Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu Enzym 21-Hydroxylase và phát hiện người lành mang gen bệnh

Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
trờng đại học y h nội


[\




Trần kiêm Hảo




xác định một số đột biến gen cyp21 gây bệnh tăng sản
thợng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase
v phát hiện ngời lnh mang gen bệnh





tóm tắt luận án tiến sĩ y học




Chuyên ngành : Nhi khoa
Mã số : 3.01.43

Hà Nội - 2007

Công trình đợc hon thnh tại
Trờng Đại học Y H Nội


Ngời hớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn THị Phợng
TS. Võ thị thơng lan


Phản biện 1: GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi. Phạm Gia Khánh


Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Thu Nhạn GS. TS. Đỗ Kim Sơn

Phản biện 3: TS. Nguyễn Trần ChiếnGS. TS. Phạm Duy Hiển


Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà
nớc tại Trờng Đại học Y Hà Nội
Vào hồi 14 giờ 00 ngày 06 tháng 06 năm 2007

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Trờng Đại học Y Hà Nội
- Th viện Thông tin Y Trung ơng
- Th viện Bệnh viện Trung ơng Huế
- Th viện Đại học Y khoa Huế


Một số công trình liên quan đến luận án



1. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thu Nhạn,
Nguyễn Thị Phợng, Vũ Chí Dũng, Bùi Phơng Thảo (2005),
Đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm bệnh tăng sản thợng thận bẩm
sinh ở trẻ gái, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 35(2), tr. 99-104.
2. Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan
(2005), Một số đột biến gen CYP21 và liên quan giữa kiểu gen-
kiểu hình của bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh, Hội nghị khoa
học toàn quốc 2005, Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản,
hớng 8.2, Bộ Khoa học Công nghệ, tr. 8-11.
3. Nguyễn Thị Hoàn, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Trần Kiêm Hảo
(2005), Kết quả điều trị bệnh TSTTBS trong 10 năm 1993-2002
tại BV Nhi Trung ơng, Tạp chí nghiên cứu Y học, tập 38(5), tr.
195-9.
4.
Trần Kiêm Hảo, Nguyễn Thị Phợng, Võ Thị Thơng Lan
(2006), ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện một số đột biến gen
CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh do thiếu 21-

hydroxylase, Nhi khoa, tập 14(số đặc biệt), tr. 184-8.


1
đặt vấn đề
Tăng sản thợng thận bẩm sinh (TSTTBS) là một trong những bệnh
thuộc hội chứng sinh dục thợng thận, đặc trng bởi sự thiếu hụt hoạt
tính một trong các enzym cần thiết sinh tổng hợp hormon vỏ thợng
thận. Thiếu enzym 21-hydroxylase (21-OH) hay gặp nhất, chiếm 90-
95% tất cả các trờng hợp TSTTBS.
Đột biến gen CYP21 gây nên thiếu hụt enzym 21-OH, bệnh di
truyền đơn gen lặn, thuộc nhiễm sắc thể thờng. Hiện nay, khoảng 10-
15 kiểu đột biến CYP21 là hay gặp ở hầu hết các quần thể.
Tuỳ mức độ thiếu hụt hoạt tính enzym 21-OH mà biểu hiện lâm
sàng ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau nh mất muối (mất muối),
nam hoá đơn thuần (NHĐT) hay thể không cổ điển (KCĐ).
Bệnh TSTTBS nếu không đợc chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp
sẽ dẫn đến suy thợng thận cấp đe dọa tử vong; nam hoá ở trẻ gái, giả
dậy thì sớm ở trẻ trai; ảnh hởng nặng nề đến sự phát triển thể chất,
chức năng sinh dục, sinh sản của bệnh nhân (BN), tâm lý của gia đình
và bệnh nhi khi lớn lên.
Điều trị bệnh TSTTBS dựa vào liệu pháp hormon thay thế suốt đời.
Dự phòng bệnh bằng cách sử dụng các biện pháp phòng bệnh di truyền
nh sàng lọc phát hiện ngời lành mang gen bệnh, t vấn di truyền
tiền hôn nhân, khi mang thai cho những ngời mang gen bệnh và chẩn
đoán trớc sinh cho con.
ở Việt Nam, cha có nghiên cứu nào về tỉ lệ mắc bệnh này. Tại
khoa Nội tiết Di truyền Chuyển hoá Bệnh viện Nhi Trung ơng, số
lợng bệnh nhân TSTTBS vào viện ngày càng tăng, trung bình 28
trờng hợp / năm từ 2000-2004. Việc ứng dụng kỹ thuật phản ứng

chuỗi trùng hợp PCR để xác định các đột biến gen CYP21 gây bệnh
TSTTBS thiếu 21-OH chỉ mới đợc đề cập qua 2 công trình nghiên cứu

2
của V. T. Kim Huệ và T. T. Nam. Do vậy, cần phải tiếp tục nghiên cứu
sâu hơn vấn đề này.
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: "Xác định một số đột biến
gen CYP21 gây bệnh tăng sản thợng thận bẩm sinh thiếu enzym
21-hydroxylase và phát hiện ngời lành mang gen bệnh" với các
mục tiêu sau:
1. Xác định một số đột biến gen CYP21 gây bệnh TSTTBS bằng kỹ
thuật phản ứng chuỗi trùng hợp PCR.
2. Đối chiếu, tìm hiểu mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình
của bệnh nhân TSTTBS do thiếu enzym 21-hydroxylase.
3. Phát hiện ngời lành mang gen bệnh cho các thành viên của gia
đình bệnh nhân thiếu enzym 21-hydroxylase.


Chơng 1
tổng quan ti liệu
1.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng gen CYP21
1.1.1. Vị trí, cấu trúc gen CYP21
Gen CYP21 là thành viên của nhóm Cytochrome P450c21. Gen
CYP21 gồm 2 bản sao, một bản có chức năng (CYP21 hay CYP21B)
và bản sao còn lại không có chức năng (CYP21P hay CYP21A).
Gen CYP21 và CYP21P nằm bên trong phức hợp hoà hợp mô chủ
yếu MHC trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 6, vùng 21.3 (6p21.3), cách
nhau khoảng 30 kb, gần kề và xen kẽ với các gen C4B và C4A mã hoá
thành phần C4 bổ thể.
Gen CYP21 gối vào gen tenascin-X (TNXB) ở sợi ADN đối diện và

gen CYP21P gối vào bản sao thu ngắn của gen TNXB là TNXA.

3

Hình 1.4. Vị trí của gen CYP21 bên trong phức hợp hoà hợp mô
chủ yếu MHC trên nhiễm sắc thể số 6 và các gen xung quanh CYP21.
Nh vậy, thứ tự phân bố của các gen này nh sau: RP1-C4A-
CYP21P-TNXA-RP2-C4B-CYP21-TNXB (Hình 1.4).




Hình 1.5. Cấu trúc phân tử của gen CYP21.
Mỗi gen CYP21 và CYP21P gồm 10 exon, chiều dài 3,4 kb. Trình
tự nucleotide của 2 gen này tơng đồng 98% ở các exon và 96% ở các
intron. Gen CYP21P không hoạt động do mang một số đột biến ở vùng
điều khiển hoặc do đột biến trầm trọng ở các vùng mã di truyền.
1.1.2. Chức năng gen CYP21
Gen CYP21 mã hoá enzym 21-OH gồm 494 acid amin.
Quá trình tổng hợp enzym 21-OH của vỏ thợng thận nh sau: đầu
tiên gen CYP21 phiên mã tổng hợp phân tử ARNm tiền thân. Phân tử
này trải qua quá trình cắt các intron, nối chính xác các exon với nhau
để tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Phân tử ARNm hoàn chỉnh đợc
sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH.
Enzym 21-OH cùng với các enzym cholesterone desmolase, 3-
hydroxysteroid dehydrogenase, aldosterone synthase và 17-OH tham
gia vào quá trình tổng hợp hormon vỏ thợng thận (Hình 1.2).
1
Vị trí bắt đầu sao
mã cap site

3
5
2 3 4 5 87 10 69
Vùng
tăng
cờng
Yếu tố
đặc hiệu
mô
ATG - mã bắt đầu
TAA, TGA, TAG
- mã kết thúc
Vùng không sao mã
Vùng không sao mã

4
1.2. Sinh lý bệnh của TSTTBS
Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển progesteron thành 11-
deoxycorticosteron (DOC) và 17-Hydroxyprogesteron (17-OHP) thành
11-deoxycortisol.








Hình 1.7. Sơ đồ rối loạn sinh tổng hợp hormon vỏ thợng thận do
thiếu enzym 21-OH.

Khi thiếu enzym 21-OH, progesteron không thể chuyển thành DOC
và 17-OHP không thể chuyển thành 11-deoxycortisol (Hình 1.7). Hậu
quả là quá trình tổng hợp aldosteron và cortisol bị khiếm khuyết, gây ứ
đọng các tiền chất trớc chỗ tắc là progesteron, 17-OHP. Qua cơ chế
điều hòa ngợc sẽ kích thích tăng bài tiết ACTH, từ đó tăng sản xuất
các hormon theo con đờng không bị tắc (testosteron).
1.3. Lâm sàng của TSTTBS thể cổ điển
1.3.1. Mất muối
Enzym 21-hydroxylase thiếu hoàn toàn (0%) hoặc có ít và nồng độ
cortisol, aldosteron không thể quay về bình thờng.
Bệnh nhân nặng thờng có biểu hiện suy thợng thận cấp, giảm
natri máu, tăng kali máu, sốc giảm thể tích xảy ra vào tuần thứ 1-4 sau
sinh và có thể dẫn đến tử vong. Các dấu hiệu sớm là nôn, tiêu chảy,
mất nớc và sụt cân. Mất muối có thể gồm những triệu chứng không
đặc hiệu nh giảm khẩu vị, nôn, li bì và không tăng cân.
Cholesterol
Pre
g
nenolon
11-Deox
y
corticosteron
Pro
g
esteron
Corticosteron
Aldosteron
17-H
y
drox

yp
re
g
nenolon
DHEA
17-Hydroxyprogesteron



Androstenedion
11-Deoxycortisol
Cortisol
Testosteron
Dih
y
drotestosteron
Estron
Estradiol
21-OH

5
Ngoài ra, bệnh nhân còn có xạm da, trẻ gái có thể phì đại âm vật và
trẻ trai có thể to dơng vật.
1.3.2. Nam hoá đơn thuần
Thiếu enzym 21-OH ở mức độ vừa phải (1-3%) nên quá trình tổng
hợp cortisol, aldosteron vẫn còn.
Trẻ gái biểu hiện nam hóa bộ phận sinh dục ngoài. Biểu hiện nam
hoá thờng có ngay sau khi đẻ, âm vật to, các môi có thể dính với
nhau. Chiều cao và tuổi xơng phát triển nhanh. Từ 10-11 tuổi, trẻ
ngừng lớn và đạt chiều cao cuối cùng 140-150 cm. Khi trởng thành

bệnh nhân thờng có thân hình giống đàn ông, phát triển tuyến vú
kém, rối loạn chức năng buồng trứng và không có kinh nguyệt.
ở trẻ nam, cờng androgen diễn ra nhanh bắt đầu từ 2-3 tuổi, gồm
các dấu hiệu dậy thì sinh dục phụ sớm nh mọc lông mu, lông nách,
sau đó mọc trứng cá và giọng trầm. Đồng thời dơng vật to nhanh,
thờng cơng cứng, tinh hoàn vẫn nhỏ tơng ứng với tuổi. Chiều cao
và tuổi xơng phát triển mạnh, từ 8-10 tuổi trẻ ngừng lớn. Một số trẻ
nam không đợc điều trị có thể có vết tích vỏ thợng thận đã tăng sản.
1.4. Một số đột biến gen CYP21 và liên quan kiểu gen kiểu hình
Hầu hết các đột biến gen gây thiếu 21-OH là hậu quả của một trong
2 kiểu tái tổ hợp giữa 2 gen CYP21 và CYP21P: trao đổi chéo qua lại
không tơng xứng trong quá trình gián phân gây mất đoạn gen; hay
chuyển đoạn gen khiến các đột biến từ CYP21P chuyển sang CYP21.

Hình 1.8. Vị trí các đột biến gen CYP21 thờng gặp và kiểu hình.
Khôn
g
cổ điển
Nam hoá đơn thuần
Mất muối

6
Đột biến gen CYP21 có thể chia thành 4 nhóm tùy thuộc vào mức
độ hoạt tính 21-OH.
Nhóm thứ nhất (nhóm A) bao gồm các đột biến gen CYP21 trầm
trọng nh mất đoạn, chuyển đoạn gen lớn hay đột biến vô nghĩa, dịch
khung (nh mất 8bp ở exon 3, đột biến điểm I2g ở intron 2 ) làm mất
hoàn toàn hoạt tính 21-OH; thờng liên quan với thể MM của bệnh,
bất kể kiểu gen là đồng hợp tử hay dị hợp tử đột biến.
Nhóm thứ hai (nhóm B) chủ yếu là đột biến nhầm nghĩa Ile172Asn,

khiến cho hoạt tính 21-OH chỉ còn 1-2% và đợc tìm thấy đặc trng ở
thể NHĐT.
Nhóm thứ ba (nhóm C) bao gồm những đột biến nh Val281Leu,
Pro30Leu và Pro453Ser tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 20-60%;
những đột biến này liên quan đến thể bệnh không cổ điển.
Nhóm thứ t (nhóm D) bao gồm các đột biến cha đợc sắp xếp
còn lại và các đột biến mới.
1.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)
Phản ứng PCR do Kary Mullis và cs phát minh năm 1985. PCR cho
phép nhân một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome đạt đến số
lợng mong muốn khi biết trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó.
Nguyên tắc của PCR dựa vào đặc điểm của quá trình sao chép ADN.
Các bớc cơ bản của phản ứng PCR đợc mô tả bởi hình 1.9. Mỗi chu
kỳ phản ứng đòi hỏi 3 bớc:
+ Biến tính (denaturation): Phân tử ADN đợc xử lý ở nhiệt độ cao
để tách ADN khuôn dạng kép thành hai sợi đơn, thờng là 94-95
0
C.
+ Gắn mồi (annealing): Nhiệt độ hạ thấp dới nhiệt độ nóng chảy
Tm của các mồi, cho phép các mồi liên kết bắt cặp với các sợi đơn
ADN khuôn theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung.
+ Tổng hợp bởi Taq-polymerase (synthesis): Taq sử dụng 4 loại
dNTP để kéo dài sợi mồi, tổng hợp sợi ADN mới.

7
3 bớc cơ bản tạo thành 1 chu kỳ trong phản ứng PCR. Khi các chu
kỳ đợc lặp lại, các đoạn ADN vừa đợc tổng hợp ở các chu kỳ trớc
trở thành khuôn cho chu kỳ sau. Số lợng phân tử ADN tạo ra tăng gấp
đôi sau mỗi chu kỳ. Số chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thờng
không quá 60.

Hình 1.12. Các bớc cơ bản của phản ứng chuỗi trùng hợp PCR.
Khuếch đại gen CYP21 bằng PCR
Do giả gen CYP21P có tính tơng đồng cao, việc khuếch đại gen
CYP21 không dễ thực hiện. Các mồi phải đợc chọn lựa để nhận biết các
trình tự ở CYP21 mà không có ở CYP21P. Hầu hết các tác giả đều sử
dụng 2 đoạn mà ở đấy CYP21 khác với CYP21P. Đó là đoạn 8 bp ở exon
3 của CYP21 (nhng đã bị mất ở CYP21P) và một số các đột biến ở
exon 6 (gồm các khác biệt 4 nucleotide giữa CYP21 và CYP21P). Bằng
phơng thức này, gen CYP21 có thể đợc khuếch đại thành 2 đoạn gối
chồng lên nhau (Hình 1.13).

Hình 1.13. Hai đoạn gen CYP21 đợc khuếch đại gối lên nhau.

8
Sau khi khuếch đại, nhiều phơng pháp khác nhau giúp phát hiện
đột biến gen có thể đợc sử dụng, nh kỹ thuật lai oligonucleotide đặc
hiệu allen, phản ứng PCR đặc hiệu allen, phản ứng phát hiện sự nối,
xác định trình tự nucleotide


Chơng 2
đối tợng v Phơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối tợng
2.1.1. Bệnh nhân
43 bệnh nhi đợc chẩn đoán và điều trị TSTTBS do thiếu enzym 21-
OH cổ điển tại Khoa Nội tiết - Di truyền - Chuyển hoá Bệnh viện Nhi
Trung ơng, thời gian nhập viện từ năm 1993-2003. Chẩn đoán dựa
vào lâm sàng, sinh hoá và hormon:
Lâm sàng:

- Thể mất muối: có biểu hiện suy thợng thận cấp, có phì đại âm
vật ở trẻ gái và có thể có phì đại dơng vật ở trẻ trai.
- Thể nam hoá đơn thuần: có hội chứng cờng androgen nh dậy thì
sớm ở trẻ trai, chuyển giới bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái. Phát triển
thể lực nhanh và xuất hiện các dấu hiệu dậy thì sinh dục phụ.
Sinh hoá:
- Nồng độ progesterone > 1,1 nmol/l và 17-OHP máu > 6 nmol/l.
- Nồng độ testosterone máu > 1 nmol/l và 17-CS nớc tiểu > 14
mol/24giờ.
- Điện giải đồ rối loạn ở thể MM, natri máu < 133 mmol/l và kali
máu > 5,2 mmol/l. Điện giải đồ bình thờng ở thể NHĐT.
2.1.2. Thành viên gia đình bệnh nhân

9
Chọn 5 gia đình có con bị bệnh đã đợc thực hiện PCR phát hiện
đột biến gen CYP21, các thành viên này gồm bố mẹ anh chị em ruột.
2.2. Phơng pháp
2.2.1. Phát hiện các đột biến gen CYP21 bằng kỹ thuật PCR
2.2.1.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm gồm 6-10 sợi tóc có chân trắng ở gốc.
2.2.1.2. Chiết tách ADN
ADN hệ gen đợc chiết tách bằng cách ủ 5-10 đoạn tóc có chứa
chân tóc với dung dịch Chelex 10% ở 100
0
C trong 10 phút, nhằm phá
vỡ màng tế bào và giải phóng ADN ra khỏi nhân.
Sau khi ly tâm 5 phút, sẽ thu đợc ADN khuôn cho phản ứng PCR.
2.2.1.3. Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Phản ứng PCR sử dụng một số cặp mồi đặc hiệu đối với một số đột
biến gen CYP21 hay gặp. Trình tự các cặp mồi đợc thiết kế dựa vào trình

tự gen CYP21 đã đợc xác định và do hãng Proligo Nhật Bản sản xuất.

Hình 2.1. Minh họa vị trí gắn các cặp mồi PCR trên gen CYP21.
Trong đó, P1/P2 và P7/P8 là 2 cặp mồi để phát hiện đột biến điểm I2g
ở intron 2; A1/A2 hoặc hai cặp mồi P1/P2, P9/P10 dùng để phát hiện
đột biến mất đoạn 8bp ở exon 3; B1/B2 là cặp mồi dùng để phát hiện
đột biến Pro30Leu ở exon 1.
Thành phần của mỗi phản ứng PCR gồm ADN khuôn, hỗn hợp 4 loại
dNTP, dung dịch đệm MgCl
2
, các mồi, Taq polymerase và nớc cất.
nested-PCR 8bp.
A1x
B1x
P1x
w
A
2
wB2
wP8
P7x
P9x wP10
nested-PCR I2
g

PCR Pro30Leu
PCR

8bp.
wP2

10
Bảng 2.1. Trình tự các mồi và điều kiện khuếch đại PCR
Mồi Trình tự (5'-3') Điều kiện PCR
A1 CTCCTGCAGACAAGCTGGTG
A2 GAACTCCTGGGTCAGCTGCT
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
60
0
C/1', 72
0
C/1'); 72
0
C/5'.
B1 TTTTGTTCTTCAGGCGATTCA
B2 TCCAGAGCAGGGAGTAGTTCTC
94
0
C/3'; 45 chu kỳ ì (94
0
C/30,
54
0
C/1', 72
0
C/3'); 72

0
C/10'.
P1 TGGAACTGGTGGAAGCTCCGG
P2 GCATCTCCACGATGTGA
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
56
0
C/1', 72
0
C/1'); 72
0
C/10'.
P7 GTGGTGCTGAACTCCAA
P8 ACACCAGCTTGTCTGCAGGAGGCG
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
60
0
C/30", 72
0
C/2'); 72
0
C/10'.

P9
Agcccccaactcctcctgca
P10
tgtgggctttccagagc
94
0
C/3'; 40 chu kỳ ì (94
0
C/30,
60
0
C/30", 72
0
C/2'); 72
0
C/10'.
(nucleotide đã sửa đổi đợc gạch dới).
Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi P1/P2 và P7/P8 đợc cắt bởi enzyme
giới hạn HhaI và sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2 đợc cắt bởi
enzyme giới hạn AciI.
Sản phẩm PCR cuối cùng sẽ đợc điện di trên thạch agarose/nu-
sieve 3:1 nồng độ 4%. Tuỳ độ dài các băng ADN thu đợc sẽ cho biết
BN có đột biến gen CYP21 hay không (Bảng 2.2).
Bảng 2.2. Kích thớc các đoạn ADN đợc cắt bởi enzym giới hạn.
Kích thớc đoạn ADN (bp)
Đột biến Enzym giới hạn
Bình thờng Đột biến

158 150
Mất 8 bp

89 81/9
Pro30Leu
AciI
153/43 196
A/C656G
HhaI
378 354/24

2.2.2. Đối chiếu kiểu đột biến gen và đặc điểm kiểu hình
Các BN có kết quả đột biến gen CYP21 sẽ đợc chia thành các
nhóm theo từng kiểu đột biến gen và đối chiếu với các triệu chứng lâm
sàng MM hay NHĐT cũng nh các xét nghiệm sinh hóa. Từ đó xác
định mức độ nặng nhẹ của từng kiểu đột biến gen CYP21.

11
2.2.3. Phát hiện ngời lành mang gen cho các thành viên gia đình
Tiến hành phản ứng PCR để phát hiện tình trạng mang gen CYP21
đột biến cho các đối tợng này với quy trình nh đã nêu (Phần 2.2.1).
Thăm khám tiền sử gia đình và lập sơ đồ gia hệ.
Phân tích kết quả của từng kiểu đột biến gen CYP21 đối với BN và
các thành viên gia đình, từ đó nhận xét phơng thức di truyền của bệnh.
2.3. Xử lý kết quả
Sử dụng phần mềm vi tính Epi Info 6.04 và các phơng pháp thống
kê y học thông thờng trong xử lý và phân tích số liệu.


Chơng 3 4
Kết quả nghiên cứu v bn luận
43 BN của 41 gia đình đợc chẩn đoán bệnh TSTTBS do thiếu

enzym 21-OH. 10 bố mẹ của 5 gia đình BN TSTTBS.
Qua phân tích số liệu, chúng tôi thu đợc kết quả sau:
1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
1.1. Các thể lâm sàng của bệnh TSTTBS cổ điển
MM gồm 31 BN, tỉ lệ 72,1%. NHĐT gồm 12 BN, tỉ lệ 27,9% tổng
số 43 đối tợng nghiên cứu, thấp hơn có ý nghĩa, p < 0,05.
1.2. Giới tính
Nam 20 BN, tỉ lệ 46,5% và nữ 23 BN, tỉ lệ 53,5% trên tổng số 43
BN, p > 0,05. Tức tỉ lệ mắc bệnh của nam và nữ tơng đơng, phù hợp
đặc điểm di truyền của bệnh TSTTBS, gen lặn nhiễm sắc thể thờng.
1.3. Tuổi bệnh nhân lúc vào viện lần đầu
Trung bình đối với BN TSTTBS là 1,5 tháng (5 ngày - 80 tháng).

12
Thể MM là 1,3 tháng (5 ngày-19 tháng); sớm hơn có ý nghĩa so với
NHĐT là 22,0 tháng (2 tuần-80 tháng), p < 0,001.
1.4. Tiền sử sản khoa và tiền sử gia đình
- 31/34 = 91,2% BN có tuổi thai đủ tháng 38 tuần.
- Cân nặng lúc sinh của BN thể MM (3080 427 gr) tơng đơng
thể NHĐT ( 3166 280 gr), p > 0,05.
- 48,8% là con thứ hai (21 BN).
- 20,9% BN có tiền sử gia đình có con mắc bệnh tơng tự.
2. Kết quả phát hiện các đột biến gen CYP21 trên BN
Với một số cặp mồi đặc hiệu cho một số đột biến gen CYP21, thực
hiện PCR kết hợp enzym cắt giới hạn, chúng tôi đã phát hiện đợc 24
trờng hợp đột biến gen CYP21; chiếm 55,8%. 19 trờng hợp cha
phát hiện đợc kiểu đột biến gen; chiếm 44,2%. Cụ thể nh sau:
2.1. Đột biến điểm ở intron 2 (I2g)
A.

B.
Hình 3.4. Sản phẩm PCR với 2 cặp mồi P1/P2 và P7/P8 sau khi
điện di trên thạch agarose /nu-sieve.
A. Trớc khi cắt bởi HhaI, sản phẩm PCR chỉ có một băng ADN 378 bp.
B. Kết quả sản phẩm PCR sau khi cắt bởi enzym HhaI:
. Cột 1, 5, 6, 7 chỉ có 1 băng ADN 354 bp, đồng hợp tử đột biến I2g
. Cột 2, 4 chỉ có 1 băng ADN 378 bp, không mang đột biến I2g
. Cột 3, 8 hiển thị cả 2 băng ADN 378 bp và 354 bp, tức dị hợp tử đột
biến I2g. M-marker ADN 174/HaeIII.

Phát hiện 6 trờng hợp đồng hợp tử I2g; chiếm 13,9%. 7 trờng hợp
dị hợp tử I2g; chiếm 16,3% số BN.
378 b
p
354 b
p
12
3 4
5
6
7
8
M

13
Tỉ lệ allen đột biến I2g là [(6ì2)+(7ì1)]/(43ì2) = 22,1%.
Các nghiên cứu khác nhau cho thấy I2g là một trong những kiểu
đột biến gen CYP21 thờng gặp và là đột biến điểm thờng gặp nhất
của gen CYP21 gây bệnh TSTTBS cổ điển.
Tại Việt Nam, nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên phát hiện đột

biến điểm I2g. Trên thế giới, đột biến này đã đợc tìm thấy từ năm 1988
bởi Higashi và cộng sự (cs).
Nhiều tác giả phát hiện đột biến điểm I2g với tỉ lệ tơng tự kết quả
của chúng tôi, theo Bachega và cs ở Brazil, tỉ lệ I2g là 20,6%. Hay
Tukel và cs ở Thổ Nhĩ Kỳ, là 22,5%. Tại Tây Ban Nha là 20%.
2.2. Mất đoạn 8bp ở exon 3 (

8bp)





Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi A1/A2 trên thạch
agarose/nu-sieve.
. Cột 2, 5, 8 chỉ hiển thị 1 băng ADN 150 bp, tức đồng hợp tử

8bp
. Cột 1, 3, 6, 10, 11, 12 hiển thị cả 2 băng ADN 158 bp và 150 bp với
đậm độ đồng nhất, tơng ứng cá thể không bị đột biến

8bp;
. Cột 4, 7, 9 nghi ngờ dị hợp tử

8bp do đậm độ băng ADN 158 bp
giảm so với băng 150 bp. M-marker ADN 174/Hae III.
Với phơng thức này, phát hiện 9 trờng hợp đồng hợp tử đột biến
mất đoạn 8bp; chiếm 20,9% số BN nghiên cứu.
Đối với những trờng hợp nghi ngờ dị hợp tử mất đoạn 8bp, chúng
tôi kiểm tra mẫu ADN khuôn bằng cách thực hiện phản ứng nested-

PCR sử dụng 2 cặp mồi P1/P2 và P9/P10.

158 b
p

150 b
p

1 2
3 4
5
6
7
10 12
11
8
9
M

14




Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR với 2 cặp mồi
P1/P2 và P9/P10 trên thạch agarose 3%.
. Cột 3, 5 chỉ có 1 băng ADN 81 bp, tức đồng hợp tử đột biến mất đoạn 8bp.
. Cột 2, 7 chỉ có 1 băng ADN 89 bp - không bị đột biến.
. Cột 1, 4, 6, 8 hiển thị cả 2 băng ADN kích thớc 81 bp và 89 bp, tơng ứng
với cá thể dị hợp tử đột biến mất đoạn 8bp. Marker pUC18/DpuI.

Bằng phơng thức bổ sung này, phát hiện thêm 6 trờng hợp dị hợp
tử mất đoạn 8bp, chiếm 13,9% tổng số 43 BN.
Nh vậy, tỉ lệ allen mất đoạn 8bp là [(9ì2)+(6ì1)]/(43ì2) = 27,9%.
Tỉ lệ này cao hơn hẳn kết quả nghiên cứu ở một số quốc gia. Hầu
hết các tác giả đều nhận thấy đột biến mất đoạn 8bp rất ít gặp so với
các đột biến khác. Thậm chí Kharrat ở Tunisie hay Baumgartner ở áo
đã không tìm thấy mất đoạn 8bp gây thiếu 21-OH.
Một nghiên cứu ban đầu ở miền Bắc cũng cho thấy tỉ lệ cao đột biến
mất đoạn 8bp tơng tự chúng tôi (31,9%). Nên có lẽ đây là kiểu đột
biến gen CYP21 phổ biến nhất gây TSTTBS thiếu 21-OH ở Việt Nam.
Chúng tôi cha thể giải thích vì sao mất đoạn 8bp xảy ra với tỉ lệ cao
nh thế. Một số tác giả cho rằng việc chọn mẫu BN sẽ ảnh hởng đến tỉ lệ
đột biến gen. Ngoài ra, còn do yếu tố quần thể, mỗi dân tộc, mỗi quốc gia
mang một tỉ lệ bệnh TSTTBS và tỉ lệ các đột biến gen CYP21 khác nhau.
Trình tự nucleotide của mất đoạn 8bp (707-714 GAGACTAC) cũng
đã đợc phân tích bằng máy đọc tự động ABI 377, kết quả nh sau:

89 b
p

81 b
p

1 2
3 4
5
6
7
8
M

15
2.3. Đột biến dị hợp tử kép I2g kèm mất đoạn 8bp (I2g+

8bp)
Phát hiện 5 trờng hợp có kiểu gen dị hợp tử kép I2g+8bp, chiếm
tỉ lệ 11,6% tổng số 43 BN.
Cũng nh đột biến I2g, đây là lần đầu tiên kiểu gen dị hợp tử kép
I2g+8bp đợc phát hiện ở BN TSTTBS thiếu 21-OH tại Việt Nam.
Kiểu gen I2g+8bp này đã đợc các nghiên cứu khác nhau trên
thế giới ghi nhận nh Koyama, Bachega.
Chúng tôi cha thể xác định những đột biến I2g và mất đoạn 8bp
nằm trên cùng 1 hay 2 allen khác nhau vì cha thể xác định allen mang
gen của bố mẹ. Điều này rất quan trọng trong việc nghiên cứu kiểu gen
CYP21 gây bệnh TSTTBS và sự di truyền gen bệnh.
2.4. Đột biến Pro30Leu ở exon 1





Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi B1/B2.
. Cột 7 hiển thị cả hai băng ADN kích thớc 196 bp và 153 bp, tơng
ứng cá thể dị hợp tử đột biến Pro30Leu.
. Các cột 1-6, 8-10 chỉ có 1 băng ADN kích thớc 153 bp tơng ứng với
cá thể không có đột biến này. M-marker ADN 174/HaeIII.

Chỉ phát hiện duy nhất 1 trờng hợp dị hợp tử đột biến Pro30Leu;
chiếm tỉ lệ 2,3% tổng số 43 BN nghiên cứu. Đây cũng là lần đầu tiên
tại Việt Nam đột biến Pro30Leu đợc tìm thấy.

Tỉ lệ allen đột biến Pro30Leu là (1ì1)/(43ì2) = 1/86 = 1,2%.
Nghiên cứu TSTTBS thể cổ điển tại Nhật Bản, Koyama nhận thấy tỉ
lệ allen đột biến Pro30Leu là 1,1%, hay theo Lobato ở Tây Ban Nha là
0,8%. Các tỉ lệ này cũng tơng tự kết quả của chúng tôi.

196 b
p

153 b
p

1 2
3 4
5

6
7
10
9
M
8

16
Đột biến Pro30Leu tạo nên enzym 21-OH với hoạt tính 30-60%
bình thờng nên biểu hiện lâm sàng nhẹ nhàng. Điều này giúp giải
thích một phần vì sao Pro30Leu ít gặp ở BN thể cổ điển.
2.5. Các đột biến khác cha đợc xác định
Trong nghiên cứu này, tỉ lệ BN cha đợc phát hiện đột biến gen
CYP21 còn cao, 44,2%. Lý do là chúng tôi chỉ mới tiến hành phản ứng
PCR với những cặp mồi tơng ứng với các đột biến đã đợc phát hiện.

Đến nay, khoảng 100 kiểu đột biến gen CYP21 đã đợc tìm thấy và
hầu hết là đột biến điểm. Mất đoạn nhỏ, đột biến chèn nucleotide cũng
đã đợc báo cáo. 10-15 kiểu đột biến thờng gặp chiếm 90-95% các
allen, các đột biến này xuất phát từ việc tái tổ hợp tơng tác gen của
các trình tự ADN giữa CYP21 và CYP21P, trong khi các đột biến còn
lại (5-10% các allen) là những đột biến tự nhiên.
Bachega và cs vẫn gặp một tỉ lệ lớn 20% các allen không thể xác
định kiểu gen đột biến dù đã sàng lọc đợc 17 kiểu đột biến gen
CYP21 thờng gặp, điều này gợi ý BN mang đột biến mới cha rõ.
3. Kiểu gen và kiểu hình của các đột biến gen CYP21
Bảng 3.8. Kiểu gen và kiểu hình của các đột biến gen CYP21
Kiểu hình
Kiểu gen
MM NHĐT Tổng số
ĐHT 3 1 4
I2g đơn thuần
DHT
4

4
ĐHT I2g + ĐHT 8bp
1

1
ĐHT I2g + DHT 8bp
1
1
Kiểu dị hợp tử
kép I2g+8bp
DHT I2g + DHT 8bp

2 1
3
ĐHT 7 1 8
8bp đơn thuần
DHT 1 1 2
Pro30Leu DHT
1

1
Đột biến khác
Cha rõ kiểu gen
12
7 19
Tổng số

31 12
43
(ĐHT: đồng hợp tử, DHT: dị hợp tử,

: mất đoạn gen).

17
- Bảng 3.8 cho thấy có 7/8 trờng hợp đột biến I2g và 8/10 trờng
hợp mất đoạn 8bp có kiểu hình MM, tức hầu hết các đột biến gen I2g
và mất đoạn 8bp (nhóm A) liên quan với thể MM. Kết quả này phù
hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả nh White, Speiser, Wedell,
Wilson Mất đoạn 8bp và I2g là những kiểu đột biến gen CYP21 trầm
trọng gây mất hoạt tính enzym 21-OH, bệnh cảnh MM.
- Chúng tôi gặp 2 trờng hợp mất đoạn 8bp và 1 trờng hợp I2g có
kiểu hình NHĐT, không phù hợp với dự đoán từ kiểu gen bị đột biến

trầm trọng.
Đặc điểm kiểu hình không phù hợp với kiểu gen cũng đợc mô tả.
Laué và Rennert cho rằng trong mỗi nhóm kiểu gen A, B, C, vẫn có
những BN có kiểu hình nhẹ hơn hoặc nặng hơn dự đoán. Chính xác
MM là 85% ở nhóm A, 72% NHĐT ở nhóm B và 63% KCĐ ở nhóm
C. Theo Krone lần lợt là 90%, 74% và 64,7%. Vì vậy, liên quan kiểu
gen kiểu hình là không tuyệt đối trong tất cả các trờng hợp, nghiên
cứu sâu hơn sẽ giúp nhận biết chính xác hơn điều này.
Bảng 3.9. Đặc điểm lâm sàng thể MM của các đột biến gen CYP21
I2g
I2g + 8bp 8bp
Kiểu gen

Lâm sàng
ĐHT
3 nam
DHT
3 nam
1 nữ
(A)
1 nam
(C)
1 nam
1 nữ
ĐHT
5 nam
2 nữ
DHT
1 nữ
P30L

DHT
1 nữ
Khác
5 nam
7 nữ

Tổng
n=31
18 nam
13 nữ

Phì đại DV 1 3 - - 3 - - 2 9
Bìu thâm 2 3 1 - 2 - - 5 13
Phì đại ÂV - 1 - 1 2 1 1 6 12
Týp Prader - III - III IV IV IV II-IV II-IV
Nôn 3 3 1 2 7 1 1 12 30
Bỏ bú - - 1 - 2 - - 3 6
Tiêu chảy 3 2 - - 2 1 - 4 12
Mất nớc 2 3 - 2 6 1 1 12 27
Giảm cân 1 2 - 1 1 - 1 2 8
Xạm da 3 3 1 1 5 1 1 11 26

18
Hình 3.11.A. BN nữ Nguyễn Thế Nh. (MSBA 223460), thể MM.
Biểu hiện suy thợng thận cấp, mất nớc, giảm thể tích tuần hoàn. Bộ
phận sinh dục nữ bất thờng, nam hoá và phì đại âm vật.
Bảng 3.11. Đặc điểm lâm sàng thể NHĐT của các đột biến gen CYP21
I2g + 8bp 8bp
Kiểu gen
Lâm sàng

I2g
ĐHT
1 nữ
(B)
1 nam
(C)
1 nữ
ĐHT
1 nữ
DHT
1 nữ
Khác
1 nam
6 nữ
Tổng
(n=12)
Phì đại DV - - - - - - -
Thâm bìu - 1 - - 1 1 3
Phì đại ÂV 1 - 1 1 1 6 10
Phân loại Prader III - III IV IV II-IV II-IV
Xạm da 1 - 1 1 1 6 10
Tăng chiều cao 1 1 1 - 1 5 9
Dậy thì sớm - - - - 2 2
Tăng tuổi xơng 1 - - 1 1 4 7

19
Hình 3.12. BN Phạm Thị H (MSHS 260099), thể NHĐT. Phát
triển thể lực và cơ bắp. Xuất hiện dấu hiệu dậy thì sớm, tuyến vú B2,
mọc lông mu P3, âm vật giống dơng vật, không có tinh hoàn.
- So sánh các biểu hiện lâm sàng, chúng tôi nhận thấy BN nữ ở cả 2
thể MM và NHĐT biểu hiện mức độ phì đại âm vật nặng hơn khi có
kiểu gen đột biến mất đoạn 8bp (Prader týp IV) và nhẹ hơn (Prader týp
III) khi có kiểu gen đột biến I2g hoặc I2g+8bp. Điều này cho thấy
rằng mất đoạn 8bp có lẽ là đột biến trầm trọng nhất.
Pinto, Torres và cs cũng nhận thấy thể bệnh và mức độ nam hoá bộ
phận sinh dục ngoài có liên quan với độ trầm trọng của đột biến gen.
Bảng 3.13. Biến đổi điện giải đồ của các kiểu đột biến gen CYP21
Xét nghiệm
Kiểu gen
Natri
(mmol/l)
Kali (mmol/l) Clo (mmol/l)
Đờng
(mmol/l)
I2g (n=8)
117,6 15,2 6,6 1,3 92,9 12,6 3,8 0,7
8bp (n=10)
120,2 14,5 6,5 1,6 95,7 8,7 5,7 0,8
I2g + 8bp (n=5)
129,6 10,9 5,3 1,3 97,6 8,4 4,6 1,8

Bảng 3.15. Biến đổi hormon của các đột biến gen CYP21
Hormon
Kiểu gen
Progest

(nmol/l)
Testost
(nmol/l)
17-CS
*

(mol/24g)
17-OHCS
*

(mol/24g)
Cortisol
(nmol/l)
I2g (n=8)
84,5 16,4 26,7 12,1 -
8bp (n=10)
40,0 4,0 19,1 10,6 -
I2g+8bp (n=5)
109,8 7,1 38,3 - 397,3
(Progest = progesteron, Testost = testosteron)
- Về biểu hiện cận lâm sàng, các đột biến I2g, mất đoạn 8bp và
I2g+8bp gây rối loạn điện giải với natri máu giảm thấp và kali máu
tăng cao (Bảng 3.13). Nồng độ các hormon testosteron, progesteron
máu và 17-CS, 17-OHCS nớc tiểu tăng cao (Bảng 3.15). Tuy nhiên,
mức độ rối loạn điện giải và hormon là tơng đơng giữa các nhóm
đột biến gen nói trên, p > 0,05.

20
Đối với từng đột biến điểm I2g hay mất đoạn 8bp, biến đổi điện
giải đồ và hormon cũng không khác biệt giữa các kiểu gen đồng hợp tử

hay dị hợp tử, p > 0,05.
- 5 trờng hợp dị hợp tử kép I2g+8bp có kiểu hình cả MM và
NHĐT. Kiểu gen I2g+8bp gây TSTTBS thể MM đã đợc mô tả bởi
Dain, Torres và cs. Ngợc lại, Tukel, Wilson đã phát hiện kiểu gen
I2g+8bp gây bệnh cảnh NHĐT. Nh vậy, kết quả nghiên cứu của
chúng tôi là hoàn toàn phù hợp.
Speiser cho rằng BN dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau thờng có
kiểu hình tơng ứng với kiểu gen bị đột biến ít trầm trọng hơn. Điều
này nói lên rằng dị hợp tử kép I2g+8bp có thể gây bệnh cảnh MM
hay NHĐT tùy thuộc vào hoạt tính enzym 21-OH đợc tổng hợp.
- Một BN đợc phát hiện dị hợp tử đột biến Pro30Leu có kiểu hình
MM. Về mặt lý thuyết, đột biến Pro30Leu vẫn duy trì một phần hoạt
tính enzym và gây bệnh cảnh TSTTBS thể KCĐ. ở đây, Pro30Leu gây
bệnh cảnh MM nên cũng khó lý giải một cách thật rõ ràng liên quan
kiểu gen kiểu hình.
Tác giả Dolzan, Weintrob đã tìm thấy kiểu gen Pro30Leu ở thể
NHĐT và KCĐ. Kharrat tìm thấy kiểu gen Pro30Leu+I2g ở thể MM.
4. Tình hình mang gen bệnh của một số thành viên gia đình
bệnh nhân TSTTBS
Gia đình số 1:




Hình 3.14. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 1.
I/
II/
II-9
II-8
(I2g+

8bp)
ĐHT (I2g+8bp)
(

)

21
Bệnh nhân Nguyễn Văn Th, kiểu gen đồng hợp tử I2g kết hợp đồng
hợp tử mất đoạn 8bp, kiểu hình MM. Bố không phát hiện mang gen.
Mẹ mang gen bệnh I2g kèm 8bp.
Gia đình số 4:




Hình 3.17. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 4.
Bệnh nhân Dơng Quốc H, kiểu gen đồng hợp tử I2g kèm dị hợp tử
mất đoạn 8bp, kiểu hình NHĐT. Chị gái mắc bệnh thể NHĐT, không
thực hiện đợc phản ứng PCR. Bố bình thờng không mang gen đột
biến, mẹ mang gen I2g khi thực hiện PCR với cặp mồi P1/P2 và P7/P8.
Theo quy luật di truyền lặn, nhiễm sắc thể thờng thì trong 2
trờng hợp 1 và 4, lẽ ra các ông bố mang kiểu gen dị hợp tử kép
I2g+8bp trên cùng 1 allen phải đợc tìm thấy.
Phân tích kiểu gen của BN thiếu 21-OH và tình trạng mang gen của
bố mẹ, Tajima và cs đã phát hiện con đồng hợp tử I2g, mẹ mang gen
I2g, còn bố đồng hợp tử bình thờng hoặc con dị hợp tử I2g và bố mẹ
đều đồng hợp tử bình thờng. Tác giả gợi ý rằng đột biến mới có thể
xảy ra trên các allen nhận từ bố mẹ và phân tích trực tiếp trình tự
nucleotide gen CYP21 đã khẳng định.

Gia đình số 2:




Hình 3.15. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 2.
II-1
II/
I/
II-2

8bp
DHT I2
g

ĐHT 8bp
(I2g+8bp)
I/
II-1
II/
II-3
II-2
ĐHT I2g + 8bp
(

)
I2
g

22
Bệnh nhân Ngô Minh Q, dị hợp tử I2g, kiểu hình MM. Anh trai
Ngô Đức M, đồng hợp tử mất đoạn 8bp, kiểu hình MM. Bố mang gen
bệnh I2g kèm mất đoạn 8bp. Mẹ mang gen bệnh mất đoạn 8bp.
Chứng tỏ anh trai nhận cả 2 allen mất đoạn 8bp, một từ bố và một
từ mẹ; còn em trai chỉ nhận allen I2g từ bố. Trờng hợp này bệnh rõ
ràng phù hợp quy luật di truyền lặn nhiễm sắc thể thờng. Tuy nhiên,
do anh trai chỉ đợc thực hiện phản ứng PCR đối với mất đoạn 8bp nên
cha thể loại trừ khả năng kèm đột biến I2g truyền từ allen của bố.
Gia đình số 3:




Hình 3.16. Gia hệ và kiểu gen các thành viên gia đình số 3.
BN Trần Thị V, dị hợp tử I2g, kiểu hình MM. Chị gái không mắc
bệnh và cha xét nghiệm PCR.Bố mang gen bệnh I2g và mẹ không
mang gen bệnh. Chứng tỏ con bị bệnh do nhận allen bệnh từ bố.
Thực hiện chẩn đoán trớc sinh cho 9 gia đình có con mắc bệnh
TSTTBS tại Đài Loan, Lee và cs ghi nhận các trờng hợp bố mẹ mang
các kiểu gen bệnh khác nhau và con chỉ nhận 1 allen từ bố hoặc mẹ,
thậm chí con sinh ra bình thờng (nh bố dị hợp tử mất đoạn gen, mẹ
dị hợp tử I2g, con kiểu gen không mang những đột biến này).
Gia đình số 5:




Hình 3.18. Sơ đồ gia hệ gia đình bệnh nhân Trần Văn T.
II/

I/
II-1 II-2
I2
g

DHT I2
g

(

)
II-1 II-2

I/
II/
(

)
(

)
(

)
(

)
(

)