Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá chùm ngây (moringa oleifera lam.) phòng ngừa tổn thương do rƣợu gây ra trên dòng tế bào HEPG2

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN
CỦA LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.)
PHÒNG NGỪA TỔN THƢƠNG DO RƢỢU
GÂY RA TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2
Đỗ Thị Hồng Tươi*, Trần Nguyễn Thủy Tiên*, Nguyễn Hoàng Quân*,Dương Thị Mộng Ngọc*

TÓM TẮT
Mở đầu: Chùm ngây chứa nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa, đặc biệt là isoquercitrin. Đề t|i n|y “Khảo
sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thương do rượu gây ra
trên dòng tế b|o HepG2”.
Phương pháp: HepG2 nuôi cấy trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100
IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin. Xử lý tế bào với isoquercitrin (IQ), cao ethyl acetat (EC), cao cồn 70%
(CC) từ lá Chùm ngây với h|m lượng isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml (ký hiệu NĐ1, NĐ2, NĐ3) có/không bổ
sung ethanol 100 mM trong 24 giờ. Đ{nh gi{ t{c dụng bảo vệ gan phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào (test
MTT), tích lũy lipid (nhuộm dầu đ O), hoại tử tế bào (test LDH), tình trạng stress oxy hóa qua lượng glutathion
nội bào, hoạt hóa apoptosis (nhuộm AO/EB, định lượng ADN phân mảnh v| điện di ADN trên gel).
Kết quả: Sau 24 giờ, so với mẫu sinh lý, ethanol 100 mM làm giảm 25,6% tỷ lệ sống của tế bào HepG2,
31,3% h|m lượng GSH v| l|m tăng 39,4% lượng lipid nội bào, 30% hoạt tính LDH ngoại b|o v| 65,2% lượng
ADN phân mảnh. Cả 3 mẫu thử từ l{ Chùm ng}y đều thể hiện tác dụng phòng sự ức chế tăng trưởng ở 3 nồng
độ khảo sát với hiệu quả khoảng 42 - 250%. Bổ sung IQ và EC ở NĐ2, NĐ3 giúp tăng lượng GSH trong tế bào
HepG2 so với mẫu ethanol một mình với hiệu quả 100 - 173%. Tác dụng gây hoại tử tế bào của ethanol 100 mM
giảm khoảng 77 - 170% khi bổ sung EC, CC ở 3 nồng độ và IQ ở NĐ2. Đối với apoptosis, tỷ lệ ADN phân mảnh
giảm 70 - 100% khi bổ sung IQ ở 3 nồng độ, EC và CC ở NĐ3. Kết quả này phù hợp với hình ảnh nhuộm
AO/EB v| điện di ADN trên gel agarose.
Kết luận: Các mẫu thử từ l{ Chùm ng}y, đặc biệt là cao ethyl acetat có tác dụng phòng ngừa tổn thương tế
bào gan HepG2 do ethanol 100 mM gây ra sau 24 giờ. Như vậy, có thể nghiên cứu phát triển thuốc từ lá Chùm
ng}y để phòng và/hoặc điều trị bệnh gan nói chung v| do rượu nói riêng.

Từ khóa: Chùm ngây, bảo vệ tế b|o gan, rượu, dòng tế bào HepG2.

ABSTRACT
STUDY ON HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF MORINGA OLEIFERA LAM.
TO PREVENT HEPATOCYTE ALCOHOL-INDUCED LESSON IN HEPG2 CELL LINE
Do Thi Hong Tuoi, Tran Nguyen Thuy Tien, Nguyen Hoang Quan, Duong Thi Mong Ngoc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 359 - 367
Background: Moringa oleifera Lam. is rich of strong antioxidant reagents, especially isoquercitrin. This
work has studied on effect of M. oleifera Lam. leaves to prevent alcohol-induced hepatotoxicity in HepG2 cell line.
Methods: HepG2 cells were cultured in EMEM supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100
IU/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Cells were treated with 3 different samples including isoquercitrin
(IQ), ethyl acetate (EC) or 70% ethanolic extracts (CC) from M. oleifera Lam. leaves at concentrations
*

Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tƣơi
ĐT: 0908683080

Chuyên Đề Dƣợc

Email:

359


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

corresponding to that of isoquercitrin at 2.5, 5, 10 μg/ml (NĐ1, NĐ2 and NĐ3, respectively) alone or combined

with 100 mM ethanol for 24h. Hepatoprotective effect was evaluated through several assays including cell
proliferation (MTT test), lipid accumulation (O red oil staining), necrosis (LDH test), oxydant stress (cellular
glutathione content) and apoptosis activation (AO/EB staining, DNA fragmentation).
Results: After 24 hours, ethanol 100 mM decreased 25.6% cell viability and 31.3% GSH content, on the
other hand, increased 39.4% lipid accumulation, 30% extracellular LDH activity and 65.2% DNA fragmentation
compared to control. All of 3 samples IQ, EC and CC from Moringa leaves have been shown prevention of
antiproliferation at 3 tested concentrations with efficiency of 42-250%. The addition of IQ, EC at NĐ2, NĐ3
inscreased 100 - 173% of intracellular GSH level. Necrotic effect of 100 mM ethanol was decreased 77-170% in
presence of EC, CC at 3 tested concentrations and IQ at NĐ2. For apoptosis, DNA fragmentation was decreased
70 - 100% in presence of IQ at 3 tested concentrations, EC and CC at NĐ3 compared to ethanol alone. This result
corresponded to AO/EB staining and agarose gel electrophoresis.
Conclusion: Three samples from M. oleifera Lam. Leaf, especially ethyl acetate extract were shown to
prevent HepG2 cells injury induced by 100 mM ethanol treatment for 24h. Therefore, M. oleifera Lam. leaf
could be studied to develop drugs for prevention and/or treatment of liver diseases in general and alcoholic
liver diseases in particular.
Key words: Moringa oleifera Lam, hepatoprotective effect, alcohol, HepG2 cell line.
Lam.) có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan
ĐẶT VẤN ĐỀ
trên chuột nhắt trắng(12). Tuy nhiên, chƣa có
Gần đ}y, tỷ lệ ngƣời Việt Nam mắc bệnh gan
nghiên cứu sàng lọc một cách hệ thống ở cấp độ
nói chung và bệnh gan do rƣợu nói riêng ngày
tế b|o để chứng minh cơ sở khoa học một cách
c|ng tăng. Một trong những nguyên nhân chính
đầy đủ về tác dụng của dƣợc liệu này. Gần đ}y,
là do tình trạng lạm dụng rƣợu bia. Tỷ lệ lạm
nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã x}y dựng
dụng và nghiện rƣợu tại thành phố là trên 10%
đƣợc mô hình in vitro sử dụng dòng tế bào gan
và ở vùng núi khoảng 17%, đa số là nam giới ở

HepG2 mô phỏng tình trạng tổn thƣơng tế ban
độ tuổi 20-30 tuổi. Ƣớc tính khoảng 5% số dân
gan do rƣợu(3). Đề tài này tiến h|nh “Khảo sát tác
nƣớc ta bị xơ gan, trong đó 65% trƣờng hợp xơ
dụng bảo vệ tế bào gan của lá Chùm ngây
gan do rƣợu.
(Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thƣơng
Các nhóm thuốc hóa tổng hợp hoặc
do rƣợu gây ra trên dòng tế b|o HepG2” với
interferon để kiểm soát các bệnh về gan cho kết
mục tiêu sàng lọc tác dụng bảo vệ tế bào gan của
quả không ổn định, nguy cơ xảy ra tác dụng phụ
cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ
v| gi{ th|nh tƣơng đối đắt. Do vậy, xu hƣớng
lá Chùm ngây trên mô hình mô phỏng tình trạng
hiện nay là phát triển và sử dụng thuốc từ dƣợc
tổn thƣơng tế b|o gan thƣờng gặp trên bệnh
liệu giúp bảo vệ gan trong giai đoạn sớm, điều
nhân bị bệnh gan do rƣợu.
trị bệnh gan kịp thời nhằm cải thiện tiên lƣợng vì
ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
tính an toàn và có thể sử dụng thƣờng xuyên,
Dòng tế bào
lâu dài.
Việt Nam có nguồn dƣợc liệu rất đa dạng,
trong đó nhiều dƣợc liệu đƣợc dùng trị bệnh gan
nhƣ củ Nghệ, Diệp hạ châu... và Chùm ngây với
tác dụng bảo vệ gan đang đƣợc quan tâm nghiên
cứu. Gần đ}y, b{o c{o của Nguyễn Bảo Trân cho
thấy cao cồn từ lá Chùm ngây (Moringa oleifera

360

HepG2 (ATCC HB8065R) hoạt hóa tại Viện
Pasteur TP. Hồ Chí Minh.

Hóa chất
Môi trƣờng EMEM, huyết thanh bào thai bê
(FCS), trypsin-EDTA (Gibco, Mỹ); L-glutamin,
penicilin-streptomycin, albumin huyết thanh bò

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
(BSA), đệm phosphat, trypan blue, ethanol,
MTT, dầu đỏ O, Brilliant G250, L-lactic
dehydrogenase, acid oleic, acid palmitic,
quercetin, isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ), kit
LDH (Roche, Đức), diphenylamin, methanol
(Merck, Đức). Tất cả hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh
khiết cấp độ 1.

Mẫu thử
Isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ): ký hiệu là
IQ, độ tinh khiết ≥ 98%. Cao cồn 70% (CC) và cao
ethyl acetat (EC) từ lá Chùm ngây (Tri Tôn, An
Giang) cung cấp bởi Trung t}m S}m & Dƣợc liệu
Tp. HCM, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Từ thí nghiệm sơ
bộ, chọn 3 nồng độ ứng với h|m lƣợng

isoquercitrin 2,5; 5 v| 10 µg/ml không g}y độc tế
b|o để khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan
HepG2 (Bảng 1).
Bảng 1: Nồng độ khảo sát của các mẫu thử
Cao ethyl acetat
(EC)

Cao cồn
70% (CC)

Hàm lượng isoquercitrin
14,09
2,41
(% kl/kl) trong cao
Độ ẩm của cao (%)
16,18
19,50
Nồng độ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy (µg/ml)
Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70%
Ký hiệu
(IQ)
(EC)
(CC)
NĐ1
2,5 (IQ1)
21,2 (EC1)
128,9 (CC1)
NĐ2
5,0 (IQ2)
42,3 (EC2)

257,7 (CC2)
NĐ3
10,0 (IQ3)
84,7 (EC3)
515,5 (CC3)

Phƣơng pháp nghiên cứu

Nuôi cấy và xử lý tế bào
Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trƣờng
EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100
IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin và ủ ở
37oC, 5% CO2 đến độ phủ 70-80%. Thu v| đếm tế
bào sống với trypan blue, chia v|o đĩa nuôi cấy 6
hoặc 96 giếng với mật độ 2,5 × 104 tế bào/cm2. Ủ
24 giờ ở 37oC, 5% CO2, xử lý tế bào với IQ, EC,
CC tƣơng ứng với isoquercetin 2,5; 5; 10 µg/ml
(ký hiệu: NĐ1, NĐ2, NĐ3) hoặc quercetin 10
µM có hoặc không bổ sung ethanol 100 mM
trong 24 giờ. Nồng độ DMSO cuối cùng trong
môi trƣờng là 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến
tế bào(7). Mẫu chứng bổ sung DMSO với nồng độ
tƣơng đƣơng.

Chuyên Đề Dƣợc

Nghiên cứu Y học

Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng test MTT
Tỷ lệ tế bào sống x{c định qua hoạt tính

enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể
có trong tế bào sống. SDH chuyển MTT [3-(4,5dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium
bromid)] thành formazan tan trong isopropanol
tạo dung dịch tím, OD đo ở 570 nm phản ánh số
lƣợng tế bào sống.
Đánh giá tình trạng tích lũy lipid bằng phương
pháp nhuộm dầu đỏ O
Dầu đỏ O là thuốc nhuộm lipid, di chuyển từ
dung môi vào các hạt mỡ trong tế bào gan làm
chúng có m|u đỏ quan s{t đƣợc dƣới kính hiển
vi quang học. Các hạt mỡ nhuộm dầu đỏ O đƣợc
hòa tan trong isopropanol tạo dung dịch m|u đỏ.
OD đo ở 500 nm phản {nh lƣợng lipid trong tế
bào ở mỗi giếng.
Định lượng glutathion (GSH) nội bào
Sự tăng sinh gốc oxy hóa làm giảm GSH nội
bào. Bổ sung acid tricloroacetic vào dịch ly giải tế
bào, ly tâm lấy dịch trong, thêm EDTAphosphat, ủ 5 phút với thuốc thử Ellman [5,5dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]. Đo OD ở 412
nm. Lƣợng GSH (µM/mg protein) đƣợc tính dựa
theo đƣờng cong chuẩn độ của GSH chuẩn (0 200 µM). Protein toàn phần đƣợc x{c định bằng
phƣơng ph{p Bradford với thuốc nhuộm
Coomassie và mẫu chuẩn albumin huyết thanh
cừu (0 - 4 mg/ml).
Đánh giá tình trạng hoại tử tế bào gan
Tình trạng hoại tử đ{nh gi{ qua hoạt tính
lactat dehydrogenase (LDH) phóng thích vào
môi trƣờng nuôi cấy bằng kit “Cytotoxicity
Detection LDH”. LDH xúc t{c phản ứng kép
chuyển pyruvat thành lactat, tetrazolium màu
v|ng th|nh formazan m|u đỏ, đo OD ở 492 nm.

X{c định hoạt tính LDH dựa v|o đƣờng cong
chuẩn độ (0-1000 mU/ml) của LDH chuẩn.
Đánh giá quá trình apoptosis
Quan sát tế b|o apoptosis dƣới kính hiển
vi huỳnh quang sau khi nhuộm acridin
orange/ethidium bromid. ADN phân mảnh

361


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

đƣợc định lƣợng bằng diphenylamin tạo dung
dịch có m|u đo OD ở 600 nm v| điện di trên
gel agarose 2%.

Hiệu quả phòng ngừa tổn thương tế bào gan
Hiệu quả bảo vệ tế bào gan HepG2 của mẫu
thử phòng ngừa tổn thƣơng do ethanol 100 mM
đƣợc tính theo công thức:
HQ (%) = [(kết quảethanol - kết quảethanol bổ sung mẫu
)/(kết quảethanol - kết quảsinh lý)] x 100

thử

Phân tích kết quả và xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 hoặc 3 lần. Kết
quả trình b|y dƣới dạng trung bình ± sai số

chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM) của 6

mẫu cho một điều kiện nuôi cấy trong một thí
nghiệm đại diện. Sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê khi p < 0,05 với phép kiểm Kruskal-Wallis và
Mann-Whitney trên phần mềm SPSS 20.0.

KẾT QUẢ
Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trƣởng
tế bào
Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng
trƣởng tế bào do rƣợu gây ra của cao cồn 70%,
cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm
ng}y đ{nh gi{ bằng thử nghiệm MTT đƣợc
trình bày trong Bảng 2.

Bảng 2: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ của cao cồn
70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin
OD570 trung bình ± SEM
Ethanol 100 mM (-)
Ethanol 100 mM (+)
Ký hiệu
Isoquercitrin
Cao ethyl
Cao cồn 70%
Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70%
(Nồng độ IQ)
(IQ)
acetat (EC)
(CC)

(IQ)
(EC)
(CC)
##
##
##
NĐ1 (2,5 µg/ml)
0,356 ± 0,018* 0,390 ± 0,010** 0,342 ± 0,021* 0,370 ± 0,016 ** 0,411 ± 0,023 ** 0,326 ± 0,020
#
##
##
NĐ2 (5 µg/ml)
0,373 ± 0,017** 0,371 ± 0,018** 0,386 ± 0,010** 0,304 ± 0,022 0,355 ± 0,013 ** 0,273 ± 0,010 *
##
##
NĐ3 (10 µg/ml) 0,375 ± 0,021** 0,387 ± 0,009** 0,362 ± 0,017* 0,343 ± 0,021 ** 0,382 ± 0,013 ** 0,253 ± 0,019
Chứng
0,297 ± 0,005
0,221 ± 0,019**
#
Quercetin
0,311 ± 0,007
0,261 ± 0,007
NĐ1
196,1
249,6
137,7
% phòng
NĐ2
109,0

176,5
68,9
ngừa so
với mẫu
NĐ3
160,1
211,4
41,9
chứng Quercetin
53,1

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM)

Các mẫu thử riêng lẻ không độc tế bào, 3
nồng độ NĐ1, NĐ2, NĐ3 của các mẫu thử
không thay đổi tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống
kê so với mẫu chứng sinh lý (p > 0,05).
Ethanol 100 mM ức chế sự tăng trƣởng của tế
bào HepG2, làm giảm tế bào sống 25,6% so với
mẫu chứng (p < 0,05). Sự ức chế tăng trƣởng này
đƣợc phòng ngừa khi bổ sung v|o môi trƣờng
nuôi cấy quercetin 10 µM (p < 0,05).
Bổ sung isoquercitrin, cao ethyl acetat và cao
cồn 70% v|o môi trƣờng ở cả 3 nồng độ ứng với
h|m lƣợng isoquercitrin 2,5; 5 và 10 µg/ml làm
tăng tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với
mẫu chứng bệnh xử lý với ethanol 100 mM trong
24 giờ (p < 0,05).

362

Tác dụng phòng ngừa sự tích lũy lipid
Kết quả tác dụng bảo vệ tế bào gan phòng
ngừa sự tích lũy lipid do rƣợu gây ra của cao cồn
70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và
isoquercitrin đƣợc trình bày ở Bảng 3.
Đa số nồng độ khảo sát của mẫu thử riêng
lẻ l|m tăng tích lũy lipid nội bào không có ý
nghĩa thống kê (p > 0,05), chỉ NĐ1 cao ethyl
acetat, NĐ2 isoquercitrin tăng lần lƣợt 10% và
25% so với mẫu sinh lý, NĐ3 cao cồn giảm
16,3% lƣợng lipid (p < 0,05).
Ở mẫu ethanol 100 mM, sau 24 giờ, tế bào
HepG2 tăng tích lũy lipid 39,4% so với chứng
sinh lý (p < 0,05). Quercetin 10 µM giảm tích lũy
lipid nội b|o gan do rƣợu (p < 0,05).

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

Bảng 3: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa sự tích lũy
lipid trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ

Ký hiệu
Isoquercitrin
(Nồng độ IQ)

(IQ)
NĐ1 (2,5 µg/ml) 0,147 ± 0,013
NĐ2 (5 µg/ml) 0,149 ± 0,006*
NĐ3 (10 µg/ml) 0,149 ± 0,014
Chứng
Quercetin
%
NĐ1
phòng
NĐ2
ngừa so
NĐ3
với mẫu
chứng Quercetin

OD500 trung bình ± SEM
Ethanol 100 mM (-)
Ethanol 100 mM (+)
Cao ethyl acetat Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70%
(EC)
(CC)
(IQ)
(EC)
(CC)
0,169 ± 0,010**
0,143 ± 0,007 0,194 ± 0,009** 0,160 ± 0,009*
0,249 ± 0,025**
#
0,143 ± 0,009
0,159 ± 0,012 0,183 ± 0,006** 0,159 ± 0,006 ** 0,203 ± 0,012**

#
0,135 ± 0,005
0,113 ± 0,004** 0,155 ± 0,006 * 0,160 ± 0,006*
0,165 ± 0,009**
0,135 ± 0,003
0,188 ± 0,010**
##
0,129 ± 0,004
0,144 ± 0,004
-11,9
53,1
-115,4
8,8
53,5
-28,9
62,3
52,2
43,4
82,4

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM)

Khi bổ sung cao cồn 70%, cao ethyl acetat,
isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y v|o môi trƣờng
chứa ethanol 100 mM, chỉ có isoquercitrin 10
µg/ml và cao ethyl acetat 42,3 µg/ml bảo vệ tế
bào gan làm giảm tình trạng tích lũy lipid so với
mẫu tế bào chỉ đƣợc xử lý với ethanol 100 mM (p
< 0,05). Tuy nhiên, lƣợng lipid trong tế bào gan
đƣợc xử lý đồng thời với ethanol 100 mM và

mẫu thử chƣa trở về mức bình thƣờng của mẫu
sinh lý. Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl
acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây thấp hơn
quercetin 10 µM. Tác dụng giảm tích lũy lipid
nội bào khác biệt không có ý nghĩa giữa 3 nồng
độ của cùng mẫu thử và giữa 3 mẫu cùng hàm
lƣợng isoquercitrin (p > 0,05).
Tác dụng phòng ngừa tình trạng tăng sinh
gốc tự do
Trong tế bào gan, glutathion tự do hiện diện
ở dạng khử có nhóm -SH (ký hiệu GSH) là một
chất đóng vai trò chống oxy hóa. Các tác nhân
gây tổn thƣơng tế bào gan nhƣ rƣợu l|m tăng
sinh gốc tự do dẫn đến làm giảm lƣợng GSH nội
b|o. H|m lƣợng GSH trong tế bào gan càng cao
chứng tỏ khả năng bảo vệ tế bào của mẫu thử
phòng ngừa tác hại của tác nhân gây oxy hóa
càng cao. Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 của
cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ
lá Chùm ngây giúp phòng ngừa tình trạng tăng

Chuyên Đề Dƣợc

sinh gốc oxy tự do gây ra bởi rƣợu đƣợc trình
bày trong Bảng 4.
Cả 3 nồng độ isoquercitrin v| NĐ1 cao cồn
70% giảm lƣợng GSH nội b|o có ý nghĩa thống
kê so với chứng sinh lý (p < 0,05). NĐ2, NĐ3 cao
cồn 70% v| NĐ3 cao ethyl acetat từ lá Chùm
ng}y tăng lƣợng GSH nội bào so với chứng sinh

lý (p < 0,05). Xử lý tế bào với ethanol 100 mM
trong 24 giờ làm giảm 31,3% lƣợng GSH nội bào
so với sinh lý (p < 0,01). Quercetin 10 µM giúp
lƣợng GSH tăng so với ethanol 100 mM (p < 0,01)
v| cao hơn mẫu sinh lý (p < 0,01). So với ethanol
100 mM, nồng độ NĐ2, NĐ3 isoquercitrin v| cao
ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa, l|m tăng
lƣợng GSH nội bào (p < 0,05) về mức tƣơng
đƣơng ở mẫu chứng sinh lý (p > 0,05). Tác dụng
phòng ngừa tình trạng stress oxy hóa, tăng
lƣợng GSH thấp hơn quercetin 10 µM (p < 0,05).
Cả 3 nồng độ khảo sát của cao cồn từ lá
Chùm ng}y đều l|m tăng lƣợng GSH nhƣng
không có ý nghĩa thống kê so với mẫu ethanol
100 mM (p > 0,05). Nhìn chung, chỉ isoquercitrin
và cao ethyl acetat thể hiện tác dụng phòng ngừa
tình trạng oxy hóa do rƣợu g}y ra, tăng lƣợng
GSH nội bào, tác dụng tốt ở mẫu có h|m lƣợng
isoquercitrin 10 µg/ml; không khác biệt có ý
nghĩa thống kê giữa 2 mẫu thử có cùng hàm
lƣợng isoquercitrin (p > 0,05).

363


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Bảng 4: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây chống oxy hóa, giảm sự

tăng sinh gốc tự do trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra

Ký hiệu
(Nồng độ IQ)
NĐ1 (2,5µg/ml)
NĐ2 (5 µg/ml)
NĐ3 (10µg/ml)
Chứng
Quercetin
NĐ1
% phòng ngừa
NĐ2
so với mẫu
NĐ3
chứng bệnh
Quercetin

Hàm lượng GSH (µM/mg protein) trung bình ± SEM
Ethanol 100 mM (-)
Ethanol 100 mM (+)
Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70% Isoquercitrin Cao ethyl acetat Cao cồn 70%
(IQ)
(EC)
(CC)
(IQ)
(EC)
(CC)
30,6 ± 2,6**
64,8 ± 5,8
38,8 ± 3,6** 45,1 ± 1,1**

54,9 ± 3,7*
50,3 ± 2,5**
##
##
36,8 ± 1,9**
67,5 ± 6,3
75,7 ± 4,0*
67,6 ± 2,1
63,7 ± 6,1
49,9 ± 1,7**
#
##
51,2 ± 2,8**
122,5 ± 1,8** 149,1 ± 15,1** 63,8 ± 5,8
77,8 ± 2,6 **
57,5 ± 4,6
63,3 ± 1,0
43,5 ± 2,1**
##
70,9 ± 3,0
145,6 ± 14,6**
8,4
57,5
34,7
122,0
102,3
32,7
102,9
173,4
70,8

515,6

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM)

Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoại tử
Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 của cao
cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá

Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoại tử do
rƣợu g}y ra đƣợc trình bày trong Bảng 5.

Bảng 5: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng
hoại tử tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ
Hoạt tính LDH (mU/ml) trung bình ± SEM
Ethanol 100 mM (-)
Ethanol 100 mM (+)
Isoquercitrin Cao ethyl acetat
Isoquercitrin Cao ethyl acetat
Ký hiệu (Nồng độ IQ)
Cao cồn (CC)
Cao cồn (CC)
(IQ)
(EC)
(IQ)
(EC)
#
##
NĐ1 (2,5µg/ml)
99,5 ± 3,4**
99,0 ± 3,7**

109,8 ± 3,7
121,1 ± 5,3
123,8 ± 2,7
100,5 ± 4,7*
##
#
#
NĐ2 (5 µg/ml)
96,3 ± 2,9**
101,0 ± 2,8**
102,0 ± 2,4** 112,0 ± 3,2
125,6 ± 5,5
110,5 ± 7,4
#
##
NĐ3 (10µg/ml)
94,7 ± 1,2**
125,8 ± 3,3
134,9 ± 8,9
128,4 ± 5,6
121,3 ± 3,6
104,7 ± 2,4**
Chứng
119,5 ± 1,5
145,8 ± 8,4*
Quercetin
129,2 ± 6,4
127,0 ± 6,5
NĐ1
94,0

83,8
172,4
% phòng ngừa so
NĐ2
128,6
76,9
134,2
với mẫu chứng
bệnh (ethanol 100 NĐ3
66,4
93,1
156,4
mM)
Quercetin
71,5

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM)

So với mẫu sinh lý, isoquercitrin, cao ethyl
acetat, cao cồn 70% từ lá Chùm ngây làm giảm
hoạt tính LDH ngoại bào ở các nồng độ khảo sát,
trừ nồng độ NĐ3 của cao ethyl acetat và cao cồn
70% (p < 0,05). Sau 24 giờ, rƣợu 100 mM gây hoại
tử tế b|o gan, tăng hoạt tính LDH ngoại bào 30%
so với mẫu sinh lý (p < 0,05). Quercetin 10 µM
làm giảm LDH ngoại b|o không có ý nghĩa
thống kê so với ethanol 100 mM (p > 0,05).
Ethanol 100 mM bổ sung mẫu thử
isoquercitrin, cao ethyl acetat, cao cồn 70% từ lá
Chùm ngây có hoạt tính LDH ngoại bào giảm so

364

với ethanol 100 mM (p < 0,05) về mức tƣơng
đƣơng với mẫu sinh lý (p > 0,05), giảm nhiều
nhất ở nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml.
Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoạt hóa quá
trình apoptosis
Nhuộm huỳnh quang AO/EB cho thấy
ethanol 100 mM gây hoạt hóa apoptosis tế bào
gan HepG2 sau 24 giờ (Hình 1). Xử lý tế bào
đồng thời với ethanol 100 mM và cao cồn, cao
ethyl acetat Chùm ng}y, isoquercitrin l|m tăng
mật độ tế bào, giảm hiện tƣợng bóng màng

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
(bledding) v| cô đặc nhiễm sắc thể so với chứng
bệnh ethanol 100 mM (Hình 1).

Nghiên cứu Y học

Tác dụng phòng ngừa tình trạng phân mảnh
ADN gây ra bởi rƣợu của cao cồn 70%, cao ethyl
acetat từ l{ Chùm ng}y v| isoquercitrin đƣợc
trình bày trong Bảng 6.

BM

NST

Chứng sinh lý

Ethanol 100 mM

Ethanol + isoquercitrin 10 µg/ml

Hình 1: Tác dụng của lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoạt hóa quá trình apoptosis tế bào gan HepG2 do
rượu gây ra (BM: bóng màng, NST: nhiễm sắc thể cô đặc)
Bảng 6: Tác dụng của cao cồn, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng phân
mảnh ADN trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ
%ADN phân mảnh trung bình ± SEM
Ethanol 100 mM (-)
Ethanol 100 mM (+)
Ký hiệu
Isoquercitrin
Cao ethyl
Cao cồn 70% Isoquercitrin
Cao ethyl
Cao cồn 70%
(Nồng độ IQ)
(IQ)
acetat (EC)
(CC)
(IQ)
acetat (EC)
(CC)
##
NĐ1 (2,5 µg/ml)

31,7 ± 0,3**
29,1 ± 3,6
35,6 ± 0,2** 32,5 ± 0,9**
41,9 ± 3,0**
38,7 ±1,0**
##
NĐ2 (5 µg/ml)
27,5 ± 0,9
32,1 ± 0,8**
30,0 ± 1,3
29,6 ± 0,3*
44,8 ± 1,4**
40,8 ± 1,2**
##
##
##
NĐ3 (10 µg/ml)
30,4 ± 3,8
31,4 ± 0,1**
30,7 ± 2,0
27,3 ± 0,4
33,0 ± 1,1**
28,6 ± 1,5
Chứng
27,6 ± 0,8
45,4 ± 3,2**
Quercetin
43,3 ± 0,3
43,5 ± 1,6**
NĐ1

72,2
19,6
37,8
% phòng ngừa so
NĐ2
88,5
3,5
26,0
với mẫu chứng
bệnh (ethanol 100
NĐ3
101,5
69,6
93,9
mM)
Quercetin
10,6

*: p < 0,05; **: p < 0,01: so với chứng sinh lý, ##: p < 0,01: so với chứng bệnh lý (ethanol 100 mM)

Hình 2: Kết quả điện di ADN phân mảnh thu được trong dịch nổi tế bào
A: mẫu thử riêng lẻ; B: cao thử + ethanol; IQ1, IQ2, IQ3; EC1, EC2, EC3; CC1, CC2, CC3: lần lượt là isoquercitrin, cao ethyl
acetat và cao cồn 70% từ lá Chùm ng}y h|m lượng isoquercitrin là 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 10 µg/ml; Q: quercetin 10 µM

Xử lý tế bào với cao cồn, cao ethyl acetat từ lá
Chùm ngây, isoquercitrin riêng lẻ trong 24 giờ

Chuyên Đề Dƣợc

l|m tăng % ADN ph}n mảnh không đ{ng kể so

với mẫu sinh lý (p > 0,05).

365


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Sau 24 giờ, ethanol 100 mM l|m tăng mạnh
tỷ lệ ADN phân mảnh (45,6% so với 27,6% của
mẫu sinh lý, p < 0,01). Quercetin 10 µM kết hợp
với ethanol 100 mM không l|m thay đổi tình
trạng apoptosis so với mẫu quercetin hoặc
ethanol một mình (p > 0,05).
Isoquercitrin 2,5; 5 v| 10 µg/ml đều làm giảm
sự phân mảnh ADN trong tế bào HepG gây ra
do ethanol 100 mM (p < 0,01), sự khác biệt giữa 3
nồng độ không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Đối với cao cồn 70% và cao ethyl acetat, chỉ có
nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml làm

giảm tỷ lệ ADN phân mảnh so với ethanol 100
mM (p < 0,01). Ở cùng nồng độ, isoquercitrin
ngăn ngừa tình trạng phân mảnh ADN tốt hơn
cao cồn và cao ethyl acetat.
Kết quả định lƣợng ADN phân mảnh bằng
thuốc thử diphenylamin hoàn toàn phù hợp với
quan sát ADN phân mảnh trên gel agarose 2%
bằng kỹ thuật điện di (Hình 2).

Kết quả tổng hợp về tác dụng bảo vệ tế bào
gan HepG2 của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và
isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y đƣợc trình bày
trong Bảng 7.

Bảng 7: Mức độ bảo vệ tế bào gan của cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin qua %
phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng (TT), tích lũy lipid nội b|o (LP), tăng sinh gốc oxy hóa (OX), hoại tử (HT) và
hoạt hóa apoptosis (AP) do ethanol 100 mM
Nồng độ
NĐ1
NĐ2
NĐ3
Quercetin

TT
196
109
160
53

Isoquercitrin (IQ)
LP
OX
HT
-12
8
94
9
122
129

62
103
66
82
516
71

AP
72
89
102
11

TT
250
177
211

Cao ethyl acetat (EC)
LP
OX
HT
53
58
84
54
102
77
52
173

93

AP
20
4
70

TT
138
69
42

Cao cồn 70% (CC)
LP
OX
HT
-115 35
172
-29
33
134
43
71
156

AP
38
26
94

NĐ1, NĐ2, NĐ3: nồng độ của 3 mẫu thử tương ứng với isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml

BÀN LUẬN
Sau 24 giờ, ethanol 100 mM gây tổn thƣơng
tế bào gan HepG2: giảm 25,6% tỷ lệ tế bào sống,
31,3% lƣợng GSH nội bào; tăng 39,3% lƣợng
lipid nội bào; 22% hoạt tính LDH ngoại bào và
gây hoạt hóa apoptosis tăng 64,5% ADN ph}n
mảnh. Tình trạng tổn thƣơng tế bào gan do
ethanol 100 mM giảm nhờ quercetin 10 µM, chất
đã đƣợc chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào
gan(1,5,6,17,19), trừ quá trình apoptosis vì quercetin
đã đƣợc Zhang (2012) báo cáo gây apoptosis(20).
Kết quả tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao cồn
70%, cao ethyl acetat ở 3 nồng độ ứng với
isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml cho thấy lá Chùm
ngây có khả năng phòng ngừa sự ức chế tăng
trƣởng tế bào, giảm tích lũy lipid nội bào, chống
oxy hóa, giảm hoại tử và apoptosis tế bào gan
HepG2 do ethanol 100 mM gây ra phù hợp với
b{o c{o trƣớc đ}y về tác dụng chống oxy hóa,
bảo vệ gan của lá Chùm ngây(8-10,2,13,15,16,18).
Một số đề tài báo cáo thành phần flavonoid,
phenol quyết định hoạt tính chống oxy hóa của
lá Chùm ngây(15,18). H|m lƣợng flavonoid càng
cao, t{c động dọn dẹp, trung hòa gốc tự do càng

366

rõ, giúp tế bào gan giảm nhạy cảm với yếu tố

g}y độc, giảm kích hoạt quá trình apoptosis.
Theo Sreelatha (2011), Vellosa (2011), dịch chiết
l{ Chùm ng}y tăng hoạt động của enzym chống
oxy hóa superoxid dismutase và catalase, giảm
lƣợng gốc tự do, ức chế peroxyd hóa lipid và
giảm ADN phân mảnh(4). Isoquercitrin và
quercetin trong l{ Chùm ng}y điều hòa biểu
hiện của các gen tham gia sinh tổng hợp GSH(11).
Ngoài ra, isoquercitrin và các flavonoid có liên
kết đôi C2=C3 ở vòng C, nhóm 4-oxo, nhóm OH
ở vị trí A5, A7 v| B4’quyết định tác dụng ức chế
TNF-α, giảm hoại tử gây bởi rƣợu(18).
Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 giảm dần
theo thứ tự: cao ethyl acetat > isoquercitrin > cao
cồn 70% và thể hiện rõ ở nồng độ ứng với
isoquercitrin 10 µg/ml của cả 3 mẫu thử. Theo
Salihah (2012), tỷ lệ phenolic trong cao ethyl
acetat lớn hơn cao cồn 96% (22,2% vs 8,6%) và
isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa cao,
phân lập từ ph}n đoạn ethyl acetat với hàm
lƣợng lớn(14). Điều này gợi ý isoquercitrin là một

Chuyên Đề Dƣợc


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018
trong những chất quyết định tác dụng chống oxy
hóa, bảo vệ gan của Chùm ngây.

9.

KẾT LUẬN

10.

Cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm
ngây và isoquercitrin có tác dụng phòng ngừa sự
ức chế tăng trƣởng, hoại tử và hoạt hóa
apoptosis do ethanol 100 mM gây ra sau 24 giờ
có thể do làm tăng lƣợng GSH nội b|o nhƣng
chƣa thể hiện rõ tác dụng làm giảm tích lũy
lipid. Nhƣ vậy, l{ Chùm ng}y, đặc biệt là cao
ethyl acetat có tác dụng bảo vệ tế bào gan tốt
giúp phòng ngừa tổn thƣơng do rƣợu, tác dụng
rõ nhất ở nồng độ 84,7 µg/ml ứng với
isoquercitrin 10 µg/ml.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Alia M, Mateos R, Ramos S, Lecumberri E, Bravo L, Goya L
(2006). Influence of quercetin and rutin on growth and
antioxidant defense system of a human hepatoma cell line
(HepG2). Eur J Nutr, 45(1): 19-28.
Das N, Sikder K, Ghosh S, Fromenty B, Dey S (2012). Moringa
oleifera Lam. leaf extract prevents early liver injury and
restores antioxidant status in mice fed with high-fat diet. Indian
Journal of Experimental Biology, 50(6): 404-412.
Đỗ Thị Hồng Tƣơi, Huỳnh Quang Mỹ Khánh, Huỳnh Thị Kim
Loan. Xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn
thƣơng tế b|o gan do rƣợu trên dòng tế bào HepG2. Tạp chí Y
học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(1): 332-339 (2014).
Henryk D (2010). Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Clinical
Hepatology Principles and Practice of Hepatobiliary Disease
Volume 2, Henryk Dancygierb, Springer-Verlag Berlin
Heidelberg, German, pp.1153 – 1179.
Kim GN, Jang HD (2009). Protective mechanism of quercetin
and rutin using glutathione metabolism on HO-induced
oxidative stress in HepG2 cells. Ann NY Acad Sci, 1171: 530-537.
Kim GN, Kwon YI, Jang HD (2011). Protective mechanism of
quercetin
and
rutin
on
2,2'-azobis(2amidinopropane)dihydrochloride or Cu2+-induced oxidative
stress in HepG2 cells. Toxicol In Vitro, 25(1): 138-144.

Kim KT et al. (2008). Inhibitory effects of naringenin,
kaempherol, and apigenin on cholesterol biosynthesis in
HepG2 and MCF-7 cells. Food Science and Biotechnology, 17(6),
1361-1364.
Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010).
Hepatoprotective Activity of Leaves and Roots Extracts of
Moringa oleifera Lam. Int J Med Res.; 1(2): 90-93.

Chuyên Đề Dƣợc

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Nghiên cứu Y học

Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010).
Medicinal uses and pharmacological properties of Moringa
oleifera. International Journal of Phytomedicine, 2: 210 – 216.
Magalingam KB, Radhakrishnan A, Haleagrahara N (2014).
Protective effects of flavonol isoquercitrin, against 6-hydroxy
dopamine (6-OHDA) - induced toxicity in PC12 cells, BMC
Research Notes, 7(49): 125-131.
Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Trần Quang Vinh, Lâm Quốc
Trung (2011). Thành phần hóa học từ lá Chùm ngây Moringa
oleifera Lam, Tạp chí hóa học: 49(6A): 96-101.
Nguyễn Bảo Trân (2010), Khảo s{t t{c động chống oxy hóa của lá
chùm ngây Moringa oleifera Lam. Moringaceae, Luận văn thạc sĩ
Dƣợc học, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh,
Hồ Chí Minh, tr.3-7.
Ruckmani K, Kavimani S, Anandan R, Jaykar B (1998). Effect of
Moringa oliefera Lam on Paracetamol – induced hepatotoxicity.
Indian J. Pharm Sci, 60(1): 33-35.
Salihah, Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận (2012). Ph}n lập c{c
th|nh phần có t{c dụng chống oxi hóa trong l{ Chùm ng}y
(Moringa oleifera Lam.). Tạp chí Y học TP.HCM: 16(1): 163-168.
Siddhuraju P, Becker K (2003). Antioxidant properties of
various solvent extracts of total phenolic constituents from
three different agro-climatic origin of drumstick tree Moringa
oleifera Lam, J. Agric Food Chem, 51(8): 2144-2155.
Sreelatha S, Padma PR (2011). Modulatory effects of Moringa
oleifera extracts against hydrogen peroxide-induced
cytotoxicity and oxidative damage. Human and Experimental
Toxicology, 30(9): 1359-1368.

Ueda H, Yamazaki C, Yamazaki M (2004). A hydroxyl group
of flavonoids affects oral anti-inflammatory activity and
inhibition of systemic tumor necrosis factor- R production”,
Biosci. Biotech-nol. Biochem, 68(1): 119-125.
Vongsak B, Sithisarn P, Mangmoolb S, Thongpraditchote S,
Wongkrajaangc Y, Gritsanapana W (2013). Maximizing total
phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of
Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction
method. Industrial Crops and Products, 44: 566-571.
Weng CJ, Chen MJ, Yeh CT, Yen GC (2011). Hepatoprotection
of quercetin against oxidative stress by induction of
metallothionein expression through activating MAPK and
PI3K pathways and enhancing Nrf2 DNA-binding activity. N
Biotechnol, 28(6): 767-777.
Younossi ZM, Gramlich T, Bacon BR, Matteoni CA, Boparai N,
O'Neill R, McCullough AJ (1999). Hepatic iron and
nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology, 30(4): 847 - 850.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ng|y b|i b{o được đăng:

15/03/2018

367