Phát hiện hai nhóm Escherichia Coli Epec và Eiec gây tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật PCR

Nguyễn Phú Hùng và cs

Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

65(03): 155 - 158

PHÁT HIỆN HAI NHÓM ESCHERICHIA COLI EPEC VÀ EIEC
GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT PCR
Nguyễn Phú Hùng1*, Phạm Thị Nhàn1
Lê Thị Thu Hà1, Lê Thành Công1
Phùng Đắc Cam2
1
Trường Đại học Khoa Học – ĐH Thái Nguyên
2
Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương)

TÓM TẮT
Escherichia coli là tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Đây là đối
tƣợng gây viêm ruột theo nhiều cơ chế khác nhau. Dựa trên cơ sở này, E.coli gây tiêu chảy đƣợc
phân thành các nhóm khác nhau là ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC, mỗi nhóm có một cơ chế
sinh bệnh đặc trƣng. Dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc genome của từng nhóm, trong nghiên
cứu này, chúng tôi đã ứng dụng thành công kĩ thuật PCR với hai cặp mồi đặc hiệu để phát hiện 2
trong số 5 nhóm khác nhau của E.coli gây tiêu chảy từ các chủng chuẩn EPEC và EIEC. Đây là
tiền đề quan trọng để chúng tôi tiến hành tối ƣu hoá và phát triển thành bộ sinh phẩm phát hiện
nhanh tác nhân gây tiêu chảy là E.coli ở ngƣời. Ƣu điểm của kỹ thuật là này cho phép phát hiện
tác nhân gây bệnh với độ đặc hiệu gần nhƣ 100%.
Từ khóa: Tương đồng di truyền, tiêu chảy, PCR, nhiễm trùng bệnh viện, Ecoli.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tiêu chảy là một bệnh phổ biến trên toàn cầu,
đặc biệt là ở các đang phát triển. Việt Nam là

nƣớc nằm trong vùng nhiệt đới, điều kiện vệ
sinh kém, vì vậy bệnh tiêu chảy khá phổ biến.
Theo các nghiên cứu mới đây, bệnh tiêu chảy
ở nƣớc ta đứng thứ nhất trong 10 bệnh phổ
biến nhất và đứng hang thứ tƣ trong 10 bệnh
có tỉ lệ tử vong cao nhất. Trẻ em là đối tƣợng
dễ mắc tiêu chảy nhất, trung bình trẻ dƣới 5
tuổi mỗi năm mắc tiêu chảy 2 – 2,2 lần [2],
[3]. Có nhiều tác nhân sinh học khác nhau dẫn
tới tiêu chảy ở ngƣời nhƣ: tác nhân là virus
(ví dụ: virus rota, virus adeno, virus
Norwalk…), kí sinh trùng (ví dụ: giun tròn,
sán dây, sán lá, các loại đơn bào (protozoa) và
vi khuẩn (Escherichia coli, Shigella, Vibrio
cholera…). Để kiểm soát dịch tiêu chảy, công
tác chẩn đoán, xác định tác nhân gây bệnh giữ
một vai trò đặc biệt quan trọng. Trong số các
tác nhân kể trên, E.coli là đối tƣợng đƣợc
quan tâm và nghiên cứu nhiều. Các E.coli
gây tiêu chảy đƣợc chia làm 5 nhóm là: E.coli
gây bệnh đƣờng ruột(Enteropathology E.coli
*

*

– EPEC); E.coli
sinh độc tố ruột
(Enterotoxigenic E.coli – ETEC); E.coli xâm
nhập ruột (Enteroinvasive E.coli – EIEC),
E.coli

gây
xuất
huyết
ruột
(Enterohaemorrhagic E.coli – EHEC) và
E.coli
bám
dính
đƣờng
ruột
(Enteroaggregative E.coli – EAEC). Hiện đã
có nhiều công trình nghiên cứu về chẩn đoán
phân biệt các nhóm E.coli gây bệnh khác
nhau đã đƣợc thực hiện[1], [4],[5], [10]. Trong
báo này, chúng tôi đã tiến hành áp dụng kĩ
thuật PCR đặc hiệu để xác định chính xác hai
nhóm E.coli là EPEC và EIEC trong 5 nhóm
nêu trên. Đây là một phần trong nghiên cứu
của chúng tôi về ứng dụng kỹ thuật PCR để
xác định 5 nhóm E.coli gây tiêu chảy ở ngƣời.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là các chủng E.coli
chuẩn quốc tế do Giáo sƣ Phùng Đắc Cam,
Phòng Vi khuẩn đƣờng ruột - Viện vệ sinh
dịch tễ Trung ƣơng cung cấp.
Hóa chất dùng cho tách chiết DNA tổng số và
các loại hóa chất chuyên dụng dùng cho các
kỹ thuật sinh học phân tử có chất lƣợng tốt,
do các hãng có uy tín cung cấp.

Tel 0914791904, Email:

155

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Nguyễn Phú Hùng và cs

Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

Phương pháp nghiên cứu bao gồm phƣơng
pháp tách chiết DNA tổng số từ các chủng vi
khuẩn làm nguyên liệu cung cấp cho các phản
ứng PCR. Phƣơng pháp khuếch đại gen đích
bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả tách DNA tổng của vi khuẩn E.coli
Từ các chủng E.coli chuẩn quốc tế: EPEC,
EIEC và chủng đối chứng EC đƣợc giữ trong
ống thạch nghiêng, chúng tôi lấy một vài
khuẩn lạc đem nuôi cấy trong môi trƣờng LB
lỏng ở nhiệt độ 370C qua đêm. Dịch nuôi cấy
đƣợc li tâm, thu sinh khối để tiến hành tách
chiết và tinh sạch DNA tổng số. E.coli là vi
khuẩn gram âm, do đó trong nghiên cứu này
chúng tôi đã tiến hành tách chiết theo phƣơng

pháp của Sambrock và cộng sự. DNA thu
đƣợc trong quá trình tách chiết đƣợc kiểm tra
bằng phƣơng pháp điện di và phƣơng pháp đo
mật độ quang bằng máy quang phổ. Kết quả
điện di DNA tổng số đƣợc trình bày trong
hình 2.1. Từ kết quả điện di cho thấy, các
phân tử DNA thu đƣợc ít bị đứt gãy, có một
băng gọn duy nhất. Các băng xuất hiện với độ
đậm khi nhuộm bằng ethidium bromide đã
chứng tỏ phƣơng pháp tách chiết cho phép thu
đƣợc một lƣợng DNA lớn. Tiếp theo chúng
tôi tiến hành xác định nồng độ DNA bằng
phƣơng pháp quang phổ làm cơ sở để pha
loãng DNA đến nồng độ cuối cùng cho phản
ứng PCR đặc hiệu. Kết quả điện di DNA tổng
số đƣợc trình bày trong hình 1.

Hìnhquả
1. DNA
tổng số
củagen
đối tƣợng
nghiênnhóm
cứu:
Kết
khuếch
đại
đặc hiệu
EPEC
1. Chủng EPEC; 2 Chủng EIEC

Cơ chế gây bệnh của nhóm này liên quan mật
thiết tới khả năng bám dính, khu trú, truyền
tín hiệu vào trong tế bào làm thoái hoá các vi
nhung mao, làm rối loạn quá trình hấp thu

65(03): 155 - 158

nƣớc và điện giải. Sự truyền tín hiệu vào tế
bào do các protein mã hoá bởi các gen eae,
esp B, espA, esp D, sep, esp nằm trên nhiễm
sắc thể quy định. Trong đó protein đƣợc gọi
là intimin có trọng lƣợng phân tử 97 kDa mã
hoá bởi gen eae liên quan tới cơ chế gắn mật
thiết đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế gây
bệnh của nhóm này. Trên cơ sở đó, chúng tôi
đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu gen eae có kí
hiệu và trình tự là:
eae
F:
CACACGAATAAACTGACTAAAATG và
eae
R:
AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT.
Theo lý thuyết thiết kế, cặp mồi này cho
phép khuếch đại một phân đoạn của gen eae
có kích thƣớc 376 cặp nucleotide. Nhiệt độ
bắt cặp mồi là 520C. Sản phẩm của phản ứng
PCR đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp điện
di trên gel agarose 1%.
M

603

1

2

360

310
Hình 2. Sản phẩm khuếch đại gen eae
M. quả
Macker
cắt2,
bằng
Từ kết
điện X
di174
hình
cănHind
cứ III
vào kích
Đối chứng
EC,cho
2. EPEC
thƣớc của 1.macker
chuẩn
thấy phân đoạn

DNA đƣợc khuếch đại bằng cặp mồi eae F và

eae R có kích thƣớc khoảng 370 cặp
nucleotide. Kích thƣớc này phù hợp với tính
toán lý thuyết trong quá trình thiết kế mồi.
Sản phẩm đƣợc nhân lên có tính đặc hiệu cao,
không có sản phẩm phụ. Mặt khác tại đƣờng
chạy số 1, chủng EC đƣợc sử dụng làm đối
chứng âm đã cho kết quả âm tính. Nhƣ vậy,
có thể khẳng định chúng tôi đã khuếch đại
thành công gen eae đặc hiệu cho nhóm EPEC.
Kết quả này của chúng tôi hoàn toàn phù hợp
với các nghiên cứu trƣớc đó [5], [7].
Kết quả khuếch đại gen đặc hiệu nhóm
EIEC

156

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Nguyễn Phú Hùng và cs

Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

65(03): 155 - 158

EIEC gây bệnh bằng cách xâm nhập vào các
tế bào biểu mô đại tràng.
Các gen mã hoá các protein liên quan đến

quá trình xâm nhập nằm trên cả plasmid và
nhiễm sắc thể. Plasmid của nhóm này đƣợc
ký hiệu là pInv có trọng lƣợng phân tử là 140
mDa chứa các gen mxi và ipa mã hoá cho các
protein cần thiết cho quá trình xâm nhập gồm
IpaA, IpaB, IpaC, IpaD, IpaH. Trong nghiên
cứu này chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc cho
nhóm EIEC dựa trên đặc hiệu của nhóm là
IpaH. Trình tự của cặp mồi là:

cộng sự, chúng tôi đã thu đƣợc DNA tổng số
từ các đối tƣợng nghiên cứu với độ tinh sạch
cao, không đứt gãy, phục vụ tốt cho quá trình
PCR. Kết quả PCR đã nhân lên đƣợc hai băng
với kích thƣớc khoảng 360 cặp nucleotide đặc
hiệu cho gen eae của nhóm EPEC và phân
đoạn thứ hai có kích thƣớc khoảng 620 cặp
nucleotide đặc hiệu cho gen ipH của nhóm
EPEC. Kết quả này là tiền đề quan trọng để
chúng tôi tiến hành nghiên cứu, tạo bộ sinh
phẩm chẩn đoán E.coli gây tiêu chảy trong
nghiên cứu tiếp theo.

IpaH F: GTT CCT TGA CCG CCT TTC CGA
TAC CGT C và IpaH R: GCC GGT CAG CCA
CCC TCT GAG AGT AC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

M 1 2

873
603

620

Hình 3. Sản phẩm khuếch đại gen ipaH
M. Macker X 174 cắt bằng Hind III
1. Đối chứng EC
2. EPEC

Phân tích hình ảnh điện di sản sản phẩm PCR
(hình 3) cho thấy, mẫu đối chứng âm (EC) đã
không có sản phẩm đƣợc khuếch đại với cặp
mồi ipHF và ipHR mà chúng tôi thiết kế đặc
hiệu cho nhóm EIEC. Tuy nhiên, tại đƣờng
chạy số 2 của mẫu chuẩn EIEC, chúng tôi đã
nhận đƣợc kết quả dƣơng tính, đã có một
băng DNA duy nhất với kích thƣớc khoảng
620 cặp nucleotit, tƣơng ứng với kích thƣớc
lý thuyết khi thiết mồi. Có thể khẳng định kết
quả của chúng tôi thu đƣợc là hoàn toàn phù
hợp với nhiều công bố của các tác giả khác
trên thế giới [4], [8], [9].
KẾT LUẬN
Bằng phƣơng pháp tách DNA tổng số trên đối
tƣợng vi khuẩn gram âm của Sambrock và

[1].Adrienne W. Paton and James C. Paton (1998),
“Detection and Characterization of Shiga Toxigenic

Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays
for stx1, stx2, eaeA, Enterohemorrhagic E. coli
hlyA, rfbO111, and rfbO157”, J Clin Microbiol,
Vol. 36, Pp: 598-602.
[2].Phùng Đắc Cam (2009), Bệnh tiêu chảy, Nxb
Y học.
[3].Hoàng Thủy Long (2007), Kỹ thuật xét nghiệm
vi sinh vật y học, Nxb Văn hoá.
[4].Jaims P. Natoro, Jaims B. Kaper (1998),
“Diarrheagenic Escherichia coli” Cnilical
Microbiology Review, Vol. 11, No. 1. Pp 142–201.
[5].Hornitzky MA, Bettelheim KA, Djordjevic SP
(2001), “The detection of Shiga toxin-producing
Escherichia coli in diagnostic bovine faecal
samples using vancomycin-cefixime-cefsulodin
blood agar and PCR”, FEMS Microbiol Lett, Vol.
198, No. 1, Pp 17 – 22.
[6].Seker E, Kuyucuoğlu Y, Sareyyüpoğlu B,
Yardımcı H (2009), “PCR Detection of Shiga
Toxins, Enterohaemolysin and Intimin Virulence
Genes of Escherichia coli O157:H7 Strains
Isolated from Faeces of Anatolian Water Buffaloes
in Turkey”, Zoonoses Public Health.
[7]. Ooka T, Terajima J, Kusumoto M, Iguchi A,
Kurokawa K, Ogura Y, Asadulghani M,
Nakayama K, Murase K, Ohnishi M, Iyoda S,
Watanabe H, Hayashi T (2009), “Development of
a multiplex PCR-based rapid typing method for
enterohemorrhagic Escherichia coli O157
strains”, J Clin Microbiol, Vol. 47, No.9, Pp,

2888-2894.

157

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Nguyễn Phú Hùng và cs

Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ

[8]. S Stacy-Phipps, JJ Mecca and JB Weiss
(1995), “Multiplex PCR assay and simple
preparation method for stool specimens detect
enterotoxigenic Escherichia coli DNA during
course of infection” J Clin Microbiol, Vol. 33, No.
5, 1054-1059
[9]. Pina M. Fratamico, Connie E. Briggs,
Danielle Needle, Chin-Yi Chen, and Chitrita
DebRoy (2003), “Sequence of the Escherichia coli
O121 O-Antigen Gene Cluster and Detection of

65(03): 155 - 158

Enterohemorrhagic E. coli O121 by PCR
Amplification of the wzx and wzy Genes” J Clin
Microbiol, Vol. 41, Pp: 3379-3383.
[10]. Sensitivities and Specificities of Premier

(1998), “E. coli O157 and Premier EHEC Enzyme
Immunoassays for Diagnosis of Infection with
Verotoxin
(Shiga-Like
Toxin)-Producing
Escherichia coli”, J Clin Microbiol. Vol. 36, Pp:
1608-1611.

DETECTION OF TWO GROUP OF DIARRHEAGENIC ESCHERICHIA COLI
IN HUMAN EPEC AND EIEC BY PCR TECHNIQUE
Nguyen Phu Hung12, Pham Thi Nhan1,
Le Thi Thu Ha1, Le Thanh Cong1
1
College of Science – Thai Nguyen University
Phung Dac Cam2
2
National Institute of hygiene and epidemiology2

SUMMARY
Escherichia coli is an underestimated diarrheal pathogen in almost countries in the wold. This
organism may cause gastroenteritis by many different mechanisms, and on the basis of this,
diarrheagenic E. coli has been subdivided into different groups are ETEC, EHEC, EIEC, EPEC,
EAEC. Each of groups has a special pathogenic mechanisms. On the basis of genomic structure of
these every strains, in this this study, has been applied successfully PCR technique with two pairs
of primers to detect 2 of 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli are EPEC and EIEC
from standar samples. This is important prime to deverloping diagnosistic technique for
diarrheagenic E. coli. The advantages of this technique are that it allows to screen and diagnose
these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100%.
Key words:E.coli, PCR, diarohea hopitol Infections, Genetic Similarity

2

Tel 0914791904, Email:

158

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên