Sàng lọc và xây dựng quy trình định lượng polyphenol từ một số dược liệu hướng tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

SÀNG LỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
POLYPHENOL TỪ MỘT SỐ DƢỢC LIỆU HƢỚNG TÁC DỤNG
CHỐNG OXY HOÁ, BẢO VỆ GAN
Huỳnh Thị Như Thuý*, Nguyễn Hữu Lạc Thuỷ*, Võ Thị Bạch Huệ*

TÓM TẮT
Mở đầu – mục tiêu: Ngày nay, các chứng bệnh về gan đang trở thành một trong số bệnh phổ biến và có
nguy cơ tử vong cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Nh}n d}n thường dùng thuốc có tác dụng bảo vệ gan
chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật. Y học hiện đại sử dụng dưới dạng cao chiết toàn phần hay hoạt chất tinh khiết.
Hiện nay, một trong những hướng phát triển là chứng minh tác dụng của cao toàn phần, cao ph}n đoạn và hoạt
chất tinh khiết của dược liệu bằng những mô hình thử nghiệm với các trang thiết bị hiện đại để có kết luận
khoa học. Nghiên cứu này nhằm góp phần tìm ra dược liệu, hoạt chất có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan làm
cơ sở nghiên cứu thuốc có tác dụng hỗ trợ, bảo vệ gan.
Đối tượng nghiên cứu: 50 mẫu nguyên liệu được thu mua ở nhà thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp Hồ Chí
Minh.
Phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro của 50 dược liệu bằng phương ph{p đo
quang phổ với phép thử DPPH. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol trong c{c dược liệu
tiềm năng bằng phương ph{p đo quang với thuốc thử Folin - Ciocalteu. Thử tác dụng bảo vệ gan in vivo theo
hướng chống oxy hóa của dược liệu tiềm năng trên mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid.
Kết quả: Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá. Đã s|ng lọc được 5/50 dược liệu có hoạt tính chống oxy
hoá, ức chế trên 85% ở cùng nồng độ 60 g/ml: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc, Kim ngân hoa. Chọn dung
môi có khả năng chiết cao toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá tốt nhất: Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Trâm mốc:
cồn 70%; Kim ngân hoa: cồn 50%. X{c định IC50 của các cao toàn phần. Xây dựng và thẩm định quy trình định
lượng polyphenol. Với phương ph{p quang phổ UV - Vis dùng thuốc thử Folin - Ciocalteu, quy trình đã được
thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 0,0141x + 0,0267, R2 = 1,00 với khoảng nồng độ khảo sát 10,0 – 60,0
(μg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,7 %) v| độ đúng (tỉ lệ phục hồi 99,86%).
Mẫu thử

Cao cồn 70%
Cao cồn 70%
Cao cồn 70%
Cao cồn 50%
Cao cồn 70%

Cốt khí củ
Hậu phác
Trâm mốc
Kim ngân hoa
Hòe

Polyphenol (%)
10,09
9,34
9,20
7,93
7,29

IC50 (µg/ml)
30,67
33,20
85,54
162,39
118,48

Thử tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa in vivo. Cao cồn 70% Cốt khí củ có tác dụng bảo vệ gan
ở liều 0,9 v| 1,8 g/kg (tương đương 6,11 g v| 12,22 g dược liệu khô/kg).
Kết luận: Cao cồn 70% Cốt khí củ là cao chiết có tác dụng chống oxy hóa tốt nhất trong 50 mẫu nguyên liệu
(tương đương 200 mẫu cao), đồng thời có tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan in vivo.

Từ khóa: cốt khí củ, sàng lọc, DPPH, Folin–Ciocalteu, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, cyclophosphamid

*Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy
ĐT: 091.551.7890

Chuyên Đề Dƣợc

Email:

221


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

ABSTRACT
SCREENING AND DETERMINATION OF POLYPHENOL OF MEDICAL PLANTS
ON ANTIOXIDANT ACTIVITIES, HEPATOPROTECTIVE EFFECT
Huynh Thi Nhu Thuy, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:221 - 228
Background – Objectives: Nowadays, hepatitis is becoming one of the common, high risk of death deseases
in Viet Nam and around the world. People often use medical plants to protect liver. Morden medicine use extract,
pure subtances. Demonstrating the effect of extracts, pure subtances by test methods and modern equipments is
currently a development trend. The aim of the present study was to indicate more antioxidant, hepatoprotective
medical plants, constituents. That will be the basis for hepatoprotective drug studies.
Materials: 50 antioxidant medical plants were purchased in Pharmacy of traditional medicines, in District
5, Ho Chi Minh city.
Methods: UV–visible spectroscopy method with DPPH for screening of 50 medical plants on antioxidant

activities. Determination and validation of Folin-Ciocalteu for the determinatin of polyphenol content in
antioxidant medical plants. In vivo, hepatoprotective effect was evaluated in mice induced liver damage by
cyclophosphamid.
Results: Screening in vitro of herbal plant on antioxidant activities. The best results were obtained for 5/50
antioxidant medical plants which inhibit over 85% at the same concentration - 60 g/ml: Polygonum cuspidatum
Sieb. et Zucc. Polygonaceae (1), Magnolia officinalis Rehd. et Wils Magnoliaceae (2), Styphnolobium japonicum
L. Fabaceae (3), Lonicera japonica Thunb. Caprifoliaceae (4), Syzygium cumini L. Myrtaceae (5). Ethanol 70% is
the best solvent for strongest antioxidant properties: (1), (2), (3), (5), 50% ethanol is the best for (4). Determinate
IC50 of whole extracts. Determination and validation for the determinatin of polyphenol content. The determinatin
of polyphenol content by Folin-Ciocalteu was validated specificity, showed linearity range (10.0– 60.0 g/mL; ŷ =
0.0141x + 0.0267, R2 = 1.00), repeatability with RSD = 2.7 % and accuracy with recovery ratio 99,86 %.
Samples
70% ethanol extract (1)
70% ethanol extract (2)
70% ethanol extract (5)
50% ethanol extract (4)
70% ethanol extract (3)

Polyphenol(%)
10.09
9.34
9.20
7.93
7.29

IC50 (µg/ml)
30.67
33.20
85.54
162.39

118.48

In vivo hepatoprotective effect. 70% ethanol extract (1) has hepatoprotective effect at dose 0.9; 1.8 g/kg
(equivalent to 6.11 g; 12.22 g dried herb/kg).
Conclusions: The highest antioxidant activities, hepatoprotective effect in 50 medical plants (200 extracts) is
70% ethanol extract of Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. Polygonaceae.
Keywords: Polygonum cuspidatum, screening, DPPH, Folin – Ciocalteu, antioxidant activity.
đến sự rối loạn và mất cân bằng của các quá
ĐẶT VẤN ĐỀ
trình sinh hóa và là nguyên nhân chính gây nên
Gốc tự do là một t{c nh}n độc hại gây ra
các bệnh Do đó, việc tìm ra những hợp chất
nhiều bệnh nhƣ bệnh về đƣờng tim mạch, các
chống oxy hóa có khả năng ức chế các gốc tự do
bệnh về g n, ung thƣ Về mặt hóa học, gốc tự do
hoặc ức chế các quá trình gián tiếp sinh ra gốc tự
rất kém bền nên dễ dàng tham gia vào nhiều
do l| điều cần thiết(3)
phản ứng hóa học với các hợp chất nhƣ protein,
lipid, c rbohydr t, < trong cơ thể Điều này dẫn

222

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Ngày nay, các chứng bệnh về g n đ ng trở
thành một trong số bệnh phổ biến v| có nguy cơ
tử vong cao ở Việt N m cũng nhƣ trên thế giới.

Hiện nay, một trong những hƣớng phát triển là
chứng minh tác dụng của cao toàn phần, cao
ph}n đoạn và hoạt chất tinh khiết củ dƣợc liệu
bằng những mô hình thử nghiệm với các trang
thiết bị hiện đại để có kết luận khoa học.
Mục tiêu củ đề tài là: sàng lọc một số dƣợc
liệu có tính chống oxy hoá in vitro, xây dựng và
thẩm định quy trình định lƣợng polyphenol
trong các cao chiết tiềm năng nhằm chọn r dƣợc
liệu có tác dụng chống oxy hoá tốt nhất, thử tác
dụng bảo vệ gan in vivo của cao chiết tiềm năng

ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
50 mẫu nguyên liệu đƣợc thu mua ở nhà
thuốc y học cổ truyền, quận 5, Tp HCM.

Thiết bị chính
Hệ thống quang phổ UV - Vis Shimadzu
2550 (Japan), cân phân tích Sartorius Practum
224-1S (0,1 mg; 0,01 mg). Các thiết bị n|y đã
đƣợc hiệu chuẩn theo quy định.
Dung môi - hóa chất
Natri carbonat, sắt (III) clorid (Trung Quốc),
thuốc thử Folin - Ciocalteu, 2,2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH Merck – Đức),
cyclophosphamid, acid tricloroacetic, acid
thiobarbituric Sigma – Aldrich (Mỹ).
Phƣơng pháp nghiên cứu

Sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá

Nghiên cứu Y học

ethyl acetat. Dịch chiết từng ph}n đoạn đƣợc thu
hồi dung m i đến c o đặc, các mẫu cao n-hexan,
cao cloroform và cao ethyl acetat là mẫu thử cho
thử nghiệm sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa.
Thử nghiệm sàng lọc in vitro tác dụng chống oxy hoá
(phép thử DPPH)
Mẫu thử (các mẫu thử cùng nồng độ 60
g/ml): cân 0,15 g lần lƣợt các cao (toàn phần
96%; 70%; 50%; 25% v| c{c c o ph}n đoạn) hòa
t n v| điền đầy bằng meth nol trong bình định
mức 100 ml. Lọc lấy dịch, lấy chính xác 2 ml dịch
lọc n|y cho v|o bình định mức 50 ml, điền đầy
bằng methanol (dịch thử T).
Pha các dung dịch vitamin C ở các nồng độ
1,25; 2,50; 3,75; 5,00; 6,25 µg/ml trong methanol.
Thuốc thử DPPH: DPPH hòa tan trong
methanol nồng độ 0,15 mg/ml (bảo quản ở 4 oC,
tránh ánh sáng).
Phản ứng x{c định hoạt tính chống oxy hóa
Trong bình định mức 10 ml, cho 2 ml thuốc
thử DPPH, 1 ml dung dịch thử nghiệm, điền
meth nol đến vạch Để yên 30 phút, tránh ánh
sáng, quét phổ trong khoảng bƣớc sóng 200 –
800 nm để tìm bƣớc sóng cực đại.
Tiến hành song song với mẫu đối chứng
trong cùng điều kiện nhƣng kh ng có dung dịch
thử.

Mẫu trắng sử dụng l| meth nol X{c định độ
hấp thu tại bƣớc sóng hấp thu cực đại, phần
trăm hoạt tính chống oxy hó S% đƣợc x{c định
theo công thức sau:

Chiết xuất cao toàn phần
Cân 50 g mỗi bột dƣợc liệu, chiết bằng
phƣơng ph{p ngấm kiệt, khảo sát với các dung
môi chiết cồn 96%, 70%, 50% và cồn 25%. Toàn
bộ dịch chiết đƣợc thu hồi dung m i đến cao
đặc. Chọn dung môi chiết và c{c dƣợc liệu cho
kết quả thử nghiệm DPPH cao nhất.
T{ch ph}n đoạn cao toàn phần
Chiết lỏng – lỏng lần lƣợt với 3 dung môi có
độ phân cực tăng dần từ n–hexan, cloroform và

Chuyên Đề Dƣợc

Từ kết quả khảo sát, chọn c{c dƣợc liệu có
hoạt tính chống oxy ho{ c o có %S > 85% để
khảo sát IC50 v| x{c định h|m lƣợng polyphenol.

Xác định IC50 của các mẫu thử và vitamin C
Pha các dung dịch thử nghiệm có nồng độ
tăng dần cho tác dụng với cùng một lƣợng
DPPH X{c định độ hấp thu và xây dựng
phƣơng trình hồi quy tuyến tính X{c định IC50
từ phƣơng trình hồi quy. Giá trị IC50 mẫu thử có

223

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

nồng độ càng thấp, tác dụng loại bỏ gốc tự do
càng mạnh, khả năng chống oxy hóa càng cao.

Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng
polyphenol
Chọn cao toàn phần hoặc c o ph}n đoạn có
hoạt tính chống oxy hóa cao nhất đã khảo sát,
tiến hành xây dựng quy trình định lƣợng
polyphenol bằng phƣơng ph{p qu ng phổ với
thuốc thử FC.
Mẫu đối chiếu
Dung dịch acid gallic 20 µg/ml (ddA).
Mẫu thử
Cân chính xác khoảng 1 g cao cồn 70%
Cốt khí củ cho v|o bình định mức 100 ml,
thêm nƣớc đến vạch, siêu âm ở 50 ± 5 o C
trong 15 phút, lọc lấy dịch lọc. Lấy chính
xác 2 ml dịch lọc cho v|o bình định mức
100 ml điền đến vạch bằng nƣớc cất thu
đƣợc dung dịch thử (T).
Khảo s{t quy trình định lượng polyphenol
Quét phổ mẫu thử và mẫu đối chiếu trong
khoảng bƣớc sóng từ 400 – 800 nm, x{c định cực
đại hấp thu.

Khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối chiếu A, dịch
chiết T với thuốc thử FC
Trong bình định mức 10 ml: cho lần lƣợt X
ml (0,5; 0,8; 1,0; 1,5; 2,0 và 3,0) dung dịch đối
chiếu A (hoặc dung dịch thử T), cố định 1 ml
thuốc thử FC và 5 ml dung dịch natri carbonat
20%. Lắc đều, x{c định độ hấp thu tại bƣớc sóng
cực đại đã khảo sát.

Thẩm định quy trình
Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng
dẫn của ICH(4) bao gồm: tính đặc hiệu, khoảng
tuyến tính, độ chính x{c, độ đúng Quy trình s u
khi đạt yêu cầu thẩm định đƣợc ứng dụng định
lƣợng các mẫu c o dƣợc liệu tiềm năng đã đƣợc
sàng lọc.
Thử tác dụng sinh học trên mô hình in vivo
X{c định độc tính cấp đường uống(1,2)
Số lƣợng chuột thí nghiệm: 10 con, hoặc tuỳ
vào số liều thử nghiệm. Nhiệt độ phòng thử
nghiệm: 29 – 300C. Chuột nhịn đói 12 giờ trƣớc
khi tiến hành thử nghiệm. Cho chuột uống liều
cao cồn 70% Cốt khí củ liều cao nhất qua kim với
thể tích 20 ml/kg. Theo dõi các phản ứng xảy ra
trên chuột trong vòng 72 giờ Đ{nh gi{ dựa vào
phản ứng toàn ứng hay bất ứng (chết hay sống)
của chuột thử nghiệm. Tính tần suất chuột chết ở
các lô khảo sát và tính liều LD50.
Mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid
(CY)(1,2)

Cân chuột trƣớc khi tiêm cyclophosphamid,
khi cho uống mẫu thử v| trƣớc khi định lƣợng
MDA. Thời gian cho uống hằng ngày từ 8 đến 9
giờ sáng, uống liên tục trong 8 ngày. Vào ngày
thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ
tách lấy gan chuột đem định lƣợng MDA.
Bảng 1: Bố trí thí nghiệm
Nhóm
CY (-)

Chọn thể tích dung dịch thử T cho độ hấp thu tại
bƣớc sóng cực đại tƣơng đƣơng với mẫu đối
chiếu A.
Đồng thời khảo s{t độ ổn định của mẫu dung
dịch đối chiếu A, dung dịch thử T tại các thời
điểm 0’, 5’, 10’, 15’, 20’, 25’, 30’, 35’, 40’, 45’, 50’,
55’, 60’
Từ các kết quả khảo sát, viết dự thảo quy
trình và thẩm định theo quy định của ICH.

224

CY (+)

Lô (n=9)

Liều thử nghiệm

Tiêm phúc
mạc CY

Chứng bình
thường
Chứng bệnh lý
Cao cồn 70%
Cốt khí củ
Cao cồn 70%
Cốt khí củ

Nước cất

-

Nước cất
0,9 g cao/kg thể
trọng chuột
1,8 g cao/kg thể
trọng chuột
0,1 g/kg thể trọng
chuột

150 mg/kg

Silymarin

X{c định h|m lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong
gan chuột:
Cách tiến hành
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong
dung dịch đệm KCl 1,15 %, tỷ lệ khối lƣợng gan -

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
thể tích dung dịch KCl (1:9), trong 1 phút ở tốc
độ 13.000 vòng/phút, 0 - 5 oC S u đó, lấy 2 ml
dịch đồng thể cho định lƣợng MDA), bổ sung
dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vừ đủ 3 ml. Ủ
hỗn hợp phản ứng ở 37 oC trong 60 phút và
dừng phản ứng bằng 1 ml acid trichloroacetic
TCA 10% S u đó, đem ly tâm hỗn hợp ở 10.000
vòng/phút trong 10 phút ở 5 oC.
Sau khi ly tâm lấy 2 ml dịch trong cho phản
ứng với 1 ml thiobarbituric acid 0,8% ở 100 oC
trong 15 phút v| đo qu ng ở λ = 532 nm H|m
lƣợng MDA nM/g protein đƣợc tính theo
phƣơng trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn
MDA.

KẾT QUẢ
Kết quả sàng lọc bằng phép thử DPPH tác dụng
chống oxy hoá 50 mẫu dƣợc liệu
13/200 cao chiết có hoạt tính chống oxy hoá
> 85% ở nồng độ 60 g/ml là củ c{c dƣợc liệu:
Hậu phác, Trà, Cốt khí củ, Hòe, Kim ngân hoa,
Diệp hạ châu, Trâm mốc Trong đó, h i dƣợc
liệu Trà và Diệp hạ ch}u đã có nhiều công
trình công bố hoạt tính chống oxy hoá(5,6). Do
đó 5 dƣợc liệu Cốt khí củ, Hậu phác, Hòe, Kim

ngân hoa, Trâm mốc đƣợc chọn cho các
nghiên cứu sàng lọc tiếp theo.
Cồn 70% l| dung m i đƣợc chọn chiết cao
toàn phần c{c dƣợc liệu: Cốt khí củ, Hậu phác,
Hoè, Trâm mốc với tác dụng chống oxy hoá tốt
nhất, cồn 50% đƣợc chọn chiết cao toàn phần của
Kim ngân hoa.
Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hoá bằng phép
thử DPPH các cao phân đoạn và cao toàn phần:
Bảng 2: Kết quả sàng lọc chọn dung môi chiết cao
toàn phần của 5 dược liệu tiềm năng

Chuyên Đề Dƣợc

0,0343
0,0553
0,1400
0,0931

95,1
92,1
80,0
86,7

0,0511
0,2962
0,2094
0,2220

92,7

57,7
70,1
68,3

0,0728
0,3081
0,1568
0,1828

Bảng 3: Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của các
phân đoạn (nồng độ 60 g/ml)
Độ hấp thu (A) và Cốt khí
% ức chế
củ
Cao toàn phần (A)
% ức chế
A cao n–hexan (A)
% ức chế
A cao cloroform
(A)
% ức chế
A cao ethyl acetat
(A)
% ức chế

0,0343
95,1%
0,2941
58,0%

Hậu
phác

Hòe

0,0553 0,1400
92,1% 80,0%
0,5546 0,6687
20,8% 4,5%

Kim
Trâm
ngân
mốc
hoa
0,0931 0,0574
86,7% 91,8%
0,6988 0,3809
0,2% 45,6%

0,3333 0,3851 0,6231 0,6854 0,4586
52,4% 45,0% 11,0% 2,1% 34,5%
0,0602 0,077 0,4796 0,098 0,0735
91,4% 89,0% 31,5% 86,0% 89,5%

Cao toàn phần củ 5 dƣợc liệu dƣợc chọn
đều có hoạt tính chống oxy hoá tốt hơn so với
c{c c o ph}n đoạn Do đó tiếp tục chọn 5 mẫu
cao toàn phần x{c định IC50 và xác định hàm
lƣợng polyphenol trong cao chiết.

Kết quả xác định IC50 của các cao cồn toàn phần
và vitamin C
Kết quả thực nghiệm trên cho thấy cao Cốt
khí củ có IC50 thấp nhất.
Nhóm hợp chất polyphenol trong dƣợc liệu
đã đƣợc các tài liệu chứng minh có liên qu n đến
tác dụng chống oxy hoá. Vì vậy, h|m lƣợng
polyphenol đƣợc khảo s{t để khẳng định thêm
hoạt tính chống oxy hoá.
Chọn cao Cốt khí củ để làm mẫu thử khảo
sát và xây dựng quy trình định lƣợng
polyphenol trong các cao Hậu phác, cao Hòe, cao
Trâm mốc, cao Kim ngân hoa (Hình 1).
Kết quả khảo sát quy trình định lƣợng
polyphenol bằng phƣơng pháp quang phổ với
thuốc thử FC:
Cực đại hấp thu dung dịch đối chiếu acid
gallic là 761,8 nm; dung dịch thử T là 761 nm, vì

Tên mẫu Cao cồn Cao cồn Cao cồn Cao cồn
dược liệu 96%
70%
50%
25%
A S% A S% A
S% A S%
1 Cốt khí củ 0,1477 78,9
2 Hậu phác 0,1919 72,6
3
Hòe

0,2416 65,5
4 Trâm mốc 0,1708 75,6
5 Kim ngân
0,1288 81,6
hoa

Nghiên cứu Y học

89,6
56,0
77,6
73,9

0,1751 75,0 0,0574 91,8 0,0693 90,1

vậy chọn bƣớc sóng 761 nm là cực đại hấp thu
của quy trình.

Kết quả khảo sát tỷ lệ thể tích dung dịch đối
chiếu A, dung dịch thử T với thuốc thử FC
1 ml thuốc thử FC đủ phản ứng với nồng độ
60 µg/ml dung dịch đối chiếu A tƣơng đƣơng 3

225


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

ml); và 1 ml thuốc thử FC phản ứng với nồng độ
600 µg/ml dung dịch thử T, thời gian ổn định sau
10 phút đến 60 phút.
Dự thảo quy trình định lƣợng polyphenol
trong cao cồn 70%:
Thực hiện phản ứng theo bảng 1.

Bảng 4: Pha chế các dung dịch thử nghiệm
Mẫu đối Mẫu
Mẫu trắng
chiếu thử
Dung dịch đối chiếu (ml)
1,0
0,0
0,0
Dung dịch thử (ml)
1,0
1,0
0,0
Thuốc thử FC (ml)
1,0
1,0
1,0
Dung dịch Na2CO3 20% (ml)
5,0
5,0
5,0
Nước cất vừa đủ (ml)
10

150

%S

y = 1,6037x + 0,82

100
R² = 0,997

50
0

0

20

40

60

80

Nồng độ (µg/ml)

Cốt khí củ; y = 1,6037x + 0,82 với R2 = 0,9977; IC50
30,67 µg/ml

Hậu phác; y = 1,4798x + 0,8647 với R2 = 0,9946; IC50
33,20 µg/ml

Trâm mốc; y = 0,5457 + 4,9557 với R2 = 0,996; IC50
85,54 µg/ml

Hòe; y = 0,3757x + 5,4929 với R2 = 0,9988; IC50
118,48 µg/ml

Kim ngân hoa; y = 0,3036x + 0,6976 với R2 = 0,9992;
IC50 162,39 µg/ml

Vitamin C; y = 9,4197x + 1,4061 với R2 = 0,9996; IC50
5,16 µg/ml

Hình 1: Đồ thị tương quan giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của một số mẫu dược liệu khảo sát và chất
đối chiếu vitamin C

226

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Lắc đều, để yên các bình phản ứng trong 15
phút H|m lƣợng P % polyphenol đƣợc tính từ
độ hấp thu của mẫu đối chiếu và mẫu thử tại
bƣớc sóng 761 nm.

và hoạt tính oxy hóa hiệu quả nhất so với 50
dƣợc liệu sàng lọc b n đầu.
Bảng 6: Kết quả định lượng polyphenol trong các cao
toàn phần và IC50 của c{c dược liệu

Mẫu thử
Cao cồn 70% Cốt khí củ
Cao cồn 70% Hậu phác

Mẫu đối chiếu: dung dịch acid gallic:
20 µg/ml.
H|m lƣợng P (%) polyphenol (qui về acid
g llic đƣợc tính theo công thức sau:

AC: độ hấp thu mẫu đối chiếu
AT: độ hấp thu của mẫu thử
m: khối lượng mẫu thử (g)
C%: độ tinh khiết acid gallic (98%)
H%: độ ẩm cao chiết (5,4%)
Kết quả thẩm định quy trình

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu
- Mẫu trắng không có tín hiệu tại bƣớc sóng
cực đại của mẫu đối chiếu và mẫu thử.
- Cực đại hấp thu của mẫu thử λ = 761 nm
tƣơng đƣơng với cực đại hấp thu của mẫu đối
chiếu λ = 761,8 nm
- Khi thêm một lƣợng chất đối chiếu vào
mẫu thử thì độ hấp thu của mẫu thử A761 = 0,3002
tăng lên A761 = 0,4160 so với trƣớc khi thêm chất
đối chiếu.

Cao cồn 70% Trâm mốc

9,20

85,54

7,93
7,29

162,39
118,48

Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan in vivo

Kết quả xác định độc tính cấp đường uống cao
cồn 70% Cốt khí củ
Từ kết quả khảo s{t độc tính cấp đƣờng
uống của cao cồn 70%, tính đƣợc liều tối đ
không gây chết chuột (LD0) là 19,5 g/kg thể trọng
chuột tƣơng đƣơng 132,5 g dƣợc liệu khô). Kiến
nghị liều thử nghiệm là 0,9 g/kg (1/22 LD0 và
tƣơng đƣơng với 6,11 g dƣợc liệu khô/kg thể
trọng chuột) và 1,8 g/kg (1/11 LD0 v| tƣơng
đƣơng với 12,22 g m dƣợc liệu khô/kg thể trọng
chuột).
Kết quả khảo s{t h|m lƣợng malonyl
dialdehyd (MDA) trong gan chuột đƣợc trình
bày ở bảng 7.
Bảng 7: Kết quả khảo s{t h|m lượng MDA trong
gan chuột

Kết quả thẩm định quy trình định lượng
polyphenol

Bảng 5: Kết quả các thử nghiệm theo yêu cầu thẩm
định quy trình

Từ kết quả ở bảng 6, có thể kết luận cao Cốt
khí củ có h|m lƣợng polyphenol cao nhất ≈10%

Chuyên Đề Dƣợc

Nhóm

Lô (n=9)

CY (-)

Chứng sinh lý
Chứng bệnh lý
Cao cồn 70%
Cốt khí củ 0,9 g/kg
Cao cồn 70%
Cốt khí củ 1,8 g/kg
Silymarin 0,1 g/kg

CY (+)

Chỉ tiêu

Kết quả ứng dụng quy trình định lƣợng các
mẫu cao toàn phần

Polyphenol (%) IC50 (µg/ml)

10,09
30,67
9,34
33,20

Cao cồn 50% Kim ngân hoa
Cao cồn 70% Hòe

Kết luận: quy trình đạt độ đặc hiệu.

Kết quả
Phương trình hồi quy ŷ = 0,0141x + 0,0267
Khoảng
2
tuyến tính Hệ số R = 1 (khoảng nồng độ khảo sát 10,0 –
60,0 μg/ml)
Độ lặp lại
RSD% của hàm lượng polyphenol 2,7 %
Độ đúng
Tỷ lệ phục hồi 99,86 %

Nghiên cứu Y học

Hàm lượng MDA
(nM/g protein)
30,576 ± 2,023
**
67,813 ± 2,556
39,842 ± 5,732

#

40,147 ± 2,862

##

33,089 ± 2,864

##

**

P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng
sinh lý. # P < 0,05 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô
chứng bệnh lý. ## P < 0,001 khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so
với lô chứng bệnh lý.

Mẫu thử nghiệm đƣợc cho uống ở liều 0,9 và
1,8 g/kg thể trọng chuột trong 8 ngày trên chuột
bị gây tổn thƣơng g n bằng cyclophosphamid
thể hiện tác dụng bảo vệ g n theo hƣớng chống
oxy hóa. Cụ thể, h|m lƣợng MDA ở lô chuột

227


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

uống liều 0,9 và 1,8 g/kg giảm lần lƣợt là: 41,2%;
40,8% so với l đối chiếu silym rin, h|m lƣợng
MDA ở lô này giảm 51,2%.

BÀN LUẬN
Bằng phương pháp quang phổ với thuốc
thử DPPH, chúng tôi đã sàng lọc và chọn
được 5/200 dược liệu có tác dụng chống oxy
hóa (S%>80%); nồng độ cồn để chiết cao
chiết cũng ảnh hưởng đến khả năng chống
oxy hóa. Trong số 5 dược liệu, 4 loại được
chiết bằng cồn 70% hiệu quả hơn Cốt khí củ,
Hậu phác, Hòe, Trâm mốc so với Kim ngân
hoa (cồn 50%).
Các cao phân đoạn đều có hoạt tính kém
hơn cao cồn toàn phần, IC50 của cao cốt khí
củ thấp nhất và tương đương với 16% so với
vitamin C. Kết quả này tương thích với kết
quả xác định hàm lượng polyphenol trong
cao cốt khí củ bằng quy trình đo quang với
thuốc thử Folin-Ciocaltue.
Bảng 2 và 3 trình bày kết quả thử
nghiệm chống oxy hóa bằng thuốc thử
DPPH.
Bảng 6 trình bày kết quả định lượng
polyphenol và IC 50 của các mẫu khảo sát.
Từ kết quả ở bảng 2, 3 và 6, chúng tôi
chọn cao cồn 70% chiết từ dược liệu cố khí
củ để khảo sát in vivo hoạt tính bảo vệ gan
so sánh với silymarin. Mẫu thử thể hiện tác

dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa
qua hàm lượng MDA ở lô chuột uống liều
0,9 và 1,8 g/kg giảm lần lượt là: 41,2%;
40,8% so với lô đối chiếu silymarin, hàm
lượng MDA giảm 51,2%.

228

Bảng 7 trình bày kết quả khảo sát hoạt
tính bảo vệ gan khi gây độc bằng
cyclophosphamid và so sánh với chất đối
chiếu silymarin.

KẾT LUẬN
Bằng phƣơng ph{p s|ng lọc hoạt tính chống
oxy hoá với thuốc thử DPPH và kết hợp với thử
nghiệm xây dựng v| định lƣợng polyphenol
trong các cao chiết, chúng t i đã x{c định đƣợc
cao chiết bằng cồn 70% củ dƣợc liệu Cốt khí củ
(IC50 30,67 µg/ml; P% polyphenol 10%) có tác
dụng chống oxy hóa khi so sánh với chứng
dƣơng vit min C; từ kết quả khảo sát in vivo trên
chuột thực nghiệm và so với chất đối chiếu
silymarin, có thể sơ bộ x{c định tác dụng bảo vệ
gan củ dƣợc liệu Cốt khí củ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.
5.

6.

Bộ Y tế, Viện Dƣợc Liệu 2006 , Phƣơng ph{p nghiên cứu tác
dụng dƣợc lý từ dƣợc thảo, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật, trang 102-110, 174-175, 279-290.
Đỗ Trung Đ|m 2014 , Phƣơng ph{p x{c định độc tính cấp của
thuốc.
Gi sson I, Ischiropoulos H et l 2002 , “The rel tionship
between oxidative/nitrative stress and pathological inclusions in
Alzheimer’s nd P rkinson’s dise se”, Free Radical Biology &
Medicine, 32 (12), pp. 1264-1275.
ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of
analytical procedures: text and methodology, pp. 1–13.
Rich rd S , Joshu A , M rio GF 2014 , “Ch pter 4 –
Antioxid nt C p city of Green Te
C melli sinensis ”,
Processing and Impact on Antioxidants in Beverages, pp. 33–39.
Shih-Hua F, Yerra KR, Yew-Min T 2008 , “Anti-oxidant and
inflammatory mediator's growth inhibitory effects of
compounds isol ted from Phyll nthus urin ri ”, Journal of
Ethnopharmacology, 116 (2), pp. 333-340.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

Chuyên Đề Dƣợc