Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A
Bùi Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1,
Nguyễn Viết Tiến2, Nguyễn Thị Hà1, Tạ Thành Văn1
1

Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu, di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X. Nghiên cứu được
thực hiện nhằm xác định người lành mang gen bệnh để thực hiện tư vấn di truyền, góp phần ngăn ngừa và
giảm tỷ lệ mắc bệnh, tránh hậu quả nặng nề cho gia đình bệnh nhân và xã hội. Trong nghiên cứu này, 7
thành viên nữ trong 5 gia đình bệnh nhân hemophillia A được lựa chọn nghiên cứu; Sử dụng kỹ thuật
Inversion PCR và giải trình tự gen để xác định tình trang mang gen bệnh. Kết quả phát hiện được 4/7 trường
hợp là người lành mang gen bệnh ở dạng dị hợp tử.
Từ khóa: Hemophilia A, người lành mang gen bệnh

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh hemophilia (hay bệnh ưa chảy máu)

bệnh nhân, chẩn đoán trước sinh trên những

là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất

thai phụ có nguy cơ cao giúp tư vấn hôn nhân

thường chức năng của các yếu tố đông máu

và tư vấn di truyền, là biện pháp cơ bản để

huyết tương: yếu tố VIII gây bệnh hemophilia A,

ngăn ngừa và giảm tỷ lệ sinh con mắc bệnh,

yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, yếu tố XI

hạn chế tỷ lệ mắc bệnh chung cho cộng đồng.

gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A

Ở Việt Nam, năm 2004 Lê Nhật Minh và

phổ biến nhất, chiếm khoảng 85%, bệnh
hemophilia B chiếm 15 ÷ 20% các trường hợp
mắc bệnh hemophilia [1; 2].

cộng sự nghiên cứu phát hiện người lành
mang gen bệnh của 9 gia đình có con mắc
bệnh hemophilia A, sử dụng kỹ thuât cắt en-

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên

zym giới hạn (PCR - RFLP), tác giả đã phát

quan đến giới tính, gen bệnh nằm trên nhiễm

hiện được 44,44% người mẹ mang gen bệnh,

sắc thể X. Người mẹ mang gen bệnh có khả

còn lại trên 50% không phát hiện được [4].

năng truyền bệnh cho 50% con trai của họ, do
vậy chủ yếu bệnh nhân là nam. Tần suất mắc
bệnh hemophilia A là 1/4.000 ÷ 1/5.000 trẻ
trai. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A ở các nước
khác nhau nhưng có tần suất chung khoảng
30 ÷ 100/1.000.000 dân [3].

Có nhiều dạng đột biến trên gen F8 gây
bệnh hemophilia A như: đột biến đảo đoạn
intron 1, đảo đoạn intron 2, đột biến điểm... Để
phát hiện các dạng đột biến gen cần phải sử
dụng các kỹ thuật khác nhau cho từng dạng
đột biến cụ thể. Cho đến nay, ở Việt Nam

Nghiên cứu phát hiện người lành mang

chưa có một nghiên cứu nào phân tích trực

gen bệnh (mẹ, chị và em gái) trong gia đình

tiếp và toàn diện các dạng đột biến gen F8
trên bệnh nhân hemophilia A, đặc biệt là phát

Địa chỉ liên hệ: Tạ Thành Văn, trung tâm Gen - Protein,
trường Đại học Y Hà Nội
Email:
Ngày nhận: 17/4/2013
Ngày được chấp thuận: 20/6/2013

TCNCYH 83 (3) - 2013

hiện người lành mang gen bệnh. Vì vậy, đề tài
nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục
tiêu: Phát hiện người lành mang gen F8 đột
biến gây bệnh hemophilia A.
1


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

có đột biến mất 3 nucleotid bằng kỹ thuật giải
trình tự gen).

1. Đối tượng

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm
Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y

- Nhóm chứng: 5 người nam bình thường
khỏe mạnh.

Hà Nội.

- Nhóm nghiên cứu: 7 thành viên nữ trong
5 gia đình bệnh nhân hemophillia A đã được

Đột biến phát hiện được ở bệnh nhân là

đột biến chỉ điểm cho việc phát hiện trạng thái

xác định có đột biến gen F8 (bao gồm 01 bệnh

mang gen bệnh của người mẹ và các thành

nhân thể nặng có đột biến đảo đoạn intron 22
bằng phương pháp I-PCR, 03 bệnh nhân thể

viên nữ trong gia đình.

trung bình và nhẹ có đột biến điểm bằng kỹ
thuật giải trình tự gen, 01 bệnh nhân thể nặng

2. Phương pháp
2.1. Mô hình nghiên cứu

2.2. Tách chiết DNA

Ủ 41 µl hỗn hợp trên ở nhiệt độ 160C qua đêm

+ DNA được tách chiết theo phương pháp

→ Tinh sạch sản phẩm thu được bằng cột
GFXTM theo quy trình của hãng Amersham →

phenol/chloroform từ bạch cầu máu ngoại vi
của bệnh nhân và người nhà bệnh nhân (mẹ,
dì, chị gái).
+ Kiểm tra độ tinh sạch của DNA được

tách chiết: bằng phương pháp đo quang, dựa
vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 ÷ 2,0.
2.2.3. Xác định đột biến gen F8

Pha loãng sản phẩm thu (DNA đã đóng vòng)
trong 20 µl H2O.
+ Khuếch đại bằng phản ứng multiplexPCR:
Tổng thể tích 20 µl bao gồm: H2O 12,0 µl,
buffer 10X 2 µl, dNTPs 1,0 µl , DNA 3,0 µl,
Extaq 0,5 µl, các mồi: IU 0,5 µl, ID 0,5 µl , ED

- Kỹ thuật I - PCR (Inversion - PCR) xác
định đột biến đảo đoạn của Rosetti và cộng sự

0,5 µl.
Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex - PCR:

năm 2005 [5]. Quy trình gồm 3 bước:
+ Cắt bằng enzym BclI.

940C/2 phút; [940C/12 giây, 600C/30 giây,
720C/7 phút] x 35 chu kỳ; 720C/5 phút.

Thành phần phản ứng: 1,5 µg DNA, H2O
25,5 µl, Buffer 10X 3µl, enzym BclI 1,5 µl

- Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột

(Promega). Ủ 370C/4 giờ → Tinh sạch bằng

biến điểm
Sử dụng 38 cặp mồi được thiết kế bao phủ

phenol chloroform.
+ Nối bằng T4 ligate

toàn bộ chiều dài gen F8, 26 exon của gen F8
được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR và tiến

Thành phần phản ứng: 20 µl DNA, Buffer
10X 20µl, enzym T4 ligate 1,0 µl (Promega).

hành giải trình tự theo 2 chiều. Do có kích
thước lớn nhất, exon 14 được thiết kế 9 cặp

2

TCNCYH 83 (3) - 2013


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
mồi và exon 26 được thiết kế 5 cặp mồi để

từ vị trí đột biến đến hết chiều dài phân tử

khuếch đại toàn bộ chiều dài exon.

protein F8.
- Tiến hành giải trình tự gen F8 của người

III. KẾT QUẢ
1. Kết quả giải trình tự gen gia đình
bệnh nhân mã số 01
- Bệnh nhân mã số 1 được chẩn đoán lâm
sàng hemophilia A thể vừa. Bằng kỹ thuật giải
trình tự phát hiện exon 14 bị đột biến mất C tại
vị trí 2605 (del2605C), gây lệch khung dịch
mã, làm thay đổi trình tự các acid amin kể

mẹ và chị gái bệnh nhân tại vị trí đã xác định
được đột biến trên bệnh nhân ở exon 14. Kết
quả cho thấy ở người mẹ xuất hiện các đỉnh
chồng lên nhau sau điểm đột biến, điều này chỉ
ra rằng người mẹ ở trạng thái dị hợp tử (người
lành mang gen bệnh); chị gái bệnh nhân cho
thấy trình tự exon 14 hoàn toàn giống với
người bình thường, như vậy chị gái bệnh nhân
là người không mang gen bệnh (hình 1).

Hình 1. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 1

2. Kết quả giải trình tự gen gia đình
bệnh nhân mã số 03
- Bệnh nhân mã số 3 được chẩn đoán lâm
sàng hemophilia A thể nặng. Bệnh nhân được

định đột biến điểm bằng kỹ thuật giải trình tự
gen, kết quả cho thấy bệnh nhân có đột biến
mất 3 nucleotid TCT tại exon 13 gây mất acid
amin phenylalanine (vị trí codon 672).

tiến hành xác định đột biến đảo đoạn theo quy

- Người mẹ được xác định tình trạng mang

trình đã mô tả ở phần phương pháp, kết quả

gen bệnh tại vị trí đột biến chỉ điểm trên exon
13 bằng kỹ thuật giải trình tự gen. Kết quả cho

cho thấy bệnh nhân không có đột biến đảo
đoạn intron 1 và 22.
- Bệnh nhân tiếp tục được tiến hành xác

TCNCYH 83 (3) - 2013

thấy không có hình ảnh mất 3 nucleotid TCT
tại exon 13. Như vậy, người mẹ không mang
gen bệnh (hình 2).

3


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC

Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 3
3. Kết quả giải trình tự gen của gia đình
bệnh nhân mã số 04

- Người mẹ và người dì được xác định

- Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng
Hemophilia A thể nhẹ. Bệnh nhân được tiến

tình trạng mang gen bệnh tại vị trí đột biến
chỉ điểm trên exon 14 bằng kỹ thuật giải trình

hành giải trình tự toàn bộ gen F8 để xác định

tự gen. Kết quả cho thấy người mẹ ở trạng
thái dị hợp tử là người lành mang gen bệnh,

đột biến điểm. Kết quả cho thấy bệnh nhân có
đột biến thêm 1 nucleotid A trên exon 14 tại vị
trí gây lệch khung dịch mã (Thr904Asn fs*2).

dì bệnh nhân là người lành mang gen bệnh
(hình 3).

Bệnh nhân
Người bình thường

Dì bệnh nhân

Mẹ bệnh nhân

Hình 3. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số 4

4

TCNCYH 83 (3) - 2013


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
4. Kết quả chung
Bảng 1. Kết quả phát hiện người lành mang gen F8 đột biến trên thành viên nữ
của gia đình 5 bệnh nhân hemophilia A

Bệnh nhân hemophilia A
Bệnh nhân
mã số 1
Thể trung bình
Đột biến
del2605C trên
exon 14

Bệnh nhân
mã số 2
Thể nặng
Đột biến
đảo đoạn
intron 22

Bệnh nhân
mã số 3
Thể nặng
Đột biến mất
3 nucleotid
TCT

Bệnh nhân
mã số 4
Thể nhẹ
Đột biến thêm
1 nucleotid A
trên exon 14

Bệnh nhân
mã số 5
Thể trung bình
Đột biến thêm
1 nucleotid A
trên exon 3

Mẹ
bệnh nhân

Dị hợp tử

Dị hợp tử

Không mang
gen bệnh

Dị hợp tử

Dị hợp tử

Chị
bệnh nhân

Không mang
gen bệnh

Đối tượng
nghiên cứu

Dì
bệnh nhân
Tổng số

Không mang
gen bệnh
Số thành viên gia đình được phân tích gen F8 = 7 người
Số người lành mang gen bệnh = 4 người (4/5 người mẹ)
Số người không mang gen bệnh = 3 người (1/5 người mẹ + 1 chị gái + 1 người dì

IV. BÀN LUẬN

Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh

với nhiễm sắc thể giới tính X và không có alen

hemophilia A. Theo Oldenburg và cộng sự,
các dạng đột biến điểm (thay thế nucleotid,

tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Người mẹ
mang gen F8 ở trạng thái dị hợp tử có thể

gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ

lệ cao nhất (47,5%), tiếp đến là dạng đột biến

truyền gen bệnh cho con trai và khi đó,
con trai sẽ mắc bệnh hoặc truyền gen

đảo đoạn intron 1 và intron 22 (36,7%), còn lại
là đột biến xóa đoạn gen (10 ÷ 15%). Tùy

bệnh cho con gái, con gái ở dạng dị hợp
tử, người con gái này khi sinh con sẽ có

thuộc vào dạng đột biến và vị trí đột biến trên

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết

thể truyền gen bệnh cho con trai và con

gen F8 mà trên lâm sàng xuất hiện các thể
bệnh nặng nhẹ khác nhau. Mặc dù không có

gái. Người bố mang gen đột biến truyền
bệnh cho con gái ở dạng dị hợp tử. Đột

vai trò trong việc mã hóa hay tham gia quá
trình hoạt hóa yếu tố VIII, các vùng intron của

biến do di truyền chiếm 2/3 các trường
hợp đột biến gen F8, 1/3 các trường hợp

gen F8 là tác nhân chính gây ra các dạng đột

biến đảo đoạn ở những bệnh nhân hemophilia

còn lại là do đột biến mới phát sinh trong

A thể nặng [6].

quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc từ
người mẹ (denovo mutation).

Kết quả đột biến gen F8 của bệnh nhân là
cơ sở khoa học cho những phân tích phát

TCNCYH 83 (3) - 2013

5


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
hiện đột biến gen đối với các thành viên trong

- Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã

gia đình bệnh nhân và phát hiện người lành
mang gen bệnh. Trước đây, những thai phụ

số 04 cho thấy người mẹ mang gen F8 ở
trạng thái dị hợp tử và người mẹ này được tư

mang gen bệnh thường được tư vấn chỉ nên
sinh con gái, nếu thai nhi là nam thì khuyến

vấn cần làm chẩn đoán trước sinh bệnh
hemophilia A cho lần mang thai tiếp theo;

cáo nên đình chỉ thai nghén để tránh sinh con
bị bệnh hemophilia A. Ngày nay, những tiến

người dì không mang gen F8 bị đột biến, hiện
đang mang thai tuần thứ 18 và được tư vấn

bộ về sinh học phân tử đã cho phép phát hiện

không cần làm chẩn đoán trước sinh bệnh

chính xác những người ở trạng thái dị hợp tử
để thực hiện tư vấn hôn nhân và di truyền khi

hemophilia A cho những lần mang thai sau.
- Phân tích gen của gia đình bệnh nhân

gia đình bệnh nhân có nguyện vọng. Các thai
phụ có nguy cơ cao sinh con bị bệnh hemo-

mã số 05 với kết quả: người mẹ mang gen
bệnh, bởi vậy người mẹ cần làm chẩn đoán

philia A (người lành mang gen bệnh) được
khuyến khích thực hiện chẩn đoán trước sinh

trước sinh bệnh hemophilia A cho lần mang

thai thứ hai.

và có cơ hội sinh con trai khỏe mạnh. Quy

Nghiên cứu tuy mới chỉ thực hiện trên các

trình ấy cần có những điều kiện sau: (i) xác
định được dạng và vị trí đột biến gen F8 ở

thành viên của 05 gia đình bệnh nhân (7 người)
nhưng cho thấy việc xác định người lành mang

bệnh nhân, (ii) dựa vào phả hệ và phân tích
gen nhằm phát hiện những người lành mang

gen thu được kết quả khả quan, có ý nghĩa khoa
học, thực tiễn và nhân văn đồng thời cũng là cơ

gen bệnh trong cộng đồng những người cùng
huyết thống với bệnh nhân. Tuy nhiên, do gen

sở quan trọng cho những nghiên cứu tiếp theo
nhằm tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh

F8 rất dài nên việc xác định được vị trí đột

đối với các bệnh lý di truyền nói chung và bệnh

biến cần nhiều thời gian [7; 8].
- Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã

hemophilia A nói riêng.

số 01 cho thấy: người mẹ ở trạng thái dị hợp
tử, người chị gái không mang gen bệnh.
Người mẹ đang mang thai, được tư vấn cần
thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh
hemophilia A. Người chị gái không cần thiết
phải thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh
hemophilia A nếu sinh thêm con.

V. KẾT LUẬN
Phát hiện được 4/7 thành viên nữ của gia
đình 5 bệnh nhân hemophilia A ở trạng thái dị
hợp tử (người lành mang gen bệnh), là cơ sở
khoa học cho công tác tư vấn di truyền và
chẩn đoán trước sinh.

Lời cảm ơn

- Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã
số 02 cho thấy người mẹ mang gen đột biến

Nghiên cứu được hỗ trợ kinh phí của đề tài

đảo đoạn intron 22, được tư vấn cần có chẩn
đoán trước sinh bệnh hemophilia A cho những

cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
sinh học phân tử phát hiện đột biến gen gây

lần mang thai sau.

bệnh hemophilia A”.

- Phân tích gen của gia đình bệnh nhân mã
số 03 cho thấy người mẹ không mang gen F8

TÀI LIỆU THAM KHẢO

đột biến, như vậy người mẹ không cần thực
hiện chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A

1. Toole JJ, Knopf JL, Wozney JM (1984).
Molecular cloning of a cDNA encoding human

cho những lần mang thai sau.

antihaemophilic factor, Nature, 312, 342 - 347.

6

TCNCYH 83 (3) - 2013


TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC
2. Graw J, Brackmann HH, Oldenburg J
et al (2005). Haemophilia A: from mutation
analysis to new therapies, Nat Rev Genet. 6
(6), 488 - 501.

3. Goodeve AC, Peake I. (2003). The molecular basis of hemophilia A: genotypephenotype relationships and inhibitor develop-

5. Liliana C. Rossetti (2005). Genotyping
the Hemophilia Inversion Hotspot by use of
Inverse PCR, Hemostasis and Thrombosis, 51
(7), 1154 - 1158.
6. Oldenburg, J., Ananyeva, N. M, Saenko, E. L (2004). Molecular basis of haemophilia A, Haemophilia, 10 (4), 133 –139.

ment, Semin Thromb Hemost., 29(1), 23 - 30.
4. Lê Nhật Minh, Lê Thị Kim Tuyến, Đỗ
Trung Phấn (2004). Sử dụng phương pháp
ADN (PCR-RFLP) vùng intron 18 để xác định
các cá thể mang gen bệnh máu khó đông
hemophilia A, Tạp chí Y học thực hành, 8,
61 - 62.

7. A. M. Street, R. Ljung, S. A. Lavery
(2008). Management of carriers and babie
with Hemophilia, Haemphilia, 14(3), 181 - 187.
8. Anne Goodeve (2008), Moleculer
Genetic testing of Hemophilia A, Seminar in
thrombosis an Hemostasis, 34(6), 491 - 501.

Summary
DETECTION OF HEMOPHILIA A PATIENTS WITH RECESSIVE GENE
Hemophilia A is an inherited recessive X-linked disease that causes abnormal blood coagulation. In order to reduce the incidence of this disease to identify the recessive Hemophilia - A gene
carriers are important for prenatal diagnosis and genetic counseling. In this study, we selected 7
female members of 5 hemophillia A families; Reverse PCR and sequencing methods were used
to detect the recessive Hemophilia - A gene carrier. The result showed that 4 out of 7 female
members were found to have mutation in. in heterozygous form.

Keywords: Hemophilia A, recessive Hemophilia-A gene carrier

TCNCYH 83 (3) - 2013

7