Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013

NGHIÊN CỨU TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN KHÁNG THUỐC CỦA HBV
Ở ĐỐI TƢỢNG TIÊM CHÍCH MA TÚY VÀ GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG
Nguyễn Hùng Cường*; Nguyễn Bảo Trân*; Hoàng Thị Thanh Huyền*
Azumi Ishizaki**; Hiroshi Ichimura**; Phạm Văn Thức*
TÓM TẮT
Thu thập 633 mẫu huyết thanh từ đối tượng tiêm chích ma tuý (TCMT) (n = 492) và gái mại dâm
(GMD) (n = 141) tại các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng. Tách chiết
HBV-ADN từ mẫu huyết thanh có kết quả sàng lọc HBsAg dương tính. Khuếch đại vùng gen Pol-RT
của HBV nhờ phản ứng Nested PCR và sản phẩm sau PCR được giải trình tự gen trực tiếp. Phân
tích đột biến kháng thuốc của HBV bằng chương trình GENETYX và hướng dẫn của Standford
University trên cơ sở kết quả giải trình tự vùng gen Pol-RT.
Kết quả: tỷ lệ nhiễm HBV ở cả hai nhóm đối tượng TCMT và GMD tại Hải Phòng là 10,59%.
Trong đó, nhóm TCMT là 10,57% và nhóm GMD là 10,64%. Ba genotýp/subtýp của HBV được phát
hiện tại khu vực duyên hải phía Bắc; HBV subtýp B4 có tỷ lệ phân bố phân bố cao nhất (77,61%),
tiếp theo là subtýp C1 (19,4%) và subtýp I1 (2,99%). Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine trong
67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84% và kháng thuốc adefovir và entercavir là 0%. Một chủng HBV
genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD. Axít amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT là methionine
được thay thế bằng aa isoleucin và bộ tứ aa YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) chuyển
thành YIDD. Đây là đột biến kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngoài kháng lamivudine,
chủng virut này còn kháng cả 2 thuốc là telbivudine và telnofovir. Một chủng HBV genotýp B xuất
hiện đột biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT, aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng aa
isoleucin, chủng này chỉ kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế đột biến L80I. Xuất hiện đột biến
tự nhiên kiểu YIDD là yếu tố cảnh báo nguy cơ điều trị thất bại với thuốc lamivudine và tenofovir.
* Từ khoá: Viêm gan virut B; Đột biến gen kháng thuốc; Tiêm chích ma túy; Gái mại dâm.

Study on drug resistant hepatitis B virus mutant frequency
among drug intravenous user and female sex worker groups in
Haiphong, Vietnam
Summary

Plasma samples were collected from 633 subjects among two groups (drug intravenous user
[IDU]: 492; female sex worker [FSW]: 141) in the Rehabilitation Center in Haiphong. Plasma viral
DNA was extracted from samples that were positive for hepatitis B suface antigen (HBsAg). Pol-RT
regions of HBV were amplified by PCR with primers (HB1F(18-39)/HB1R(534-557) and HB2F(414433)/HB2R(970-989)). PCR products were sequenced directly and analized by GENTYX program,
introducted by Standford University.
* Đại học Y Hải Phòng
** Đại học Kanazawa, Nhật Bản
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hùng Cường ()
Ngày nhận bài: 21/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo:20/6/2013
Ngày bài báo được đăng: 15/7/2013

Results: HBsAg prevalence was 10.57% and 10.64% among IDU and FSW groups in Haiphong.
Three HBV genotypes/subtypes were confirmed, subtypes B4 was predominant (79.87%), followed
by subtypes C1 (18.87%) and subtypes I1 (1,26%). Two subtypes I1 strains were indentified. Subtype

57


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
I1 was identified with very rare prevalence in Vietnam. Lamivudine resistant rate was 3.84% (L80I
mutation: 1.92%; M204I mutation: 1.92%) and tenofovir resistant rate was 1.92% (M204I mutation).
The resistant rate of adefovir and entercavir was 0%. M204I mutation (YMDD =>YIDD) was crossresistant mutation, HBV will resistant with lamivudine, tebivudine and tenofovir. The appearance of
cross-resistant mutations can expect treatment failure with multi-drugs in future. The buidinge of a
national program to monitor the appearance HBV drug resistant mutations is very important.
* Key words: HBV; Drug resistant mutation; Intravenous drug user; Female sex worker.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm gan virut B (HBV) là vấn đề sức
khỏe được quan tâm trên toàn thế giới.
Khoảng 5% dân số thế giới bị nhiễm HBV,

tương đương với 350 triệu người [8, 9].
Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi
tháng 9 - 2008 trên 1.077 đối tượng ở Hải
Phòng, tỷ lệ nhiễm HBV là 12,2% [1]. Đa số
nhiễm HBV mạn tính, một số khá lớn là tình
trạng viêm gan B mạn tính và có nhu cầu
điều trị bệnh. Thuốc điều trị HBV hiện nay
gồm: interferon alfa, peginterferon alfa, các
nucleosid [3, 4, 5]. Trong đó, các chế phẩm
của interferon có giá thành rất cao và đa số
bệnh nhân không có cơ hội sử dụng. Các
thuốc thuộc nhóm nucleosid analogues
gồm: lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir,
tenofovir và emtricitabine… hiện đang sử
dụng chủ yếu và rất có hiệu quả trong điều
trị HBV [2]. Tuy nhiên, vấn đề lựa chọn
phác đồ điều trị hợp lý và có sơ sở để đảm
bảo hiệu quả của quá trình điều trị gặp
nhiều khó khăn do thông tin về kháng thuốc
của HBV tại Việt Nam được công bố không
nhiều. Vì vậy, hiệu quả điều trị còn thấp và
làm cho nguy cơ kháng thuốc của HBV ngày
càng cao. Mục tiêu của nghiên cứu này
nhằm: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng
thuốc của HBV ở đối tượng TCMT và GMD
tại Hải Phòng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.

Tổng cộng 633 đối tượng, trong đó:
- Nhóm TCMT: 492 đối tượng có TCMT,
đang quản lý cai nghiện ở các Trung tâm
Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng.
- Nhóm GMD: 141 đối tượng hành nghề
mại dâm, đang quản lý tại các Trung tâm
Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Kỹ thuật và sinh phẩm sử dụng trong
nghiên cứu:
- Các mẫu huyết thanh được sàng lọc
nhiễm HBV bằng kít Determin của ABBOTT
(Nhật Bản) nhằm phát hiện kháng nguyên
bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg).
- Các mẫu có kết quả HBsAg dương tính
sẽ được tách HBV-ADN, sử dụng kít Smitest
EX-R&D (Genome science laboratories,
Fukushima, NhËt Bản).
- Chạy PCR khuyếch đại vùng gen Pol-RT
của HBV bằng sinh phẩm ampli Tag Gold,
Ampplied Biosystems với các cặp primer:
HB1F(18-39)/HB1R(534-557) và HB2F(414433)/HB2R(970-989) (Fuminaka Sugauchi
và CS, 2001).
- Giải trình tự gen trực tiếp bằng kit Big
Dye terminator (genetic analyzer, ABI PRISM
3130, Applied biosystems).
* Xử lý số liệu bằng các phần mềm:
- So sánh trình tự nucleotid các trình tự
sử dụng chương trình phần mềm Clustal W
(Thompson, 1994) và đoạn trình tự mẫu lấy

58


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
hợp hướng dẫn của Standford university
trên địa chỉ Web: />HBV/HBVseq/development/hbvseq.pl?actio
n=showSequenceForm

từ Genbank/EMBL/DDBJ.
- Xác định đột biến kháng thuốc của HBV
trên cơ sở giải trình tự gen vùng Pol-RT
của HBV. Đối chiếu kết quả đột biến theo
hướng dẫn liệt kê theo bảng 1 [2, 9] và kết

Bảng 1: Vị trí đột biến kháng lamivudine, telbivudine, adeforvir, telnofovir và entercavir.

Vị trí đột
biến

Lamivudine

Telbivudine

Adeforvir

L80V/I;
V173L;
L180M;
M204V/I;

M204I

A181V/T;
N236T;
N238D;
V84M;
S85A;
V214A;
Q215S

I169T; A181T;
M204S;
T184S;
Q215S

Telnofovir

Entercavir

A194T;

V173L; L180M; M204V;
I169T; T184G; S202I;
M250V

L180M;
M204I; V214A;
Q215S

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Tỷ lệ nhiễm HBV.
Bảng 2: Tỷ lệ nhiễm HBV nhóm đối tượng TCMT và GMD ở Hải Phòng.
NHÓM

HBsAg (+)

TUỔI TRUNG BÌNH

n

n

%

TCMT

492

38,72

52

10,57

GMD

141

28,88

15

10,64

Tổng

633

67

10,59

Tû lệ nhiễm HBV tại Hải Phòng là 10,59%, không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm HBV
giữa nhóm TCMT và GMD (p > 0,05).
2. Phân bố kiểu genotýp của HBV.
Bảng 3: Phân bố kiểu genotýp của HBV dựa trên vùng gen Pre-S1.
NHÓM

n

GENOTÝP B4

GENOTÝP C1

GENOTÝP I1

n

%

n

%

n

%

TCMT

52

41

78,85

10

19,23

1

1,92

GMD

15

11

73,33

3

20

1

6,67

Tổng

67

52

77,61

13

19,40

2

2,99

Nhóm nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự vùng gen Pre-S1 của 67 chủng HBV.
Trên cơ sở các trình tự được giải mã này, chúng tôi truy cập vào trang Web:

60


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
để tiến hành lấy các đoạn gen Pre-S1 reference của genotýp
HBV đã công bố và đối chiếu kết quả. Kết quả cho thấy genotýp B4 rất phổ biến tại Hải Phòng
và chiếm 77,61%, tiếp theo là genotýp C (19,4%). Có 2 chủng (2,99%) thuộc genotýp I1
được xác định. Đây là những chủng it gặp tại Việt Nam [6, 7].
3. Tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV.
Bảng 4: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV với lamivudine.
VỊ TRÍ ĐỘT BIẾN

GENOTÝP B4 (n = 52)

n
L80V

0

L80I

1

I169T

%

GENOTÝP C1 (n = 13)

n

%

GENOTÝP I1 (n = 2)

n

0

0

0

0

0

0

0

V173L

0

0

0

L180M

0

0

0

A181T

0

0

0

T184S

0

0

0

M204V

0

0

0

M204I

1

0

0

M204S

0

0

0

Q215S

0

0

0

Tổng

2

1,92

1,92

3,84

Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine
trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84%
(2/67). Các đột biến kháng lamivudine đều
của genotýp B và không thấy xuất hiện đột
biến kháng lamivudine của HBV genotýp C
trong 67 chủng HBV nghiên cứu. Một chủng
HBV genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD
tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT. Axít
amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT
là methionine được thay thế bằng aa isoleucin
và bộ tứ aa YMDD (tyrosine-methionineaspartate-aspartate) chuyển thành YIDD.
Với cơ chế đột biến M204I. Đây là đột biến

%

0

kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue,
ngoài kháng lamivudine, chủng virut này
có thể kháng cả 2 thuốc là telbivudine và
telnofovir. Đây là 2 thuốc được sử dụng khá
phổ biến trong điều trị trên thế giới, nhưng
hiện chưa được sử dụng nhiều tại Việt Nam.
Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột
biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT,

aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng
aa isoleucin. Như vậy, chủng này sẽ chỉ
kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế
đột biến L80I.

61


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
Bảng 5: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với adefovir.
VỊ TRÍ
ĐỘT
BIẾN

GENOTÝP
B4 (n = 52)

n

%

GENOTÝP
C1 (n = 13)

n

%

GENOTÝP

I1 (n = 2)

n

V84M

0

0

0

S85A

0

0

0

A181V

0

0

0

A181T

0

0

0

V214A

0

0

0

Q215S

0

0

0

N236T

0

0

0

N238D

0

0

0

Tổng

0

0

0

%

Bảng 6: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với entercavir.
VỊ TRÍ
ĐỘT
BIẾN

GENOTÝP
B4 (n = 52)

n

%

GENOTÝP
C1 (n = 13)

n

%

GENOTÝP
I1 (n = 2)

n

I169T

0

0

0

V173L

0

0

0

L180M

0

0

0

T184G

0

0

0

S202I

0

0

0

M204V

0

0

0

M250V

0

0

0

Tổng

0

0

0

n

%

C1 (n = 13)
n

%

L180M

0

0

0

A194T

0

0

0

M204I

1

0

0

V214A

0

0

0

Q215S

0

0

0

Tổng

1

0

0

1,92

1,92

KẾT LUẬN
- Tỷ lệ nhiễm HBV ở 633 đối tượng
(TCMT = 492 và GMD = 141) ở Hải Phòng
là 10,59% (67/633), trong đó, đối tượng
TCMT là 10,67% và GMD 10,64%. Genotýp
phổ biến trên nhóm đối tượng nghiên cứu
này là genotýp B (B4 là 77,61%); tiếp theo
là genotýp C (C1: 19,4%) và genotýp I (I1:
2,99%).

I1 (n = 2)
n

Sự xuất hiện đột biến tự nhiên tại vị trí
aa 204 vùng gen Pol-RT theo kiểu YIDD là
một yếu tố quan trọng để cảnh báo nguy cơ
bệnh nhân được điều trị trên lâm sàng sẽ
thất bại với thuốc lamivudine và thậm chí
cả với telbivudine và tenofovir ngay từ lần
điều trị đầu tiên. Do vậy, vấn đề thầy thuốc
lâm sàng chỉ định làm xét nghiệm phát hiện
đột biến kháng thuốc nhằm lựa chọn thuốc
điều trị hợp lý và tiên lượng hiệu quả điều
trị cho người bệnh cần đặt ra sớm, điều này
sẽ tiết kiệm được thời gian, chi phí điều trị
và đảm bảo phác đồ điều trị cho bệnh nhân
tối ưu nhất.

%

Bảng 7: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với tenofovir.
B4 (n = 52)

Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir
và entercavir trong 67 chủng HBV nghiên
cứu là 0% (0/67), tỷ lệ đột biến gen kháng
thuốc tenofovir là 1,92% (1/67).

%

- Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine

trong 67 chủng HBV được giải trình tự gen
là 3,84% (2/67), tất cả là HBV genotýp B,
không thấy xuất hiện đột biến kháng thuốc
của các chủng genotýp C. Xuất hiện một
chủng đột biến tại vị trí aa 80 của vùng Pol-RT
(L80I) và một chủng có đột biến kiểu YMDD
tại vị trí aa 204 của vùng Pol-RT (M204I).
Với đột biến M204I, bộ tứ aa là YMDD đổi
thành YIDD và chủng virut này kháng cả
lamivudine, telbivudine và telnofovir. Tỷ lệ đột
biến gen kháng thuốc adeforvir và entercavir
trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 0%.

62


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyen HC, Ishizaki A, Phan TTC, Hoang
TTH, Nguyen VT, Tanimoto T, Lihana PW,
Matsushita K, Bi X, Pham VT, Ichimura H.
Prevalence of HBV infection among different
HIV-risk groups in Hai Phong, Vietnam. J Med
Virol. 2011, 83, pp.399-404.
2. Zoulim F, Locarnini S. Hepatitis B virus
resistance to nucleos(t)ide analogues. Gastroenterolgy
2009, Nov, 137 (5), pp.1593-608.
3. Kobayashi M, Suzuki F. Response to longterm lamivudine treatment in patients infected
with hepatitis B virus genotypes A, B and C.
J Med Virol. 2006, 78 (10), pp.1276-1283.

4. Kumar M, Satapathy S, Monga R. A
randomized controlled trial of lamivudine to treat
acute hepatitis B. Hepatology. 2007, 45 (1),
pp.97-101.

5. Wen X, Li X, Xie H. Lamivudine for acute
hepatitis B infection. Hepatology in AASLD
practice, Guideline. 2007.
6. Tran Thien Tuan Huy, Hiroshi Ushijima et al.
Characteristics of core promoter and Precore stop
codon mutants of hepatitis B virrus in Vietnam.
J of Med Virology. 2007, 74, pp.228-236.
7. Bui Xuan Truong, Yoshihiko Yano, Yasushi
Seo et al. Variations in the core promoter/precore region in HBV genotype C in Japanese and
Northern Vietnamese patients. J of Med Virology.
79, pp.1293-1304.
8. Saul Krugman, M.D et al. Hepatitis B
infection: Strategies for clinicians. Infections in
medicine. New York University Medical Center.
2008, pp.5-30.
9. Kao JH, Chen DS. Global control of hepatitis
B virus infection. Lancet Infect Dis. 2009, Jul, 2 (7),
pp.395-403. Review.

63


TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6 - 2013

64