Nghiên cứu biến đổi siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SIÊU CẤU TRÚC PHÔI NGƯỜI
NUÔI CẤY NGÀY 5 TRƯỚC ĐÔNG LẠNH VÀ
SAU RÃ ĐÔNG BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA
Đoàn Thị Hằng*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* và CS
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá sự thay đổi hình thái siêu cấu trúc phôi người dưới kính hiển vi điện tử
truyền qua. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả trên 20 phôi người nuôi cấy ngày 5
(10 phôi tươi và 10 phôi sau rã đông). Kết quả: dưới kính hiển vi điện tử, màng trong suốt của
phôi bị biến đổi mất độ xốp, không quan sát rõ các sợi glycoprotein. Những phôi bào sống sau
rã đông ít bị tổn thương, trong bào tương có một số điểm thoái hóa hạt hoặc xuất hiện không bào.
Những phôi bào thoái hóa sau rã đông thấy màng tế bào bị co rúm, ty thể bị biến dạng, lưới nội
bào giãn rộng, màng nhân co rúm. Kết luận: những phôi sống sau rã đông rất ít bị tổn thương.
* Từ khóa: Phôi người; Hình thái siêu cấu trúc; Kỹ thuật thủy tinh hóa.

Transformation of Morphological Ultrastructure of Day-Five Human
Embryos before Freezing and after Vitrification Technique
Summary
Objectives: To assess the transformation of human embryological morphological ultrastructure
in post-thawing stage under transmission electron microscope (TEM). Subject and methods:
The descriptive study was performed on 20 human embryos in day 5 (10 fresh and 10 thawing
embryos). Results: Under electron microscope, the zona pellucida of embryos is transformed
and loses its porosity; glycoprotein fibers are not clearly visible. Embryos that survived after
thawing show little damage; there are some particle degeneration and vacuoles appearance at
some points in the cytoplasmic. The degenerative post-thawing embryos show deformed cell
membrane and mitochondria, expanded endoplasmic reticulum, and shrunk nuclear membrane.
Conclusions: Embryos that survived after thawing show little damage.
* Keywords: Human embryo; Morphological ultrastructure; Vitrification technique.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thụ tinh trong ống nghiệm gồm quá
trình kích thích buồng trứng, thụ tinh và
nuôi cấy phôi. Tuy nhiên, quá trình chuyển
phôi tươi đôi khi không thực hiện được do
niêm mạc tử cung chưa phù hợp, hội chứng

quá kích buồng trứng hoặc không chuyển
được phôi vào tử cung, đặc biệt khi số
lượng phôi dư thừa đều là những lý do
phải thực hiện phương pháp đông lạnh
phôi. Do vậy, đông lạnh phôi là kỹ thuật
không thể thiếu ở một trung tâm hỗ trợ
sinh sản.

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Đoàn Thị Hằng ()
Ngày nhận bài: 10/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/03/2018
Ngày bài báo được đăng: 26/03/2018

13


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018
Hiện nay, đông lạnh phôi bằng kỹ thuật
thuỷ tinh hoá đang được áp dụng rộng rãi
ở nhiều trung tâm trên thế giới cũng như
ở Việt Nam trong bảo quản phôi người.
Tuy nhiên, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu
sâu về cấu trúc, siêu cấu trúc của phôi
trước và sau rã đông bằng kỹ thuật thuỷ

tinh hoá. Các nghiên cứu siêu cấu trúc này
giúp đánh giá rất chính xác tổn thương
phôi ở mức độ dưới tế bào sau quá trình
rã đông, đồng thời giúp xác định hiệu quả
của phương pháp đông lạnh bằng kỹ
thuật thuỷ tinh hoá. Do đó, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài này với mục tiêu:
Đánh giá siêu cấu trúc phôi người nuôi
cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông
bằng kính hiển vi điện tử truyền qua.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU.
1. Đối tượng nghiên cứu.

+ Kỹ thuật làm tiêu bản cho kính hiển
vi điện tử truyền qua: tiến hành làm tiêu
bản cho kính hiển vi điện tử truyền qua
theo phương pháp của Hayat M.A (1989)
và Nguyễn Kim Giao (2004) [1, 7].
Đọc tiêu bản trên kính hiển vị điện tử
truyền qua JEOL - 1011 có độ phân giải 2A°,
điện áp 100 KV, tại Labo Kính hiển vi điện
tử - Bộ môn Mô Phôi, Học viện Quân y.
- Tiêu chí đánh giá hình thái siêu cấu
trúc phôi trên kính hiển vi điện tử quét và
kính hiển vi điện tử truyền qua:
+ Mô tả thay đổi cấu trúc màng trong
suốt của phôi trước đông lạnh và sau rã
đông trên kính hiển vi điện tử truyền qua.
+ Mô tả thay đổi cấu trúc của màng tế

bào, các bảo quan trong bào tương, nhân
tế bào của phôi trước đông lạnh và sau rã
đông trên kính hiển vi điện tử truyền qua.

20 phôi (được sự đồng ý của bệnh
nhân [BN]). 10 phôi tươi của BN có phôi
tươi dư thừa nhưng không có nguyện vọng
lưu trữ phôi, 10 phôi sau rã đông của BN
có phôi lưu trữ, nhưng đã có đủ số con,
tự nguyện hiến phôi cho nghiên cứu.
Tất cả phôi đều được đánh giá và lựa 3
chọn theo thang điểm của K.Gardner với
2
tiêu chuẩn sau:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Siêu cấu trúc phôi tươi.

1

* Tiêu chuẩn lựa chọn: phôi ngày 5 có
điểm đánh giá AA, AB, BA, BB.
* Tiêu chuẩn loại trừ: phôi ngày 5 có
điểm đánh giá C.
2. Phương pháp nghiên cứu.
* Các kỹ thuật nghiên cứu:
- Kỹ thuật đông phôi:
+ Quy trình đông lạnh phôi bằng kỹ thuật
thủy tinh hóa: sử dụng quy trình đông lạnh
cực nhanh theo phương pháp Cryotop của

Masashige Kuwayama (2005) [8].
14

Ảnh 1: Màng trong suốt của phôi tươi
ngày 5 (TEM - 10.000X).
(1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein
dạng sợi; 3: Protein dạng hạt)
Quan sát ở độ phóng đại lớn (10.000X)
thấy màng trong suốt của phôi tươi ngày 5,
có thể nhìn rất rõ glycoprotein dạng sợi
và hướng của các sợi này.


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018

2
3
4
1
5

Ảnh 2: Tế bào nụ phôi của phôi tươi ngày 5 (TEM - 4.000X).
(1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Hạt glycogen)

2

1

3

4
5

Ảnh 3: Tế bào lá nuôi phôi tươi ngày 5 (TEM - 4.000X).
(1: Nhân tế bào; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất có hạt; 5: Hạt glycogen)
Quan sát hình ảnh tế bào trong phôi và tế bào lá nuôi phôi của phôi tươi ngày 5 ở
độ phóng đại 4000X thấy tế bào có màng, bào tương, nhân và hạt nhân rõ, trong bào
tương thấy các bào quan như ty thể, lưới nội chất, hạt glycogen.
15


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018
2. Siêu cấu trúc phôi sống sau rã đông.

1
3

2

Ảnh 4: Màng trong suốt của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 10.000X).
(1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein dạng sợi; 3: Protein dạng hạt)
Quan sát màng trong suốt của phôi ngày 5 sau rã đông ở độ phóng đại 10.000X
thấy màng trong suốt giảm mật độ điện tử hơn so với trước đông lạnh, không quan sát
thấy rõ các glycoprotein dạng sợi như phôi trước đông lạnh.

2
1

3

4
5

Ảnh 5: Tế bào nụ phôi của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 2.000X).
(1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Không bào)
16


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018

2

1

3

4
5

Ảnh 6: Tế bào lá nuôi của phôi ngày 5 sau rã đông (TEM - 5.000X)
(1: Nhân tế bào; 2: Lưới nội chất; 3: Ty thể; 4: Hạt glycogen; 5: Màng trong suốt)
Quan sát tế bào lá nuôi phôi và tế bào nụ phôi ngày 5 sống sau rã đông ở độ phóng
đại 1500X thấy tế bào đều có màng, bào tương, nhân, hạt nhân rõ ràng, màng nhân và
màng tế bào không thay đổi, trong bào tương có đầy đủ các bào quan như ty thể, lưới
nội chất… giống như phôi trước đông. Tuy nhiên, một số phôi bào xuất hiện không bào
trong bào tương.
3. Siêu cấu trúc phôi thoái hóa sau rã đông.
3

1

4

2

Ảnh 7: Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông (TEM - 8.000X).
(1: Màng nhân đứt gãy; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất)
Phôi ngày 5 thoái hóa sau rã đông quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua
thấy màng nhân tế bào bị nhăn nhúm, có chỗ đứt gãy, nhiều nếp gấp, ty thể biến dạng,
chất nền sáng, không quan sát thấy mào ty thể, các lưới nội chất có hạt giãn rộng.
17


T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018
BÀN LUẬN
- Thay đổi màng trong suốt trước đông
lạnh và sau rã đông: ở phôi tươi dưới độ
phóng đại 10.000 lần, quan sát được màng
trong suốt liên tục, bên trong có nhiều sợi
sắp xếp theo các hướng khác nhau. Ở phôi
sau rã đông, quan sát ở cùng độ phóng
đại, màng trong suốt vẫn giữ nguyên
được tính liên tục, nhưng cấu trúc màng
mịn hơn, tăng mật độ điện tử, do đó khó
thấy rõ các sợi như trước khi đông lạnh.
Điều này có thể gợi ý cấu trúc của màng
trong suốt có thể bị ảnh hưởng trong quá
trình đông lạnh và rã đông.
Trên thực tế, nhiều nghiên cứu tại Việt
Nam và trên thế giới đã chỉ ra phôi sau rã

đông nếu được hỗ trợ thoát màng có tỷ lệ
làm tổ và có thai cao hơn nhóm không có
hỗ trợ thoát màng. Với nhóm được chuyển
phôi tươi, tỷ lệ này tăng không đáng kể
[4, 9]. Nghiên cứu của Đoàn Thị Hằng và
CS (2011) trên 257 phôi sau rã đông cho
thấy phôi được hỗ trợ thoát màng tăng
có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ sống và làm
tổ so với phôi không được hỗ trợ thoát
màng [2]. Wellington P. Martins và CS (2011)
tổng hợp 28 nghiên cứu trên 5.507 BN
chuyển phôi được hỗ trợ thoát màng.
Kết quả cho thấy tỷ lệ thành công tăng lên
có ý nghĩa ở hai nhóm: BN chuyển phôi
từng thất bại nhiều lần và BN chuyển phôi
sau rã đông, nhưng khác biệt không có
ý nghĩa ở nhóm BN chuyển phôi tươi [10].
Điều này gợi ý, màng trong suốt của phôi
sau rã đông rất có thể bị biến đổi so với
phôi tươi, trở nên “cứng” hơn do protein
đông vón trong quá trình đông lạnh,
gây cản trở quá trình phôi thoát màng.
Thực tế này phù hợp với kết quả nghiên
cứu của chúng tôi trên kính hiển vi điện
tử truyền qua.
18

- Thay đổi cấu trúc của các thành phần
trong bào tương các tế bào của phôi:
Quan sát các phôi bào, tế bào lá nuôi

và tế bào ICM trong phôi sống sau rã
đông cho thấy màng tế bào còn nguyên
vẹn, các thành phần hữu hình trong bào
tương như: ty thể, lưới nội chất, bộ máy
Golgi, hạt glycogen; màng nhân, chất
nhân, hạt nhân không khác so với phôi
trước đông lạnh. Trong bào tương tế bào
xuất hiện một số không bào. Trên phôi bị
thoái hóa sau rã đông thấy màng tế bào
nhăn nheo, liên kết giữa các tế bào lỏng
lẻo, màng nhân có thể bị đứt đoạn, ty thể
lưới nội chất bị trương phồng lên. Kết quả
của chúng tôi tương tự nghiên cứu của
Bettencourt E.M.V (2008) về đặc điểm
siêu cấu trúc của phôi cừu tươi và sau rã
đông bằng phương pháp đông lạnh chậm
trên kính hiển vi điện tử truyền qua: phôi
có chất lượng tốt sau khi rã đông, ít bị tổn
thương, phôi có chất lượng kém khi đông
lạnh phôi sẽ bị tổn thương nhiều, các tổn
thương chủ yếu thấy ở ty thể bị tổn thương,
màng nhân có thể bị đứt đoạn, tế bào
không có mối liên kết chặt chẽ, trong bào
tương có thể thấy xuất hiện các khoảng
trống, mật độ điện tử giảm, đặc biệt xuất
hiện nhiều không bào [5]. Kết quả này
tương tự một số tác giả nghiên cứu trên
phôi bò đông lạnh bằng kỹ thuật đông
lạnh chậm [3].
Như vậy, có thể nói quá trình đông

lạnh làm tổn thương tế bào ở một ngưỡng
nhất định, đối với những phôi có chất
lượng tốt, còn sống sau rã đông, cấu trúc
tế bào ít bị biến đổi, đặc biệt các thành
phần quan trọng như ty thể, lưới nội chất,


t¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2018
màng nhân và hạt nhân. Điều này có thể
được chứng minh bằng trẻ sinh ra từ phôi
đông lạnh hoàn toàn khỏe mạnh như những
trẻ sinh ra từ phôi tươi [6, 11].
KẾT LUẬN
Nghiên cứu 20 phôi người nuôi cấy
ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông
dưới kính hiển vi điển tử truyền qua,
chúng tôi rút ra kết luận:
- Các phôi sống sau rã đông hầu như
không thay đổi về cấu trúc so với phôi
trước đông lạnh: các phôi bào liên kết rất
chặt chẽ, đặc biệt thành phần cấu trúc
quan trọng của phôi bào như nhân, màng
nhân, lưới nội chất, ty thể và màng tế bào
còn nguyên vẹn, tổn thương duy nhất là
xuất hiện một số không bào.
- Màng trong suốt giảm mật độ điện tử
so với trước đông lạnh, không quan sát rõ
glycoprotein dạng sợi như ở phôi tươi.
- Phôi thoái hóa sau rã đông bị biến
dạng, bề mặt lồi lõm không đều. Các tế

bào của phôi có màng tế bào nhăn nhúm,
ty thể biến dạng, chất nền sáng, không
quan sát thấy mào ty thể, lưới nội chất
giãn rộng, màng nhân bị đứt đoạn, ro rúm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Kim Giao. Hiển vi điện tử trong
khoa học và sự sống. Nhà xuất bản Đại học
quốc gia. Hà Nội. 2004, tr.55-169.
2. Đoàn Thị Hằng, Nguyễn Thanh Tùng,
Quản Hoàng Lâm, Nguyễn Đình Tảo và CS.
Hiệu quả của kỹ thuật hỗ trợ phôi thoát màng
bằng axít tyrode cho phôi đông lạnh. Tạp chí
Y Dược lâm sàng 108. 2011, 6(6), tr.145-150.
3. Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc
Lan. Hồ Mạnh Tường và CS. Mối tương quan
giữa chất lượng phôi sau rã đông và tỷ thai

lâm sàng của chuyển phôi trữ lạnh, Y học
Sinh sản. Nhà xuất bản Y học. 2005, tr.15-18.
4. Balaban B, Urman B, Alatas C, Mercan R,
Mumcu A,d Isiklar A. A comparison of four
different techniques of assisted hatching. Human
Reproduction. 2002, 17 (5), pp.1239-1243.
5. Bettencourt E.M.V, Bettencourt C.M,
Silva J.N.C.E. Ultrastructural characterization
of fresh and cryoprotected in vivo produced
ovine embryos. Theriogenology. 2008, 10 (1016),
pp.947-958.
6. Gvakharia M et al. Comparison of
post-thawed survival and implantation of

frozen-thawed embryos derived from ICSI vs.
conventional IVF. Fertility and Sterility. 2004,
pp.7-17.
7. Hayat M.A. Principle anh techniques of
Electron microscopy. Macmillian Press. Hong
Kong. 1989, pp.79-137.
8. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S.
Comparison of open and closed methods for
vitrification of human embryos and the
climination of potential contamination. Reprod
Biomed Online. 2005, 11 (5), pp.608-614.
9. Valojerdi M.R, Eftekhari-Yazdi P,
Karimian L. Effect of laser zona pellucida
opening on clinical outcome of assisted
reproduction technology in patients with
advanced female age, recurrent impantation
failure, or frozen - thawed embryos Fertil Steri.
2008, 90 (1), pp.84-91.
10. Wellington P.M. Assisted hatching of
human embryos: a systematic review and
meta-analysis of randomized controlled trials.
Human Reproduction Update. 2011, pp.1-6.
11. WHO. Infecundity, infertiliti and
childlessness in developing countries.
/>nfertiiti/DHS-CR9.pdf. 2010.

19