Nghiên cứu ứng dụng tấm màng ối đông khô làm giá thể trong nuôi cấy tế bào gốc

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TẤM MÀNG ỐI ĐÔNG KHÔ
LÀM GIÁ THỂ TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC
Nguyễn Viết Trung*; Phạm Văn Trân*
TãM T¾T
Sử dụng tấm màng ối đông khô để nuôi cấy tế bào gốc (TBG) màng ối với mục tiêu ứng dụng
màng ối đông khô làm giá thể sinh học nuôi cấy tế bào (TB), đồng thời bước đầu nghiên cứu ảnh
hưởng của giá thể màng ối lên khả năng tăng sinh và biệt hóa TB. Tấm màng ối đông khô được “làm
ướt” trở lại bằng dung dịch PBS, sau đó dàn lên đáy đĩa nuôi cấy. Nhỏ và trải đều TBG màng ối lên
bề mặt tấm màng ối. Nuôi cấy TBG màng ối trong môi trường DMEM và 10% huyết thanh bào thai
bê. Thu hoạch TB nuôi cấy trên tấm bằng dung dịch trypsin 0,25%. Đo sự tăng sinh TB theo phương
pháp MTS và xác định tính gốc của TB bằng dấu ấn OCT-4. Kết quả: TBG màng ối phát triển tốt trên
màng ối đông khô được “làm ướt”, đồng thời vẫn giữ nguyên được biểu hiện OCT-4. Như vậy, sử
dụng màng ối đông khô làm giá thể để nuôi cấy TBG màng ối giúp TB tăng sinh và duy trì được tính
gốc ban đầu.
* Từ khóa: Tế bào gốc; Màng ối đông khô.

APPLYING HYPER-DRY AMNION FOR CULTURE OF
AMNIOTIC MEMBRANE STEM CELLS
SUMMARY
Using of “hyper-dry amnion” as biological scaffold for culturing the amniotic stem cells to study
theirs effects on proliferation and differentiation of these cells. “Hyper-dry amnion” returned fresh
amniotic membrane with PBS solution and then set to the bottom of the culture plate. Drip and
spread of cells on amniotic membrane surface and cultured in DMEM medium supplemented with
10% fetal calf serum. Cells were harvested from cell culture dish using trypsin 0.25%. Measurement
of cell proliferation by the MTS method. Characterisation of cells by OCT-4 marker. So that, Amniotic
membrane stem cells proliferate well on hyper-dried amniotic membrane returned to those of fresh
amniotic membrane and stem cell always express OCT-4 marker. So that “hyper-dry amnion” is used as
a scaffold upon which amniotic stem cells can regenerate and maintain theirs characterisations.
* Key words: Stem cells; Hyper-dry amnion.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Điều kiện tiên quyết cho việc lựa chọn
giá đỡ là tính phù hợp về mặt sinh học của
nó, tức thích hợp với tổ chức sống, không
độc, không gây ung thư hoặc không kích

thích sinh miễn dịch trong cơ thể sống. Giá
đỡ không bị phá hủy bởi quá trình viêm nên
có thể sử dụng để cấy ghép. Ngoài ra, giá
đỡ cần có tính chất cơ học phù hợp với mô,
bao gồm tính thấm, tính ổn định, độ đàn hồi,
tính linh hoạt và dễ dàng lấy bỏ khi cần [1].

* Bệnh viện 103
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS. TS. Lê Văn Đông
TS. Nguyễn Đặng Dũng

1


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

Giá đỡ cũng cần cho phép TB bám dính
và khả năng thấm qua dễ dàng các chất
như yếu tố sinh trưởng và vật liệu di
truyền [2].
Màng ối là một giá đỡ với mô hình cấu
trúc tương tự như chất gian bào trong tổ
chức, cơ quan. TB biểu mô màng ối tiết ra

các thành phần ngoại bào collagen týp III,
IV và glycoprotein khác như laminin,
nidogen, fibronectin tạo nên màng nền của
màng ối. Lớp xốp trên màng ối là những
proteoglycan ưa nước và glycoprotein chứa
các mạng lưới gồm chủ yếu collagen týp III.
Perlecan - một heparan sulphate proteoglycan,
là thành phần chủ yếu của màng nền, gắn
các yếu tố sinh trưởng với protein ngoại
bào và phân tử bám dính.
Màng ối toàn phần chứa nồng độ cao
các chất EGF, KGF, HGF và bFGF so với
màng ối nạo bỏ hết lớp biểu mô [3]. Điều đó
chứng tỏ, TB biểu mô màng ối chế tiết các
yếu tố sinh trưởng. Thêm vào đó, TNF-α,
NGF, BDNF, noggin và activin cũng được
phát hiện trong TBG biểu mô [4]. Vì vậy, TB
biểu mô màng ối sản xuất cytokine có vai
trò quan trọng trong việc tạo ra môi trường
cho TBG tồn tại. Trên thực tế, Grueterich đã
chứng minh, khi nuôi cấy TBG vùng rìa giác
mạc trên màng ối toàn phần, TB không thay
đổi về mặt hình thái, trong khi nếu nuôi cấy
trên màng ối loại bỏ hết biểu mô, những TB
này có kiểu hình giống giác mạc vùng trung
tâm [5]. Chúng tôi thực hiện đề tài này
nhằm: Xác định khả năng tồn tại, phát triển
tăng sinh và khả năng duy trì tính gốc của
TBG màng ối sau khi nuôi cấy trên màng ối
đông khô. Nghiên cứu này thành công sẽ

tạo ra nhiều triển vọng trong việc sử màng
ối trong công nghệ mô.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Màng ối và TBG phân lập từ màng ối
của những sản phụ mổ đẻ, được sàng lọc
âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Chuẩn bị các tấm màng ối đông khô:
Rửa sạch các tấm màng ối thu được
bằng dung dịch PBS cho đến khi tạo thành
một màng mỏng trong suốt, dàn tấm màng
ối vừa cắt trên giấy nhôm allumium. Xử lý
tấm màng ối bằng hệ thống đông khô, sau
đó chiếu xạ từ chất phóng xạ Coban 60,
liều chiếu 25 kGy. Sau khi kết thúc quá trình
xử lý phóng xạ, các tấm màng ối đông khô
trở nên tuyệt đối vô khuẩn và không còn
TB sống.
* Chuẩn bị TBG màng ối:
TBG màng ối bảo quản ở nhiệt độ -80oC
hoặc được thu hoạch trực tiếp từ đĩa nuôi
cấy, ly tâm với dung dịch NaCl 0,9% 3 lần
để loại bỏ hết môi trường bảo quản và môi
trường nuôi cấy. Trộn đều TB trong dung
dịch NaCl 0,9%, tỷ lệ 107 TB/ml.
* Nuôi cấy TBG màng ối trên tấm màng
ối đông khô:

“Làm ướt” tấm màng ối đông khô bằng
môi trường DMEM, sau đó dán lên đáy đĩa
nuôi cấy. Nhỏ TBG đã được chuẩn bị trong
môi trường cơ bản lên đĩa nuôi cấy với mật
độ khoảng 2.000 TB/cm2. Thay môi trường
2 ngày/lần, chú ý cho môi trường vừa đủ để
màng ối luôn bám sát đáy đĩa nuôi cấy. Thu
hoạch tấm màng ối có cấy TBG bằng dung
dịch trypsin 0,25%. Làm tiêu bản nghiên
cứu hoặc có thể tách chiết ARNtt hoặc

2


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

* Kỹ thuật RT-PCR:
Tách ARN toàn phần từ TB b»ng bộ kít
Qiagen theo quy trình kỹ thuật của nhà
cung cấp. Xác định nồng độ và chất lượng
ARN trên hệ thống Nanodrop và Agilent.
Tổng hợp sợi ADN bổ sung bằng phản ứng
sao chép ngược từ 5 μg ARN toàn phần sử
dụng kít Fermentas. Thực hiện phản ứng
PCR trên máy luân nhiệt Biorad sử dụng kít
Qiagen. Cặp mồi đặc hiệu cho gen OCT-4
(Octamer-binding protein 4) là mồi xuôi:
5'-GAGGAGTCCCAGGACATGAA-3'; mồi ngược:
Reverse: 5'-GTGGTCTGGCTGAACACCTT-3'.
Sau khi làm biến tính 15 phút ở 95°C, thực

hiện 40 - 50 chu kỳ PCR (15 giây: 95°C,
25 giây: 58°C và 20 giây: 72°C). Điện di sản
phẩm PCR (154 pb) trên gel hoặc giải trình
tự để kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng
PCR.
* Kỹ thuật hóa miễn dịch DAB:
Nuôi cấy mẫu TBG màng ối trên tấm
màng ối, đúc parafin, khử parafin trong
xylen và cồn, sau đó ức chế peroxydase nội
bào bằng H2O2 0,03%. Ủ với kháng thể đơn
dòng kháng Oct 3/4, sau đó ủ với kháng thể
thứ hai có gắn biotin và ủ với phức hợp
streptavidine peroxydase. Hiển thị màu với
cơ chất DAB (3,3-diaminobenzidine) và nhuộm
với HE tạo nền tương phản. Sau khi nhuộm
hóa mô miễn dịch, kết quả âm tính chỉ có
màu xanh tím của HE nhuộm nhân. Dương
tính nếu có hiện diện của kháng nguyên
trên TB, phức hợp kháng nguyên - kháng
thể - streptavidine màu sẽ cho màu vàng
nâu (màu của DAB).

TBG màng ối được cấy ở mật độ thấp
(25.000 TB/cm2 trong 200 µl môi trường)
trên đĩa nuôi cấy microtest (96 giếng). Nuôi
cấy TB ở 37°C trong thời gian 1, 3, 7, 10
hoặc 14 ngày. Tính toán số lượng TB bằng
phương pháp MTS (Promega). Nguyên lý
của phương pháp này là giảm của muối
tetrazolium (sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở

bước sóng 490 nm) bởi các TB sống sẽ tỷ
lệ với số lượng của chúng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Khả năng tăng sinh của TB trên
màng ối.
1.4
1.4

PL
MO

1.2

1.2

490nm
DO
Do 490nm

protein như quy trình thực hiện với màng ối
thông thường.

1

1

0.8

0.6
0.8

0.4

0.6

0.2

0.4
0
0.2

N1

N3

N7

N10

N14
N14

Hình 1: Tốc độ tăng sinh của TBG màng ối
trên đĩa
0 plastic (PL) và trên màng ối đông
khô (MO) được “làm ướt” phục hồi. TB nuôi
cấy trên màng ối có tốc độ tăng sinh chậm
hơn so với TB nuôi cấy trên đĩa plastic.
2. Đặc điểm về hình thái và dấu ấn sinh
học của TBG nuôi cấy trên màng ối.
Sau 24 giờ nuôi cấy, các TB bám dính lên

bề mặt màng ối. Thay môi trường 3 ngày/lần.
Tốc độ tăng sinh của TB nuôi cấy trên màng
ối chậm hơn nhiều so với TB được nuôi cấy
trực tiếp trên đĩa. TB cũng có nhiều hình thái
khác nhau và kém thuần nhất.

* Đo sự tăng sinh của TB:

3


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

Hình 2: Hình ảnh TBG nuôi cấy trên tấm màng ối đông khô được “làm ướt” và
biểu hiện dấu ấn OCT-4.
A: Hình ảnh TB nuôi cấy trên màng ối, phần lớn TB có hình đa diện không thuần nhất,
có vài lớp TB mọc chồng lên nhau. B: TB nuôi cấy trực tiếp trên đĩa nuôi cấy, phần lớn TB có
hình thoi tương tự nguyên bào sợi (độ phóng đại 400X). C: Nhuộm HE trực tiếp trên đĩa nuôi
cấy trên tấm màng ối (độ phóng đại 40X). D: Nhuộm HE cắt dọc tấm màng ối nuôi cấy TB.
E: Tiêu bản tấm màng ối được nuôi cấy TBG ngày thứ 14, nhuộm hóa mô miễn dịch TB DAB
với OCT-4. TB dương tính với OCT-4. F: Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của OCT-4.
Vị trí 2, 3 là các mẫu TBG màng ối sau phân lập; 3,4 là các mẫu TB được nuôi cấy trên
màng ối. Không có sự khác biệt về biểu hiện OCT-4 trên hình ảnh điện di sản phẩm PCR.

4


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN

Hiện nay, các nước có nền y học phát
triển như Mỹ, Nhật, Pháp, Đức... đang
nghiên cứu tạo ra tấm TBG người sử dụng
giá đỡ khác nhau để che phủ tổn thương
hoặc lấp đầy tổ chức khuyết hổng. Màng ối
là một mô có nguồn gốc bào thai, cấu tạo
bởi 3 màng chính: màng biểu mô đơn,
màng nền dày và màng vô mạch. Không có
thần kinh, mạch máu hay bạch huyết trong
màng ối. Laminin là thành phần chính của
màng nền tham gia vào quá trình biệt hóa
TB, duy trì hình dạng và hoạt động TB, duy
trì kiểu cấu trúc mô, đồng thời thúc đẩy sự
tồn tại của các mô thông qua thụ cảm thể
của TB như integrin và dystroglycan. Vì
vậy, màng ối là giá đỡ sinh học lý tưởng ở
in vitro cũng như in vivo cho tăng sinh và
biệt hóa TB [6]. Chúng tôi tạo ra tấm màng
ối đông khô sử dụng màng ối như giá đỡ và
TBG màng ối được bổ sung trên giá đỡ
này. Điều quan trọng là TBG không những
có thể tồn tại mà còn tăng sinh (hình 1). So
với đĩa plastic, nuôi cấy trên tấm màng ối
đông khô làm TB phát triển chậm lại, đồng
thời duy trì được tính gốc của TB. Dấu ấn
OCT-4 biểu hiện ở TB nuôi cấy ngày thứ 14
ở mức độ ARNtt (xác định bằng RT-PCR)
và cả ở mức độ protein (hóa mô miễn dịch
TB) (hình 2). Những tấm màng ối đông khô
này được bổ sung TBG rất dễ xử lý khi gặp

các dạng tổn thương khác nhau về kích
thước. Những vật liệu này sẽ mở ra một
hướng mới trong điều trị một số mặt bệnh
ngoại khoa. Như vậy, màng ối có thể là một
nguồn nguyên liệu hấp dẫn trong lĩnh vực y
học tái tạo. Trong những nghiên cứu trước,
chúng tôi đã tạo được tấm màng ối đông
khô đạt chất lượng tốt, đồng thời cũng xây
dựng một quy trình phù hợp với các điều
kiện hiện có tại Việt Nam. Hiện nay, màng

ối người đã được sử dụng rộng rãi để
điều trị một số bệnh trong lĩnh vực nhãn
khoa như bỏng giác mạc, suy TB vùng rìa,
sẹo giác mạc, bệnh pemphigoid và hội chứng
Stevens-Johnson [7]. Chất gian bào trong
màng ối người đã được chứng minh có khả
năng làm tăng sinh TB thần kinh ngoại vi,
đồng thời cũng là giá đỡ sinh học có thể
tiêu hủy trong cơ thể khi ghép mà không để
lại di chứng. Nghiên cứu này sẽ mở ra một
hướng mới trong việc sử dụng màng ối và
TBG màng ối trong công nghệ mô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Young CS, et al. Tissue-engineered hybrid
tooth and bone. Tissue Eng. 2005, 11 (9-10),
pp.1599-1610.
2. Walgenbach KJ, et al. Tissue engineering
in plastic reconstructive surgery. Anat Rec.
2001, 263 (4), pp.372-378.

3. Branski LK, et al. Amnion in the treatment
of pediatric partial-thickness facial burns. Burns.
2008, 34 (3), pp.393-399.
4. Uchida S, et al. Neurotrophic function of
conditioned medium from human amniotic epithelial
cells. J Neurosci Res. 2000, 62 (4), pp.585-590.
5. Diaz-Prado S, et al. Multilineage differentiation
potential of cells isolated from the human amniotic
membrane. J Cell Biochem. 111 (4), pp.846-857.
6. Grueterich M, Espana EM, Tseng SC. Ex
vivo expansion of limbal epithelial stem cells:
amniotic membrane serving as a stem cell niche.
Surv Ophthalmol. 2003, 48, pp.631-646.
7. Dua HS, A Azuara-Blanco. Amniotic membrane
transplantation. Br J Ophthalmol. 1999, 83 (6),
pp.748-752.

Ngµy nhËn bµi: 19/10/2012
Ngµy giao ph¶n biÖn: 30/11/2012
Ngµy giao b¶n th¶o in: 28/12/2012

5


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1 - 2013

6