu hiệu
cho công tác phòng chống các bệnh lây truyền
qua đường tình dục nói chung và bệnh lậu nói
riêng. Xuất phát từ những lý do trên đề tài
nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu:
góp phần tìm hiểu cơ chế đề kháng với kháng
sinh ciprofloxacin của vi khuẩn lậu.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
1. Đối tượng
Trong khoảng thời gian từ năm 2005 đến
2007, có 5.091 bệnh nhân có hội chứng tiết
dịch niệu đạo, âm đạo đến khám tại bệnh viện
Da liễu Trung ương, phân lập được 503
chủng. Nghiên cứu này đã chọn ngẫu nhiên 6
35


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
tháng từ tháng 7 năm 2007 đến tháng 12 năm

3. Phương pháp

2007 được 71 chủng vi khuẩn lậu.

3.1. Kỹ thuật xác định vi khuẩn lậu

2. Vật liệu

Nhuộm Gram →Nuôi cấy trên môi trường

Tủ nuôi cấy CO2 Sanyo (Nhật Bản). Môi

Thayer - Martin →Test Oxidase và Neisseria 4H

trường Thayer - Martin, Neisseria 4H, Oxidase

→ Kết luận: Neisseria gonorrhoear → Tiến

hành kỹ thuật kháng sinh đồ: sử dụng E - test
để xác định MIC của vi khuẩn lậu.

(Mỹ). Thanh giấy E - test (Thụy Điển). Chủng
chuẩn: ATCC 49226 (WHO cung cấp) (bảng 1).

Bảng 1. Các đoạn mồi dùng trong phản ứng PCR và giải mã trình tự gen [3]

Trình tự mồi (5’ - 3’)

Gen

Kích thước đoạn gen
được khuếch đại

Mồi xuôi
Mồi ngược

CGGCGCGTACTGTACGCGATGCA
AATGTCTGCCAGCATTTCATGTGAGA

GyrA

279bp

Mồi xuôi
Mồi ngược

ATGCGCGATATGGGTTTGAC
GGACAACAGCAATTCCGCAA

ParC

255bp

Thiết kế

3.2. Quy trình PCR đối với gen gyrA và
gen parC
Sử dụng hóa chất của hãng Bio - rad (Hoa
Kỳ) với 2 cặp mồi đặc hiệu để tiến hành quy
trình PCR đối với gen gyrA và gen parC.
Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 10x
(5 ml); dNTP 10 mM (1 ml); MgCl2 50 mM (1,5

3.3. Quy trình giải trình tự gen
Quy trình giải trình tự đoạn gen có thể
chứa đột biến được thực hiện theo quy trình
hướng dẫn của hãng.
a. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng MinElute
PCR Purification Kit:
Thêm 200 ml buffer PB vào 40 ml sản

ml); Taq polymerase 5 UI/ml (0,5 ml); Dung
dịch DNA (5 ml); Mồi xuôi 10 mM (2,5 ml); Mồi

phẩm PCR, trộn đều bằng pipet. Cho toàn bộ

ngược 10 mM (2,5 ml); Nước khử ion (32 ml).
Tổng thể tích là 50 ml.

dịch vào cột chiết tách. Ly tâm 13.000 vòng/
phút trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch lọc. Thêm

- Chu kỳ nhiệt:
93oC 3 phút - [93oC 30 giây - 52oC 1 phút 72 C 1 phút] x 30 chu kì - 72oC 5 phút.
o

- Sản phẩm khuếch đại gen
Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose

750 ml buffer PE, ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 1 phút. Hút bỏ dịch lọc. Ly tâm thêm
20.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột
chiết tách sang ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 20 ml
buffer EB vào chính giữa cột chiết tách. Để ở

1,5% trong dung dịch đệm TBE 1x. Bản thạch
sau khi chạy điện di được ngâm trong dung

nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 10.000
vòng/phút. Bảo quản ở -20oC.

dịch ethidium bromid 0,5 mg/ml trong 30 phút,

b. Phản ứng giải trình tự (Sequencing
Reaction).

rửa qua nước cất. Chụp ảnh bản gel trong
buồng tối dưới ánh sáng cực tím. Sản phẩm

PCR được dùng để giải trình tự.
36

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen gyrA và
gen parC.
TCNCYH 83 (3) - 2013


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing

Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút bỏ

Core Kit: Pha Premix gồm 5X sequencing
buffer (4 ml); dNTP mix (1 ml); A dye

dịch nổi. Thêm 200 ml cồn 70%. Ly tâm
14.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút bỏ dịch

terminator (0,5 ml); C dye terminator (0,5 ml);
G dye terminator (0,5 ml); T dye terminator

nổi. Để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
Hoà tan bằng 25 ml final buffer.

(0,5 ml); AmpliTaq (1 ml).
Thành phần phản ứng: Premix 8µl, sản
phẩm PCR sau tinh sạch 5µl, mồi 3,2 pmol,
nước cất vừa đủ 20µl.
Chu kỳ nhiệt:

96oC 10 giây – [96oC 10 giây – 50oC 5 giây
– 60oC 4 phút] x 25 chu kỳ - 4oC 1 phút
c. Tinh sạch sản phẩm

- Đọc kết quả bằng máy ABI PRISM 310
của hãng Applied Biosystem.
Trình tự các nucleotide ở các mẫu nghiên
cứu được so sánh với trình tự nucleotide của
gen gyrA và parC của chủng vi khuẩn lậu gốc
để tìm ra các điểm khác nhau với chủng gốc.

III. KẾT QUẢ

Thêm vào 20 ml sản phẩm sequencing: 3
ml KCH3COO 3M pH = 7,0; 14,5 µl nước cất;
62,5 µl cồn 100%. Để nhiệt độ phòng 15 phút.

1. Kết quả điện di sản phẩm PCR xác
định đoạn gen gyrA, parC

Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR

Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm PCR

xác định đoạn gen gyrA
Giếng 1: chứng âm

xác định đoạn gen ParC
Giếng 1: chứng âm

Giếng 2: chứng dương
Giếng 3: thang ADN 100 bp

Giếng 2: chứng dương
Giếng 3: thang ADN 100 bp

Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính

Giếng 4 đến 7: kết quả dương tính

TCNCYH 83 (3) - 2013

37


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2. Trình tự nucleotid của đoạn gen gyrA chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)

3. Trình tự nucleotid của đoạn gen parC chứa đột biến (mũi tên đánh dấu điểm đột biến)

IV. BÀN LUẬN

vậy, MIC cũng có mối liên quan với số lượng

vi khuẩn lậu gồm: 2 chủng nhạy cảm và 69

đột biến [4]. Với MIC nhỏ, mang ít đột biến.
MIC lớn mang nhiều đột biến hơn. Kết quả

chủng đề kháng. Phân tích các đột biến trên

gen gyrA và parC và sự phối hợp giữa các đột

này tương đồng với những nghiên cứu của
các tác giả trên thế giới [5, 6, 7]. Tuy nhiên,

biến trên 2 gen này cho thấy: tất cả những
chủng đề kháng đều có đột biến trên 2 gen

nghiên cứu này thu được kết quả khác với các
tác giả các tác giả trên thế giới là những

gyrA và parC, số lượng đột biến cũng tăng
theo nồng độ MIC. 2 chủng nhạy cảm MIC

chủng kháng ciprofloxacin đều có đột biến trên

Nghiên cứu giải trình tự gen của 71 chủng

0,002 - 0,060 µg/ml (2,8%) không có thay đổi

gen gyrA tại codon 91 (Ser thành Phe). Điều
này có thể do những chủng vi khuẩn lậu lây

nào trong trình tự DNA. 11 chủng đề kháng có
MIC 1 - 2 µg/ml (tỷ lệ 15,5%) mang 2 đột biến

truyền hiện nay tại Việt Nam có nguồn gốc từ
cùng một chủng và mang tính khu vực [8]. Kết

trên gen gyrA và không mang đột biến trên

gen parC. 6 chủng đề kháng có MIC 1 - 2 µg/

quả của nghiên cứu thu được đã chứng minh
rằng sự đề kháng của vi khuẩn lậu với

ml (8,5%) mang 3 đột biến trên cả 2 gen gyrA

ciprofloxacin, loại thuốc được xem như liệu

và parC; 52 chủng đề kháng có MIC 3 - 32 µg/
ml (73,2%) mang 3 đột biến gồm 2 đột biến ở

pháp hàng đầu vào những năm 1990, đã tăng
lên nhanh chóng ở mức MIC cao đáng báo

codon 91 (Ser thành Phe) và codon 95 (Asp
thành Ala) của gen gyrA, và 1 đột biến ở

động với các đột biến mới ở vi khuẩn lậu. Do
đó sự giám sát liên tục về tính kháng kháng

codon 87 (Ser thành Asn) của gen parC. Như

sinh, với khuynh hướng ngày càng gia tăng

38

TCNCYH 83 (3) - 2013

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
những chủng đa đề kháng lan truyền trong
cộng đồng là rất cần thiết để có thể tránh
những thất bại trong điều trị.

3. Otero, L., et al (2001). First Isolate of a
Neisseria gonorrhoeae Strain

Associated

With an Ofloxacin Treatment Failure in Spain.
Sex Transm Dis, 28(10), 576 - 578.

V. KẾT LUẬN

4. Xu J. S., Wang B., Wang C. X., et al

Ciprofloxacin thuộc nhóm quinolon. Đích

(2006). Study on fluoroquinolone

resistance

tác động của nhóm kháng sinh này là ADN
gyrase và topoisomerase IV của vi khuẩn. Sự

and the relationship between resistance and

đột biến của vi khuẩn lậu (tại gen gyrA và
parC làm thay đổi đích kháng sinh, do đó dẫn

orrhoeae. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi,

đến sự đề kháng với kháng sinh ciprofloxacin
của vi khuẩn lậu.

5. Shultz T. R., Tapsall J. W., White P. A.
(2001). Correlation of in vitro susceptibilities to

Lời cảm ơn

newer quinolones of naturally occurring quino-

Xin cảm ơn sự giúp đỡ chân thành từ
PGS.TS. Trần Hậu Khang, ThS. Trần Mẫn
Chu, ThS. Phạm Đăng Bảng, PGS.TS.
Nguyễn Vũ Trung, CN. Ninh Thị Dần, CN. Lê
Phương Thảo bệnh viện Da liễu Trung ương
và GS.TS. Norihisa Ishii, Viện truyền nhiễm
quốc gia, Nhật Bản.

mutations of gyrA and parC in Neisseria gon27(8), 702 - 704.

lone-resistant Neisseria gonorrhoeae strains
with changes in gyrA and parC. Antimicrob
Agents Chemother, 45(3), 734 - 738.
6. Tanaka M., Nakayama H., Haraoka M.,
et al (2000). Antimicrobial resistance of Neisseria gonorrhoeae and high prevalence of
ciprofloxacin-resistant solates in Japan, 1993
to 1998. J Clin Microbiol, 38(2), 521 - 525.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

7. Zhang T., Zhou X., Chen Y., et al.

1. Trees D. L., Sandul A. L., Whittington
W. L et al (1998). Identification of novel mutation patterns in the parC gene of ciprofloxacinresistant isolates of Neisseria gonorrhoeae. Anti-

(2009). Fluoroquinolone resistance and mutation patterns in gyrA and parC genes in
Neisseria gonorrhoeae isolates from Shanghai, China. J Huazhong Univ Sci Technolog

microb Agents Chemother, 42(8), 2103 - 2105.
2. Su X., Lind I (2001). Molecular basis of
high - level ciprofloxacin resistance in Neisseria gonorrhoeae strains isolated in Denmark

Med Sci, 29(1), 29 - 34.

from

Neisseria

1995

to

1998.

Antimicrob

Chemother, 45(1), 117 - 123.

Agents

8. Chaudhry U., Ray K., Bala M., et al
(2002). Mutation patterns in gyrA and parC
genes of ciprofloxacin resistant isolates of
gonorrhoeae

from

India.

Sex

Transm Infect, 78(6), 440 - 444.

Summary
MUTATIONS IN GYRA AND PARC GENES OF
NEISSERIA GONORRHOEAE ISOLATED FROM PATIENTS
We study the antibiotic resistance and resistance mechanisms of N. gonorrhoeae. We
sequenced a part of gyrA and parC genes of 71 strains from patients admitted at the National
Hospital for Dermatology and Venereology with urethral and vaginal discharges to understand the
resistance mechanisms to ciprofloxacin. Ciprofloxacin-susceptible strains (MIC 0,002-0,060 µg/
TCNCYH 83 (3) - 2013

39


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
ml) had no mutation. The number of gyrA and parC mutations were proportional to MIC level. The

strains had Ser(91)Phe and Asp(95)Ala with the prevalence of 100% and 63.8%, respectively,
and lower prevalence at other positions on gyrA. On parC, 44.9% of the strains had Ser(87)Asn
and lower prevalence at other positions.
Key words: N. gonorrhoeae, antibiotic resistance, ciprofloxacin, gene mutations

XÁC ĐỊNH CA BỆNH ẤU TRÙNG SÁN DÂY CHÓ
ECHINOCOCCUS ORTLEPPI KÝ SINH Ở PHỔI TẠI VIỆT NAM
Nguyễn Văn Đề1, Tạ Chi Phương2, Ngô Thế Quân2
1

Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phổi Trung ương

Bệnh nhân nam giới ở tỉnh Thanh Hóa được mổ và điều trị tại bệnh viện Bệnh phổi Quốc gia tháng 3
năm 2013. Trước khi vào viện 2 tháng, bệnh nhân cảm thấy tức ngực bên phải, không sốt và không ho.
X - quang phổi có khối u bên phổi phải, bạch cầu ái toan tăng (12,8%). Kết quả xét nghiệm ELISA dương
tính với kháng nguyên Echinococcus. Kết quả phẫu thuật cắt bỏ khổi u thấy một kén nước (cyst) có kích
thước 6 x 7 cm. Trong kén có nhiều đầu sán dây và được xác định là Echinococcus ortleppi bằng hình thái
học và thẩm định bằng sinh học phân tử (sử dụng gen NADH hydrogenasa và 23S rebosome với sự tương
đồng nucleotide với Echinococcus ortleppi trên GenBank là 99,5%). Đây là ca bệnh ấu trùng sán dây chó
Echinococcus ortleppi, đã khẳng định bệnh có ở Việt Nam.
Từ khóa: phổi, Echinococcus ortleppi, hydatid cyst disease, Việt Nam

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

nhiệt đới mà ấu trùng có liên quan đến bệnh

dài 3 - 6 mm gồm 3 - 4 đốt, ký sinh ở ruột non

nang nước sán chó (cystic hydatid disease)
lưu hành ở Nam Brazil (Balbinotti et al, 2012)

họ chó. Trong 20 loài thuộc giống (chi) Echinococcus, có 2 loài quan trọng liên quan đến y

[1] và lần đầu tiên Echinococcus ortleppi
(genotype G5) được thông báo ở Italy (Casulli

học là E. granulosus (gây nang nước - cystic
echinococcosis) và E. multilocularis (gây bọc

et al, 2008) [2]. Ấu trùng sán dây chó ký sinh
ở động vật có vú như chó, mèo, gấu, báo, khỉ,

Sán dây chó (Echinoccocus) trưởng thành

nhiều túi nước - alveolar echinococcosis)[8].
Phân tích gen cho thấy Echinococcus granulosus (G1) và Echinococcus ortleppi (G5) là
thể đơn bội của Echinococcus granulosus xứ

Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Văn Đề, bộ môn Ký sinh trùng,
trường Đại học Y Hà Nội
Email:
Ngày nhận: 26/03/2013
Ngày được chấp thuận:

40

người và có khi ở cừu, dê, bò, lạc đà, hươu
và động vật gậm nhấm. Ấu trùng ký sinh ở
gan hay phủ tạng khác tạo những bọc nước
lớn chứa nhiều đầu sán, các bọc nước này

thường ở gan (65%), ở phổi (10%) và ở một
số cơ quan khác như thận, não. Khi bọc nước
vỡ, giải phóng các đầu sán và các đầu sán
này bám vào phủ tạng khác tạo nên bọc nước
mới [3, 4, 5].
Bệnh sán dây chó (Echinococcosis) gặp ở
TCNCYH 83 (3) - 2013