Nghiên cứu cơ chế phân tử của sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên vi khuẩn streptococcus nhóm B phân lập tại Hàn Quốc

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH
NHÓM FLUOROQUINOLONE TRÊN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS
NHÓM B PHÂN LẬP TẠI HÀN QUỐC
Đặng Nguyễn Đoan Trang*, Usha Srinivasany**, Zachary Britt**, Carl F. Marrs**, Lixin Zhang**,
Moran Ki***, Betsy Foxman**

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, GBS) là nguyên nhân chính của nhiễm trùng ở
trẻ sơ sinh và cũng là nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người lớn có những tổn thương về miễn dịch.Sự
đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới.
Đối tương và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trên 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ
bệnh phẩm của các bệnh nhân tại các bệnh viện ở Hàn Quốc. Đột biến trên các gene mã hóa các enzyme gyrase và
topoisomerase được xác định bằng kỹ thuật PCR và giải mã trình tự chuỗi DNA đặc hiệu. Hoạt động của bơm
đẩy được xác định thông qua sự thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu của norfloxacin và ethidium bromide trên GBS
với sự có mặt của reserpine (20 µg/mL).
Kết quả: Sự đề kháng ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin có liên quan đến đột biến trên các gene mã
hóa các enzyme gyrase và topoisomerase. Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy được phát hiện trên 52,2 % các
vi khuẩn đề kháng với norfloxacin nhưng không có đột biến.
Từ khóa: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, đột biến, bơm đẩy, MIC

ABSTRACT
MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO FLUOROQUINOLONES AMONG CLINICAL
STRAINS OF GROUP B STREPTOCOCCUSFROM SOUTH KOREA
Dang Nguyen Doan Trang, Usha Srinivasan, Zachary Britt, Carl F. Marrs, Lixin Zhang, Moran Ki,
Betsy Foxman * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 78 - 82
Introduction: Group B Streptococcus (GBS) is a major cause of neonatal sepsis and an emerging cause of
infection in immune-compromised adult populations. GBS resistance to fluoroquinolones has been reported in

many countries worldwide.
Materials and methods: The study collection included 1075 clinical strains of GBS isolated from South
Korea. Mutations in genes encoding gyrase and topoisomerase were identified by PCR with specific primers
followed by sequencing. Evidence of efflux-mediated resistance to norfloxacin was identified by changes in MIC of
norfloxacin and ethidium bromide in the presence of reserpine (20 µg/mL), an efflux pump inhibitor..
Results: Mutations were detected in strains resistant to ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin.
Evidence of the efflux phenotype was found in 52,2% of GBS strains resistant only to norfloxacin with no known
mutations.
Keywords: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, mutations, efflux, MIC

* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Khoa Dịch tễ, Đại học Michigan, Hoa Kỳ
*** 3Khoa Y học Dự phòng, Trường Đại học Y khoa Eulji, Daejeon, Hàn Quốc
Tác giả liên lạc: DS. Đặng Nguyễn Đoan Trang
ĐT: 0909907976
Email:

78

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013
ĐẶT VẤN ĐỀ
Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus,
Streptococcus agalactiae, GBS) là nguyên nhân
chính của nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và cũng là
nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người
lớn có những tổn thương về miễn dịch(3). Sự đề
kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên
GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới

(4,9,11,12). Trong một nghiên cứu tại Mỹ (12), tỷ lệ đề
kháng levofloxacin trên GBS là 4,4%. Theo
nghiên cứu của Savoia D. và cộng sự tại Ý, tỷ lệ
đề kháng norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin,
pefloxacin và levofloxacin trên GBS lần lượt là
6,8%, 2,7%, 6,8%, 10,9% và 1,3% (11).
Trong nhiều nghiên cứu đã được báo cáo,
sự đề kháng các fluoroquinolone trên một số
vi khuẩn gram dương bao gồm GBS liên quan
đến đột biến trên các gene mã hóa các enzyme
gyrase và topoisomerase làm giảm khả năng
gắn kết và giảm hoạt tính của các
fluoroquinolone.
Sự
đề
kháng
các
fluoroquinolone trên vi khuẩn gram dương
còn được giải thích bởi cơ chế bơm đẩy trên
Staphylococcus aureus(5), Streptococcus pneumonia
(8), Streptococcus pyogenes (8) và Streptococcus suis
(8) nhưng chưa có báo cáo trên GBS.
Trên một nghiên cứu trên 1075 mẫu GBS
được phân lập từ các bệnh phẩm tại các bệnh
viện ở Hàn Quốc, tỷ lệ đề kháng các
fluoroquinolones khá cao, đặc biệt đối với
norfloxacin (tỷ lệ đề kháng với norfloxacin,
ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin lần
lượt là 93%, 8,9%, 8,1% và 0,8%) (7). Tỷ lệ đề
kháng này đặt ra vấn đề cần xác định cơ chế đề

kháng ở mức độ phân tử của các vi khuẩn phân
lập được nhằm góp phần vào việc lựa chọn
kháng sinh hiệu quả trong trị liệu cũng như
nghiên cứu các công thức thuốc mới có hiệu quả
cao trên GBS.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU

Nghiên cứu Y học

Việc xác định các đột biến trên các gene mã
hóa gyrase và topoisomerase được tiến hành
trên 95 mẫu GBS được lựa chọn ngẫu nhiên từ
1075 mẫu GBS phân lập từ nước tiểu, âm đạo,
trực tràng, vết thương của các bệnh nhân nhập
viện từ các bệnh viện ở Hàn Quốc từ năm 2006
đến 2008. Sau khi xác định các đột biến, 146 mẫu
GBS được tiếp tục thử nghiệm để xác định hoạt
động của bơm đẩy bao gồm 88 mẫu chỉ đề
kháng với norfloxacin (20 trong số này đã qua
xác định đột biến) và 58 mẫu đề kháng với các
fluoroquinolone khác đã qua xác định đột biến.

Phân lập GBS
GBS được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm
bằng cách nuôi cấy trên môi trường chọn lọc.
Thử nghiệm catalase và phản ứng ngưng kết
latex (Streptex; Murex Biotech Ltd., Dartford,
Anh) được sử dụng để phát hiện và xác định
GBS.

Xác định tính nhạy cảm của GBS đối với
các kháng sinh nhóm fluoroquinolone
Tính nhạy cảm của GBS đối với các kháng
sinh

nhóm

fluoroquinolone(norfloxacin,

ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin)
được xác định bằng máy kháng sinh đồ tự
động VITEK II (thực hiện tại Seoul Clinical
Laboratories

và

Seoul

Medical

Science

Institute) dựa trên các tiêu chuẩn EUCAST
(European

Committee

on

Antimicrobial

Susceptibility Testing) 2009 và 2011. Trên 1075
mẫu GBS nghiên cứu, tỷ lệ đề kháng với
norfloxacin,

ciprofloxacin,

levofloxacin và

moxifloxacin phát hiện lần lượt là 93%, 8,9%,
8,1% và 0,8%.

Xác định đột biến trên vùng QRDR
(Quinolone
Resistance
Determining
Region)

Chọn mẫu nghiên cứu

Các bước xác định đột biến trên vùng QRDR
của các gene gyr và par (mã hoá các enzyme
gyrase và topoisomerase):

Chuyên Đề Dược Học

79

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

- Vùng QRDR được khuếch đại bằng kỹ
thuật PCR với các đoạn mồi đặc hiệu của gyrA,
gyrB, parC và parE (12). Phản ứng PCR được tiến
hành trong điều kiện như sau: biến tính chuỗi
DNA ở 94oC trong 3 phút, 30 chu kỳ nhiệt bao
gồm giai đoạn bắt cặp ở nhiệt độ 45oC trong 30
giây và giai đoạn kéo dài ở 68oC trong 1 phút,
giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 68oC trong 6 phút.
Sản phẩm PCR được tiếp tục phân tích bằng kỹ
thuật điện di trên gel agarose 1% trong đệm Trisacetic acid/EDTA (pH 7.5) với chất nhuộm gel an
toàn GelRed và soi bằng nguồn sáng đèn UV.
- Sản phẩm PCR được giải mã trình tự DNA
(sequencing) tại Trung tâm Giải mã DNA, Đại
học Michigan, Hoa Kỳ và phân tích bằng phần
mềm Lasegene DNA STAR. Các chủng vi khuẩn
GBS ATCC 12403 and A909 được sử dụng làm
đối chứng âm trong phân tích.

Xác định hoạt động của bơm đẩy (efllux
pump) đối với norfloxacin
Hoạt động của bơm đẩy đối với norfloxacin
được xác định dựa trên sự thay đổi MIC của
norfloxacin (giảm ít nhất 4 lần) và ethidium
bromide (giảm ít nhất 2 lần) với sự có mặt của
reserpine (20 µg/mL), một chất ức chế bơm đẩy
(6,10). Mỗi kết quả MIC báo cáo là trung bình của 2

lần thử nghiệm lặp lại. Norfloxacin dùng trong
thử nghiệm được cung cấp bởi Sigma Aldrich,
Co., Missouri, Hoa Kỳ; reserpine được cung cấp
bởi MP Biomedicals, LLC, Ohio, Hoa Kỳ và
ethidium bromide được cung cấp bởi Fisher
Scientific, New Jersey, Hoa Kỳ.
Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus
1199B được cấy bơm đẩy norA được sử dụng
làm đối chứng dương; các chủng GBS ATCC
12403 và A909 được sử dụng làm đối chứng
âm trong thử nghiệm này.

Xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý thống kê
bằng phần mềm SAS (SAS Version 9.2 for
Windows; SAS Institute Inc., Cary, NC).

80

KẾT QUẢ
Đột biến trên các gene mã hoá gyrase và
topoisomerase
Việc xác định đột biến được tiến hành trên
các tiểu đơn vị gyrA, gyrB của gyrase và parC,
parE của topoisomerase. Chỉ có những đột biến
làm thay đổi ít nhất một acid amin mới được
đưa vào phân tích. Không có trường hợp đột
biến nào được phát hiện trên các chủng vi khuẩn
nhạy cảm với tất cả bốn fluoroquinolone và
những chủng vi khuẩn chỉ đề kháng với

norfloxacin. Đột biến trên gyrA và parC được
phát hiện trên các chủng đề kháng với
ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin theo
những tỷ lệ khác nhau (Bảng 1). Chỉ có ba
trường hợp đề kháng với ciprofloxacin có đột
biến trên gyrB và không có trường hợp đột biến
trên parE nào được phát hiện. Đột biến đồng thời
trên cả parC và gyrA được phát hiện trên 90%
chủng vi khuẩn đề kháng với levofloxacin và
100% chủng vi khuẩn đề kháng với
moxifloxacin. Tất cả những trường hợp này đều
đề kháng chéo với norfloxacin và ciprofloxacin
(Bảng 1).
Bảng 1: Tỷ lệ đột biến trên các gene gyrA và parC
trên 95 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) đề kháng
với các fluoroquinolone phân lập từ Hàn Quốc (2006
– 2008)
Tỷ lệ đột biến
Đề kháng Đề kháng Đề kháng Đề kháng
LF
MF
NF
NF và CF
Số lượng mẫu
20
37
29
9
Đột biến trên
0%

86%
90%
100%
parC hay gyrA
Đột biến trên cả
0%
4%
7%
0%
parC hay gyrA
Không có đột
100%
1%
0%
0%
biến

NF: norfloxacin, CF: ciprofloxacin, LF: levofloxacin, MF:
moxifloxacin

Mối liên quan giữa đột biến trên các gene
gyrA và parC và MIC
Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa
sự hiện diện của đột biến trên cả hai gene par và
gyr và MIC trong những trường hợp đề kháng

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

với ciprofloxacin (p=0,001), levofloxacin (p=0,001)
và moxifloxacin (p=0,001). Không có mối liên
quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến trên duy
nhất 1 gene (par hay gyr) và MIC.

Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy đối
với norfloxacin
Trên các mẫu GBS chỉ đề kháng với
norfloxacin và không có đột biến, MIC trung
bình của norfloxacin khi có reserpine giảm
khoảng 4 lần so với khi không có reserpine cho
thấy có sự hoạt động của bơm đẩy (Bảng 2). Trên
các mẫu GBS chỉ có đột biến trên duy nhất một
gene (parC hay gyrA), hoạt động của bơm đẩy
yếu hơn (MIC trung bình chỉ giảm 1,6 lần khi có
mặt reserpine). Trên các mẫu GBS có đột biến
trên cả 2 gene gyrA và parC, hoàn toàn không có
sự thay đổi MIC khi có mặt reserpine chứng tỏ
bơm đẩy không tồn tại hay không hoạt động
(Bảng 2).
Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
norfloxacin khi có và không có reserpine trên 146 mẫu
Streptococcus nhóm B (GBS) phân lập từ Hàn Quốc
(2006-2008)
Phân loại

Không có đột biến
Nhạy cảm với các
FQ
Đề kháng trung gian

với NF
Đề kháng NF
Đột biến chỉ trên
parC hay gyrA
Đột biến trên cả
parC và gyrA

Giá trị MIC trung Tỷ lệ có
bình (µg/mL) hoạt động
Số
của bơm
+
lượng
Reserpin Reserpin đẩy (%)
e
e
2
9
88

4
13.3
33.9

4
7.6
12.8

0
33.3

52.2

17

41

31.5

18.8

30

128

128

0

NF: Norfloxacin, FQ: fluoroquinolone

Khi sử dụng ethidium bromide làm chất
nền, bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy
được phát hiện trên 54,1% các chủng GBS chỉ
đề kháng duy nhất với norfloxacin và không
có đột biến. Tuy nhiên, tỷ lệ đồng thuận của
hai phương pháp phát hiện bơm đẩy (sử dụng
norfloxacin và ethidium bromide) chỉ ở mức

Chuyên Đề Dược Học

Nghiên cứu Y học

trung bình (kappa=0,6, khoảng tin cậy 95%:
0,45 – 0,78)
MIC của norfloxacin trên 2 chủng GBS
ATCC 12403 and A909 (đối chứng âm) là 4
µg/mL. Không có sự khác biệt về MIC của
norfloxacin trên 2 chủng này khi thêm reserpine.

BÀN LUẬN
Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh nhóm
fluoroquinolone, đặc biệt đề kháng norfloxacin,
trong nghiên cứu này cao hơn kết quả của
những nghiên cứu trước đây (1,6,11). Kết quả
nghiên cứu cho thấy sự đề kháng ciprofloxacin
và levofloxacin liên quan đến đột biến trên ít
nhất một gene gyrA hay parC trong khi sự đề
kháng moxifloxacin đòi hỏi phải có sự hiện diện
đồng thời của hai đột biến trên cả gyrA và parC.
Sự khác biệt này có thể được lý giải dựa trên cấu
trúc phân tử cồng kềnh của moxifloxacin. Kết
quả nghiên cứu thu được cũng khá tương đồng
với kết quả của các nghiên cứu trước đây về vị
trí ưu tiên tác động của các fluoroquinolone trên
vi khuẩn gram dương: các quinolone không thân
nước như moxifloxacin sẽ ưu tiên tấn công vào
gyrase trong khi các quinolone thân nước như
ciprofloxacin và levofloxacin sẽ ưu tiên tấn công
vào topoisomerase (7,10).
Tỷ lệ đề kháng norfloxacin của 1075 mẫu

GBS nghiên cứu là 93%. Tuy nhiên, không có đột
biến nào được phát hiện trong các mẫu lựa chọn
ngẫu nhiên từ các trường hợp chỉ đề kháng với
norfloxacin. Kết quả của thử nghiệm tiếp theo
cho thấy có bằng chứng về hoạt động của bơm
đẩy trên 52,2% các trường hợp chỉ đề kháng với
norfloxacin. Như vậy, bơm đẩy có thể là nguyên
nhân dẫn đến đề kháng norfloxacin trên GBS.
Trên GBS, hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề
kháng macrolide(2) và tetracycline(1) đã được báo
cáo nhưng chưa có nghiên cứu nào về hoạt động
của bơm đẩy trên fluoroquinolones. Kết quả
nghiên cứu này chính là phát hiện đầu tiên về
hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề kháng
norfloxacin trên GBS. Tuy nhiên, đây chỉ là bước
khởi đầu. Trong tương lai, cần tiến hành thêm

81


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013

nhiều nghiên cứu khác để xác định rõ hơn cơ chế
đề kháng các fluoroquinolone của GBS nhằm
góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu quả
trong điều trị cũng phát triển các hoạt chất và các
phối hợp thuốc mới hiệu quả trên GBS (Ví dụ:
phối hợp chất có tác dụng ức chế hoạt động của

bơm đẩy và fluoroquinolone).
Lời cám ơn: Xin chân thành cám ơn TS. Glenn W. Kaatz, Đại
học Wayne State, Detroit, Michigan đã cung cấp mẫu đối
chứng cho nghiên cứu; Quỹ Nghiên cứu Korea Research
Foundation, Hàn Quốc và Trung tâm MAC-EPID (The
Center for Molecular and Clinical Epidemiology of Infectious
Diseases), Đại học Michigan, Hoa Kỳ đã tài trợ cho nghiên
cứu này.

5.

6.

7.

8.
9.

10.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

82

Brown MG, Mitchell EH, Balkwill DL. (2008). Tet 42, a novel
tetracycline resistance determinant isolated from deep
terrestrial subsurface bacteria. Antimicrob. Agents
Chemother., 52: 4518–4521.
Cai Y, Kong F, Gilbert GL. (2007).Three new macrolide efflux
(mef) gene variants in Streptococcus agalactiae. J. Clin.
Microbiol. , 45: 2754–2755.
GIBBS RS, SCHRAG S, SCHUCHAT A. (2004). Perinatal
infections due to group B streptococci. Obstet. Gynecol. ,104:
1062-1076.
Gonzalez JJ, Andreu A. (2005). Multicenter study of the
mechanisms of resistance and clonal relationships of
Streptococcus agalactiae isolates resistant to macrolides,
lincosamides, and ketolides in Spain. Antimicrob. Agents and

11.

12.

Chemother., 49: 2525–2527.
Kaatz GW, Mcaleese F, Seo SM. (2005). Multidrug resistance
in Staphylococcus aureus due to overexpression of a novel
multidrug and toxin extrusion (MATE) transport protein.
Antimicrob. Agents Chemother. , 49: 1857–1864.
Kaatz GW et al. (2000). Evidence for the existence of a
multidrug efflux transporter distinct from NorA in
Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. , 44:
1404-1406.
KI M et al. (2012). Emerging fluoroquinolone resistance in

Streptococcus agalatiae from South Korea. Eur. J. Clin.
Microbiol. Infect. Dis., 31: 3199-205.
Li X-Z, Nikaido H. (2009). Efflux-mediated drug resistance in
bacteria: an update. Drugs, 69: 1555–1623.
MAEDA K et al. (2008). Fluoroquinolone-resistant group B
streptococci in acute Exacerbation of Chronic Bronchitis.
Emerging Infect. Diseases,14: 349-350.
Patel D et al.(2010). Ethidium bromide MIC screening for
enhanced eflux pump gene expression or efflux activity in
Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2010;
54: 5070-5073.
Savoia D et al. (2008). Streptococcus agalactiae in pregnant
women: phenotypic and genotypic characters. J. Infect., 56:
120-125.
Wehbeh W et al. (2005). Fluoroquinolone-resistant
Streptococcus agalactiae: Epidemiology and mechanism of
resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 49: 2495-2497.

Ngày nhận bài báo:

13.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012
Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

Chuyên Đề Dược Học