Phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN AFZELIN
TỪ DƢỢC LIỆU
Võ Thanh Hóa*, Nguyễn Minh Đức**.

TÓM TẮT
Mở đầu – mục tiêu: Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như Đạm trúc diệp, Tầm gửi,
Rau cần< Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho c{c dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin. Tuy nhiên, chuẩn
afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo
dài. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu.
Phương ph{p nghiên cứu: Sàng lọc dược liệu có chứa afzelin bằng HPLC-MS. Lựa chọn dược liệu. Chiết
cao chiết toàn phần và tách c{c ph}n đoạn đơn giản bằng chiết phân bố giữ nước v| c{c dung môi có độ phân cực
khác nhau. Phân lập afzelin bằng sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột pha đảo. Cấu trúc afzelin phân lập được x{c định
bằng phổ UV, IR, MS và NMR. Thẩm định và thiết lập chất chuẩn afzelin.
Kết quả: Nghiên cứu đã s|ng lọc được c{c dược liệu có chứa afzelin: Cần nước, Tầm gửi, Đạm túc diệp, lá
Bơ v| Sầu đ}u. Lựa chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin. Từ 15 kg l{ Bơ khô ph}n lập được 1,2 g afzelin
từ l{ Bơ Folia Perseae v| đã tiến h|nh đóng 100 lọ (10 mg/ lọ) với số lô AFZ-001-0914 với độ tinh khiết 94,31%
tính theo nguyên trạng. Thết lập afzelin đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc theo ISO Guide 35.
Kết luận: Quy trình khảo sát sàng lọc dược liệu và phân lập afzelin đơn giản, hiệu quả. Afzelin phân lập
được thiết lập thành chất chuẩn theo tiêu chí chuẩn gốc. Có thể sẵn s|ng để ứng dụng vào công tác nghiệm dược
liệu.
Từ khóa: Folia Perseae, afzelin, thiết lập chất chuẩn

ABSTRACT
ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD AFZELIN
FROM HERBAL MEDICINES
Vo Thanh Hoa, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 307 - 314

Introduction - objectives: Afzelin is used as a marker for the quality control of some herbal medicine.
However, afzelin standard has not been available in Vietnam and it took a high cost and long time for ordering
from foreign countries. So the aim of this study was to develop a protocol to isolate and establish afzelin as
reference standard.
Methods: Herbal medicines containing afzelin were selected by sreening on HPLC-MS method. Ethanolic
extract of herbal medicine was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds.
Isolations were carried out by common and popular phytochemical methods. Structures of isolated compounds
were deduced by means of UV, IR, MS and NMR spectroscopy. Quantitative analysis was validated and isolated
afzelin was established as reference standard.
Results: Five herbal medicines containing afzelin were invesgated such as Mistletoe (Loranthus chinensis),
Avocado (Persea americana) leaves, Water dropwort (Oenanthe stolinefera), China tree (Azadirachta indica) and
* Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y DƣợcThành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Võ Thanh Hóa
ĐT: 0986414064

Chuyên Đề Dƣợc

** Khoa Dƣợc, Đại học Tôn Đức Thắng
Email:

307


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Cow grass (Lophatherum gracile). Avocado leaves were selected to isolate afzelin. 1,2 g of afzelin was isolated from
avocado leaves and packed into 100 vials (10 mg/ vial) with batch number: AFZ-001-0914 and a content of
94,31%. Isolated afzelin was established as reference standard based on ISO Guide 35.

Conclusions: The methods of invesgation and isolation were simple, effective. Isolated afzelin was established
as primary standard. It could be used for controlling the quality of some herbal medicines.
Keywords: Folia Perseae, afzelin, establishment of reference standard.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, Việt Nam đang sử dụng rất nhiều
dƣợc liệu để bảo vệ, chăm sóc sức khỏe ngƣời
dân. Tuy nhiên, nhiều trong số c{c dƣợc liệu này
nhƣ Tang ký sinh, Đạm trúc diệp... chƣa có hoặc
có tiêu chuẩn nhƣng chƣa có tiêu chuẩn về hàm
lƣợng. Điều n|y g}y khó khăn cho công t{c đảm
bào chất lƣợng dƣợc liệu. Vì vậy, điều cần thiết
là phải xây dựng tiêu chuẩn đầy đủ cho c{c dƣợc
liệu này. Tuy nhiên, các chất điểm chỉ chính có
trong c{c dƣợc liệu n|y nhƣ afzelin lại không có
trên thị trƣờng Việt Nam, nếu mua từ nƣớc
ngoài lại mất thời gian và giá thành cao, đôi khi
không có. Do đó, đề t|i đƣợc thực hiện nhằm
phân lập và thiết lập chất chuẩn gốc afzelin theo
hƣớng dẫn của ISO Guide 35 để phục vụ cho
công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu.

Điều kiện khai triển: Cột: Agilent C18, 250 x
4,6 mm, 5 µm; Nhiệt độ cột: 30 oC; Đầu dò: UV 265
nm; MS 6120, kỹ thuật ESI, bắn phá ion âm, dạng
ion phân tử thu đƣợc [M-H]-; Thể tích tiêm mẫu:
20 µl; Pha động:Acetonitril (A) – Nƣớc (B), rửa
giải gradient; Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút; Thời
gian phân tích: 20 phút; Ghi nhận các ion phân
tử của các chất trong khoảng: 300 – 500 m/ z. So

sánh phổ MS của các chất ghi nhận đƣợc với phổ
MS chuẩn của afzelin trong thƣ viện phổ. Xác
định mẫu dƣợc liệu có chứa afzelin.
Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin
Tiêu chí chọn dƣợc liệu: Dƣợc liệu có chứa
afzelin; nguồn cung cấp dƣợc liệu dồi dào; dễ
thu hái và xử lý mẫu; ngoài afzelin, ít chứa các
polyphenol khác.

Phân lập afzelin

ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU

Chiết xuất

Đối tƣợng nghiên cứu

Dƣợc liệu đƣợc chọn đƣợc chiết bằng
phƣơng ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 70%,
dịch chiết đƣợc cô thu hồi dung môi thu đƣợc
cao cồn 70%.

Dƣợc liệu Đạm trúc diệp đƣợc cung cấp bởi
nhà thuốc T}n Nam Xƣơng, Quận 8, TP HCM; lá
Bơ v| Tầm gửi thu hái tại Buôn Hồ, Đắk Lắk;
Cần nƣớc thu hái tại Hoóc Môn, TP HCM; lá Sầu
đ}u thu h{i tại Rạch giá, Kiên Giang.
Phƣơng ph{p nghiên cứu

Khảo s{t dược liệu chứa afzelin

Cao cồn đƣợc ph}n t{n v|o nƣớc, tiến hành
lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (60-90 oC)
v| ethyl acetat. Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô
thu hồi dung môi đƣợc cao EA.

Xử lý mẫu bằng SPE

Phân lập bằng sắc ký cột

Bột dƣợc liệu (1 g) đƣợc chiết siêu âm trong
30 phút với 30 ml MeOH (2 lần). Lọc dịch chiết,
cô đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nƣớc cất x 2 lần.
Tiến hành nạp mẫu và khai triển cột SPE (C18E
500 mg, 6 ml, 55 µm (Phenomenex) với vệ dung
môi methanol – nƣớc, tỷ lệ methanol tăng dần.
Kiểm tra ph}n đoạn bằng HPLC-MS để phát
hiện sự có mặt của afzelin.

C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập các chất
bằng phƣơng ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng
silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck);
hệ dung môi đã khảo sát bằng phƣơng ph{p sắc
ký lớp mỏng (SKLM). Tiến hành khai triển sắc
ký cột v| theo dõi c{c ph}n đoạn bằng SKLM.
Dựa vào kết quả SKLM để gom ph}n đoạn.

308

Sắc ký HPLC điều chế

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Hệ thống sắc ký
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật). Cột:
Discovery HS C18 (250 × 21,2 mm, 10 µm). Nhiệt
độ: Nhiệt độ phòng. Tốc độ dòng: 10 ml/phút. Thể
tích bơm: 10 ml. Phát hiện: UV 265 nm. Pha động:
methanol – nƣớc (45 : 55). Dung môi pha mẫu: Pha
động. Nồng độ mẫu: 60 mg/ml.
Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập bằng HPLC
Điều kiện phân tích: Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5
µm. Pha động: acetonitril (A) – nƣớc (B), rửa giải
gradient: 0 phút 25% A, 30 phút 30% A, 31 – 35
phút: 25% A. Tốc độ dòng: 0,75 ml/ phút. Đầu
dò: PDA. Bƣớc sóng phát hiện: 265 nm. Thời
gian phân tích: 25 phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
X{c định cấu trúc của hợp chất phân lập được
Tiến h|nh x{c định cấu trúc của hợp chất
phân lập đƣợc bằng c{c phƣơng ph{p phổ
nghiệm UV, MS, IR và NMR.

Thiết lập chất chuẩn afzelin theo ISO
Guide(2-4)
Độ ẩm
Đo
bằng

phƣơng
(Thermogravimetric Analysis).

ph{p

TGA

Định tính v| x{c định cấu trúc
X{c định cấu trúc bằng c{c phƣơng ph{p
phổ UV - Vis, IR, NMR và MS.
Tạp chất liên quan
Tiến hành kiểm tra bằng HPLC với quy trình
đã thẩm định.
Điều kiện sắc ký: Cột: Phenomenex C18
(250x4,6 mm,5 µm); Pha động: acetonitril – nƣớc
(30:70); Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; Detector: UV 265
nm; Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; Thể tích bơm: 10 µl;
Dung môi pha mẫu: Pha động; Nồng độ mẫu: 300
ppm/ ml.
Tiến hành phân tích với thời gian sắc ký gấp
đôi thời gian lƣu của pic chính trong sắc ký đồ
thu đƣợc từ dung dịch thử. X{c định tạp chất
liên quan dựa trên tổng tạp, loại những pic có

Chuyên Đề Dƣợc

Nghiên cứu Y học

chiều cao nhỏ hơn ba lần độ nhiễu đƣờng nền và
các pic có trong mẫu trắng.

Yêu cầu
Tổng h|m lƣợng tạp chất có trong mẫu tính
theo phần trăm diện tích pic nhỏ hơn 2%.
Định lượng chất chuẩn afzelin

Định lƣợng afzelin theo phƣơng ph{p
quy về 100% diện tích pic.
Thẩm định quy trình định lƣợng theo
hƣớng dẫn của ICH (The International
Conference on Harmonisation of Technical
Requirement
for
Registration
of
Pharmaceuticals for Human Use), bao gồm
các chỉ tiêu: Tính tƣơng thích hệ thống, tính
đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại.
Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng nhất lô trong quá trình
đóng gói
Afzelin đƣợc đóng th|nh 100 lọ nhỏ (10
mg/lọ), sử dụng lọ thủy tinh nâu và hàn kín có
lớp đệm. Đóng lọ trong Glove-Box, nạp khí nitơ
99,99%, độ ẩm trong buồng xấp xỉ 10%.
Lấy ngẫu nhiên 11 lọ (g =
+1) để đ{nh
gi{ đồng nhất lô trong qu{ trình đóng gói, mỗi
lọ kiểm tra 2 lần. Đ{nh gi{ kết quả theo ISO
Guide 35.
Đ{nh gi{ chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm
Afzelin sau khi đƣợc đóng gói v| đánh giá

đồng nhất lô đạt yêu cầu đƣợc lấy ngẫu nhiên và
tiến h|nh định lƣợng tại hai phòng thí nghiệm
độc lập đạt GLP, trong đó có ít nhất một phòng
thí nghiệm có đủ thẩm quyền v| có ý nghĩa ph{p
lý đối với Việt Nam. Mỗi phòng thí nghiệm định
lƣợng 6 lọ. Tính thống kê kết quả từ 2 phòng thí
nghiệm theo Anova (n = 12). Nếu Ftn ≤ Ftc, kết quả
trung bình của 2 phòng thí nghiệm khác nhau
không có ý nghĩa, phƣơng ph{p ph}n tích có độ
lặp cao, h|m lƣợng chất chuẩn không phụ thuộc
vào phòng thí nghiệm tham gia đ{nh giá.
Hai phòng thí nghiệm đạt GLP tham gia
thẩm định chất chuẩn afzelin:

309


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu,
Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM(PTN1).
Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Viện Kiểm
nghiệm thuốc TP HCM (PTN2).
X{c định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo v| gi{
trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm
Tiến h|nh x{c định giá trị công bố trên phiếu
kiểm nghiệm khi kết quả đ{nh gi{ liên phòng thí
nghiệm đạt yêu cầu (Ftn≤ Ftc). Gía trị ấn định x*(n)

để đ{nh gi{ từng kết quả phân tích theo test-z,
loại bỏ các kết quả tính có
; chọn các giá
trị

, tính giá trị trung bình.

KẾT QUẢ
Phân lập afzelin

Xử lý mẫu bằng SPE
Mẫu: 200 mg bột dƣợc liệu. Xử lý mẫu và
khai triển cột SPE theo quy trình. Thu phân
đoạn methanol 50%. Kiểm tra sự có mặt
afzelin trong c{c ph}n đoạn n|y đƣợc phân
tích bằng HPLC-MS. Kết quả: X{c định mẫu
dƣợc liệu l{ Bơ, Tầm gửi, Đạm trúc diệp, Cần
nƣớc, Sầu đ}u có chứa afzelin.
Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin
Từ tiêu chí chọn dƣợc liệu, chọn l{ Bơ l|m
nguyên liệu phân lập afzelin.
Chiết xuất
Từ 15 kg l{ Bơ khô, chiết ngấm kiệt đƣợc 1,2
kg cao cồn 70%. Từ 1,2 kg cao cồn 70% phân tán
v|o nƣớc, tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với

ether dầu hỏa (60-90 oC) và ethyl acetat. Thu
ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi
đƣợc 200 g cao EA.

Phân lập bằng sắc ký cột
Sắc ký cột silica gel: Từ 80 g cao EA, tiến hành
sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ether dầu
hỏa – ethyl acetat, tăng dần tỷ lệ ethyl acetat với
c{c ph}n đoạn. Thu đƣợc 4 ph}n đoạn, trong đó
có ph}n đoạn 2 tƣơng ứng với hệ dung môi
ether dầu hỏa – ethyl acetat (25 : 75) có 3 vết
chính trên SKLM. Cô thu hồi dung môi phân
đoạn 2 đƣợc 5,3 g cao PĐ 2.
Phân lập bằng PLC điều chế
Tiến hành phân lập các chất trong PĐ 2 bằng
HPLC điều chế. Thu lấy chất tƣơng ứng với đỉnh
ở thời gian lƣu l| 32 phút. Cô thu hồi dung môi
đƣợc hợp chất tƣơng ứng là PA.
Tiến h|nh điều chế với 5 g PĐ 2. Thu đƣợc
1,2 g hợp chất PA.
Hợp chất PA cho một pic tại thời gian lƣu tR
= 18,5 phút trên sắc ký đồ ở bƣớc sóng 265 nm.
Và trên sắc ký đồ 3D, hợp chất PA gần nhƣ
không xuất hiện các pic khác ở c{c bƣớc sóng
khác.

X{c định cấu trúc của PA
Tiến h|nh đo phổ UV, MS, IR và NMR, dựa
v|o c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm x{c định đƣợc
PA là afzelin.

Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất PA bằng HPLC phân tích

Hình 1: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất PA

310

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Phổ IR

Hình 2: Phổ IR của hợp chất PA
Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở
Hình 2.
Phổ UV – Vis của hợp chất PA có đỉnh hấp
thu đặc trƣng ở 265 nm và 345 nm (Hình 3).
Phổ IR (KBr) của hợp chất PA có νmax: 1656;
1608; 1500; 1452; 1364; 1296; 1176; 1061; 833 cm-1.
Phù hợp với phổ của afzelin.
Phổ MS
Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở
Hình 4.
Phổ ESI/MS của hợp chất PA cho pic ion m/ z
= 455 [M + Na]+. Phù hợp với công thức phân tử
C21H20O10, Δ = 12.
Phổ NMR

Hình 3: Phổ UV của hợp chất PA

Chuyên Đề Dƣợc

Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của PA
điều chế hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ 13CNMR và 1H-NMR của afzelin theo tài liệu tham
khảo (TLTK) số 1 (Bảng 1)

311


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Hình 4: Phổ HR-MS của hợp chất PA
Bảng 1: So sánh phổ NMR của PA với phổ NMR của afzelin theo TLTK(1)
Hợp chất PA (500 MHz, δ = ppm CD3OD)
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1ʹ
2ʹ
3ʹ
4ʹ
5ʹ

6ʹ
1ʹʹ
2ʹʹ
3ʹʹ
4ʹʹ
5ʹʹ
6ʹʹ

312

C, ppm
158,5
136,2
179,6
163,2
99,8
165,9
94,8
158,5
105,9
122,6
131,9
116,5
161,6
116,5
131,9
103,5
71,9
72,0
73,2

72,1
17,7

H, ppm

6,20 (1H,d, J = 1,5 Hz)
6,37 (1H, d, J= 1,5 Hz)

7,76 (1H, d, J = 9,0 Hz)
6,93 (1H, d, J = 9,0 Hz)
6,93 (1H, d, J = 9,0 Hz)
7,76 (1H, d, J = 9,0 Hz)
5,37 (1H, d, J = 1,5 Hz)

0,92 (3H, d, J = 6,0 Hz)

Afzelin (500 MHz, δ = ppm, DMSO)
C, ppm
158,0
134,9
178,4
161,9
99,4
164,1
94,3
157,2
104,7
121,7
131,3
116,3

160,6
116,3
131,3
102,5
70,8
71,0
71,8
71,3
18,2

H, ppm

6,20 (1H, d, J = 2,0 Hz)
6,50 (1H, d, J = 2,0 Hz)

7,76 (1H, d, J = 7,3 Hz)
6,92 (1H, d, J = 7,3 Hz)
6,92 (1H, d, J = 7,3 Hz)
7,76 (1H, d, J = 7,3 Hz)
5,29 (1H, brs)

0,80 (3H, d, J = 6,0 Hz)

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
Sr
n

Nghiên cứu Y học

= 0,018 < µbb = 0,056

Kết luận: Các lọ afzelin đồng nhất trong quá
trình đóng gói.
Bảng 3: Kết quả định lượng afzelin đ{nh gi{ đồng
nhất lô

Hình 5: Công thức cấu tạo của afzelin
Sự trùng khớp phổ NMR và các dữ liệu phổ
UV, IR, MS xác nhận hợp chất PA phân lập đƣợc
là afzelin. (Hình 5)

STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Lần 1 (%)
99,09
99,11
98,93

99,13
99,00
99,12
98,94
98,92
99,11
99,08

Lần 2 (%)
99,13
99,09
99,01
98,99
99,10
98,99
99,02
98,90
99,09
99,11

Tạp chất liên quan

Đ{nh gi{ chất chuẩn afzelin điều chế thông qua
liên phòng thí nghiệm

H|m lƣợng tạp có trong afzelin điều
chế tính theo phần trăm diện tích pic là
0,9% < 2%.

Bảng 4: Kết quả định lượng (%) afzelin tại hai phòng

thí nghiệm

Định lƣợng afzelin điều chế bằng phƣơng
pháp HPLC
Tiến h|nh định lƣợng theo quy trình đã
xây dựng và thẩm định nhƣ trên mục
Phƣơng ph{p nghiên cứu. Kết quả thẩm
định phƣơng ph{p v| kết quả định lƣợng
đƣợc tóm tắt trong Bảng 2.
Bảng 2: Bảng kết quả thẩm định quy trình
định lượng
Chỉ tiêu

Thông số - Giá trị

Tính tương thích hệ thống

RSD(tR) = 0,468% < 2%
RSD(S) = 1,85% < 2%

Tính đặc hiệu

Đạt

Tính tuyến tính

ŷ = 136941x – 581330

Độ lặp lại

RSD = 0,071% <2%

Kết quả: H|m lƣợng trung bình của afzelin
là 94,31 % (n = 6) tính trên khan.
Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng nhất lô trong quá
trình đóng gói
Theo hƣớng dẫn ISO Guide 35, tiến hành
ph}n tích phƣơng sai một yếu tố theo ANOVA,
ta có:

Chuyên Đề Dƣợc

Mẫu
1
2
3
4
5
6
Trung bình
PTN1 99,02 99,00 98,93 98,94 99,11 99,13
99,02
PTN2 99,17 99,09 99,14 99,22 99,02 99,08
99,12

Tiến h|nh ph}n tích phƣơng sai một yếu tố
theo ANOVA ta có F = 4,7961 < F0,05 = 4,9646.
Kết luận: Kết quả trung bình của hai phòng
thí nghiệm kh{c nhau không có ý nghĩa, phƣơng
ph{p ph}n tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết

afzelin phân lập không phụ thuộc vào phòng thí
nghiệm tham gia đ{nh gi{.
Xác định giá trị ấn định
Sau 2 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi
(0,101) khi đó gi{ trị x* mới đƣợc chọn là
99,072%.
Loại các kết quả có z – score > 2, tính trung
bình các kết quả còn lại, thu đƣợc kết quả nhƣ
sau: Độ tinh khiết trung bình: 99,072% (n = 12),
độ lệch s: 0,089, độ không đảm bảo đo µ: 0,036.
Kết luận: Hợp chất afzelin phân lập đạt đầy
đủ yêu cầu của chuẩn gốc với h|m lƣợng đƣợc
x{c định là 99,07% (n = 12, s = 0,089, µ = 0,036).
Tƣơng ứng với 94,31% tính theo nguyên trạng.

313


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Bảng 5: Kết quả tính giá trị ấn định h|m lượng (%)
afzelin
δ = 1,5 x s*
x* - δ
x* + δ
Trung bình
Độ lệch s
x* mới

s* mới

x*(0)
99,071
0,090
99,085
0,096

x*(1)
0,145
98,94
99,23
99,072
0,089
99,072
0,101

x*(2)
0,151
98,921
99,223
99,072
0,089
99,072
0,101

BÀN LUẬN
Do không có chuẩn afzelin để đối chiếu
nên các hợp chất điều chế được tiến hành kiểm
tra độ tinh khiết và sử dụng các phương pháp

phổ nghiệm để biện giải cấu trúc. Từ đó, xác
định trong các hợp chất điều chế được, hợp
chất nào là afzelin.
Mặc khác, các dự liệu phổ của các hợp chất
điều chế được sẽ được sử dụng làm phổ dữ liệu
chuẩn sau này.
Việc đánh giá đồng nhất lọ bao gồm đánh
giá đồng nhất trong cùng 1 lọ và đánh giá
đồng nhất giữa các lọ trong cùng 1 lô. Tuy
nhiên, các chất điều chế được đóng thành các
lọ với khối lượng nhỏ 10 mg để dùng một lần
nên không cần đánh giá đồng nhất trong cùng
1 lọ.
Có hai phương pháp đánh giá đồng nhất
giữa các lọ trong cùng 1 lô là ANOVA và ISO
Guide 35. Tuy nhiên, phương pháp sử dụng
trong ISO Guide 35 đã bao gồm phép đánh giá

314

ANOVA một yếu tố nên quy trình đánh giá sẽ
chặt chẽ hơn. Do đó, nghiên cứu này chọn cách
đánh giá đồng nhất giữa các lọ trong cùng 1 lô
theo ISO Guide 35.

KẾT LUẬN
Bằng phƣơng ph{p HPLC-MS, nghiên cứu
đã khảo s{t đƣợc một số dƣợc liệu có chứa
afzelin nhƣ l{ Bơ, Cần nƣớc, Sầu đ}u, Tầm gửi,
Đạm trúc diệp. Những dƣợc liệu này có thể

đƣợc dùng làm nguyên liệu phân lập afzelin. Lá
Bơ đƣợc chọn làm nguyên liệu phân lập afzelin
trong nghiên cứu n|y. 1,2 g afzelin đã đƣợc phân
lập từ 15 kg l{ Bơ khô. Quy trình phân lập hiệu
quả. Tiến hành thiết lập chất chuẩn afzelin theo
hƣớng dẫn của ISO Guide 35. Kết quả cho thấy:
Chất chuẩn afzelin điều chế đạt yêu cầu chất
chuẩn gốc với h|m lƣợng đƣợc x{c định là
94,31% tính trên nguyên trạng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.

Chang SW et al (2009), “Phytochemical constituents of Bistorta
manshuriensis”, Natural Product Sciences, 15(4), 234-240.
ISO 13528:2005, Statistical methods for use in proficiency testing
byinterlaboratory comparisons, 2005.
ISO Guide 34:2009, General requirements for the competence of
referencematerial producers, 2009.
ISO Guide 35:2006, Reference materials - General and statistical
principlesfor certification, 2006.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

Chuyên Đề Dƣợc