Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng METHYL hoá một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thu biểu mô tuyến ở phổi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN, MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN EGFR
VÀ TÌNH TRẠNG METHYL HÓA MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN

TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ BIỂU MÔ TUYẾN Ở PHỔI
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 942 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà
2. TS. BS. Nguyễn Phi Hùng

Hà Nội – 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu,
cộng tác với các nhà khoa học khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành cũng như các hội nghị trong
nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả; những kết quả còn lại
trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2020
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang


LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công
nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, chỉ
bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Thầy không chỉ truyền thụ
cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm
túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực
hiện luận án là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau
này.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi xin trân trọng cảm ơn TS. BS.
Nguyễn Phi Hùng, Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K.
Thầy đã luôn hướng dẫn, động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong
những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Tạ Văn Tờ, TS. Vương Diệu Linh và các
đồng nghiệp thuộc Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử, Bệnh viện K đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện tốt đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen,
Viện Công Nghệ Sinh học đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời
gian qua.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho bố mẹ, bạn bè đã luôn tin tưởng,
thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong thời gian qua, giúp
tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Ngọc Quang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
1.1. Ung thư phổi......................................................................................................... 4

1.1.1. Thực trạng ung thư phổi .................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ung thư phổi ...................................................................................... 6
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi ............................................................................... 7
1.2. Ung thư biểu mô tuyến của phổi .......................................................................... 9
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến ....................................................................... 9
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến ................................ 11
1.3. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi ............................................................. 13
1.3.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR ................................................................... 13
1.3.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi .......................................................... 15
1.3.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi ................................................... 17
1.4. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi ................................................................. 17
1.4.1. Methyl hóa DNA ............................................................................................. 17
1.4.2. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong
ung thư phổi ...................................................................................................... 20
1.5. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi ....................................................... 29
1.5.1. Điều trị đích trong ung thư .............................................................................. 29
1.5.2. Điều trị đích trong ung thư phổi ...................................................................... 31
1.6. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi ............................. 33
1.6.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi ................................ 33
1.6.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi ........................ 35
1.7. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam ....................... 37
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................... 39
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 39
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................... 39
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 39
2.2. Thiết bị chính ..................................................................................................... 42
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43


2.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA...................................... 43

2.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số.................................................................... 44
2.3.3. Phương pháp PCR......................................................................................... 44
2.3.4. Phương pháp điện di...................................................................................... 47
2.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR.................................................... 47
2.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch......................................................... 48
2.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M.sssI.........................49
2.3.8. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học............................................................ 50
2.4. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................. 50
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ.................................................................................... 51
3.1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu....................................................................... 51
3.2. Đột biến và biểu hiện gen EGFR...................................................................... 52
3.2.1 Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.....................52
3.2.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân.............56
3.3. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của
phổi................................................................................................................. 59
3.3.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân................59
3.3.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân..............61
3.3.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân..............63
3.3.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân......................65
3.3.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân...........66
3.4. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một
số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi.................................................. 68
3.4.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR....................68
3.4.2.

Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa

các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A................................................ 71
3.4.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu
mô tuyến của phổi........................................................................................... 74

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN.................................................................................... 76
4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi.....76
4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR..................................... 76


4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR........................................................... 78
4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR................................................................. 80
4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR........................................ 81
4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh
nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi............................................................. 83
4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1......................................................... 83
4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT......................................................... 84
4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1.......................................................... 86
4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A..................................................... 87
4.3. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của
phổi................................................................................................................. 88
4.3.1. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u...............88
4.3.2. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u............................ 90
4.3.3. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô
tuyến của phổi................................................................................................. 91
KẾT LUẬN............................................................................................................ 94
KIẾN NGHỊ........................................................................................................... 95
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ............................................................................. 96
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 97


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

A260

Độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm

AAH

Atipical Adenomatous Hyperplasias (Tế bào phân chia quá mức
không điển hình)

ABL

Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 gene

ACS

American Cancer Society (Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ)

AIS

Adenocarcinoma in situ (Ung thư tại chỗ)

ALK

Anaplastic Lymphoma Kinase gene

ALK-EML4,
BCR-ABL

Chuyển đoạn ALK-EML4, BCR-ABL

APC

Adenomatous polyposis of the colon gene

BAC

Bronchioloalveolar Carcinoma (Ung thư biểu mô tiểu phế nang)

BCR

Breakpoint Cluster Region gene

BRCA1

Breast cancer susceptibility gene (Gen nhạy cảm với ung thư vú)

BRAF

v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B

CD74

Cluster of Differentiation 74 gene

CHFR

Checkpoint With Forkhead And Ring Finger Domains

CK5/6

Cytokeratin 5/6 protein

CK7

Cytokeratin 7 protein

COBRA

Combined Bisulfite Restriction Analysis (Phân tích kết hợp
Bisulfite và cắt giới hạn)

cs.

Cộng sự

DAB

3, 3 –diaminobenzidine

DAPK

Death‐associated protein kinase

DNA

Acid deoxyribonucleic

DNMTs

DNA methyltransferase (Enzyme methyl hóa DNA)


dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EGFR

Epidermal growth factor receptor (Yếu tố phát triển biểu mô)

ER

Estrogen receptor (thụ thể estrogen)

FDA

Food and Drug Administration (Hiệp hội thực phẩm và thuốc
Hoa Kỳ)

FFPE

Formalin fixed paraffin embedded

FISH

Fluorescence In Situ Hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang)

GTP

Guanosine triphosphate

GDP

Guanosine diphosphate

GSTP1

Glutathione S-transferase Pi 1 gene

H&E

Hematoxylin & Eosin

HDACs

Histone deacetylase

HRM

High Resolution Melting (Độ phân giải cao nhiệt độ nóng chảy)

HPR

Horseradish Peroxidase

IARC

International Agency for Research on cancer (Tổ chức nghiên
cứu ung thư thế giới)

IHC

Immunohistochemistry (Hóa mô miễn dịch)

MAPK

Mitogen-activated protein kinase

MDR

Multidrug resistance gene

MEK
(MAP2K1)

Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 1

MET

Mesenchymal-epithelial transition factor

MIA

Minimally Invasive Adenocarcinoma

MGMT

O-6-methylguanine-DNA methyltransferase gene

MLH1

MutL homolog 1 gene

MsssI

CpG methyltransferase

MS-PCR

Methylation Specific PCR (PCR đặc hiệu methyl)


MYC

Myelocytomatosis genes

NGS

Next Generation Sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

NSCLC

Non-small cell lung cancer (Ung thư phổi không tế bào nhỏ)

PI3K

Phosphoinositide 3-kinases

PTEN

Phosphatase and tensin homologue

PR

Progesterone Receptor (Thụ thể progesterone)

RASSF1A

Ras association domain family 1A gene

RARP2

The retinoic acid receptor P gene

Ras

Rat sarcoma

RB2

Retinoblastoma-like protein 2

RET

Rearranged during transfection

ROS1

c-ros oncogene 1gene

SAM

S-adenosylmethionine

SCLC

Small cell lung cancer (Ung thư phổi tế bào nhỏ)

SDC4

Syndecan 4 gene

SLC34A2

Solute Carrier Family 34 Member 2 gene

SNP

Single Nucleotide Polymorphism (Sự đa hình nucleotide)

SSCP

Single-strand conformation polymorphism (đa hình cấu trúc sợi

đơn)

TAE

Tris-acetate-EDTA

TBE

Tris-borate-EDTA

TEMED

N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine

TKIs

Tyrosine Kinase Inhibitors (Các chất ức chế Tyrosine Kinase)

TIMP3

Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 3 gene

TTF-1

Transcription Termination Factor 1 (Yếu tố kết thúc phiên mã 1)

WHO

World Heath Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

WNT

Wingless genes

YAP

Yes-associated protein


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1

Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên
thế giới

5

Hình 1.2

Số ca mắc ung thư mới tại Việt Nam năm 2018

5

Hình 1.3

Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi

7

Hình 1.4

Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến

11

Hình 1.5

Một số phân típ phổ biến trong ung thư biểu mô tuyến của phổi

12

Hình 1.6

Đường truyền tín hiệu thông qua phân tử EGFR

14

Hình 1.7

Tần suất các dạng đột biến gen EGFR

15

Hình 1.8

Methyl hóa DNA ở tế bào bình thường và tế bào ung thư

19

Hình 1.9

Các vị trí methyl hóa trên gen EGFR

22

Hình 1.10

Cấu trúc gen BRCA1ở người

22

Hình 1.11

Chức năng ức chế khối u của BRCA1

23

Hình 1.12

Cấu trúc gen MLH1

24

Hình 1.13

Các phức hợp sửa chữa DNA của MLH1

24

Hình 1.14

Cấu trúc gen MGMT

26

Hình 1.15

Cơ chế sửa chữa DNA của MGMT

26

Hình 1.16

Cấu trúc của gen RASSF1A và các đồng phân

27

Hình 1.17

Chức năng ức chế khối u của RASSF1A

28

Hình 1.18

Điều trị đích trong ung thư phổi

32

Hình 1.19

Một số kỹ thuật phát hiện đột biến gen

35

Hình 1.20

Lịch sử phát hiện các kỹ thuật phân tích methyl hóa DNA

36

Hình 2.1

Phương pháp xử lý bisulfite

44

Hình 2.2

Phương pháp RT-PCR Scorpion Arms

48

Hình 2.3

Phương pháp hóa mô miễn dịch

49

Hình 2.4

Sơ đồ nghiên cứu

50

Hình 3.1

Kết quả phát hiện đột biến EGFR

53


Hình 3.2Kết quả hóa mô miễn dịch protein EGFR
Hình 3.3Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen EGFR

56
59

Hình 3.4Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen BRCA1
Hình 3.5

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen MGMT

Hình 3.6

65

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl hóa
gen RASSF1A

Hình 4.1

63

Kết quả điện di sản phẩm MS-PCR phát hiện methyl
hóa MLH1

Hình 3.7

61

67

Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và sự biểu hiện
EGFR

81


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Kit và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

40

Bảng 2.2

Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

41

Bảng 2.3

Điều kiện các phản ứng PCR sử dụng trong nghiên cứu

45

Bảng 2.4

Thành phần phản ứng PCR trong nghiên cứu

46

Bảng 3.1

Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu

51

Bảng 3.2

Các đột biến gen EGFR được phát hiện trong nghiên cứu

52

Bảng 3.3

Tương quan giữa đột biến EGFR với đặc điểm bệnh nhân

54

Bảng 3.4

Tương quan giữa đột biến EGFR và tình trạng hút thuốc ở bệnh
nhân nam giới

55

Bảng 3.5

Mức độ biểu hiện protein EGFR

57

Bảng 3.6

Tương quan giữa mức độ biểu hiện protein EGFR với đặc điểm
bệnh nhân

58

Bảng 3.7

Tương quan giữa methyl hóa EGFR với đặc điểm bệnh nhân

60

Bảng 3.8

Tương quan giữa methyl hóa BRCA1 với đặc điểm bệnh nhân

62

Bảng 3.9

Tương quan giữa methyl hóa MGMT với đặc điểm bệnh nhân

64

Bảng 3.10

Tương quan giữa methyl hóa MHL1 với đặc điểm bệnh nhân

66

Bảng 3.11

Tương quan giữa methyl hóa RASSF1A với đặc điểm bệnh nhân

68

Bảng 3.12

Tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa và biểu hiện protein
EGFR

69

Bảng 3.13

Tỷ lệ đột biến, biểu hiện protein ở bệnh nhân methyl hóa EGFR

70

Bảng 3.14

Tương quan giữa đột biến và methyl hóa với biểu hiện EGFR

70


Bảng 3.15

Bảng 3.16

Bảng 3.17

Tương quan giữa đột biến EGFR với sự methyl hóa các gen
BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

72

Tương quan giữa biểu hiện protein EGFR với sự methyl hóa các
gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A

73

Tương quan về tình trạng methyl các gen liên quan đến ung thư
biểu mô tuyển ở phổi

74


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của luận án
Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới
hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu trường
hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca mắc mới
và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được chia làm
hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư phổi không
tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %. Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi là dạng phổ
biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ biến ở những
người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi nói chung và
ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp ứng điều trị
rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5 năm. Tuy vậy
hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được phát hiện ung thư
sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những phương pháp
điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều trị nhắm đích
dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung thư. Ở ung thư
phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng, phác
đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors) dựa trên những
đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang được sử dụng rộng
rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống thêm và cải
thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên cạnh đó việc đánh giá
sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong việc đưa ra những tiên
lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân.

Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức độ methyl hóa vùng
promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức chế khối u cũng
được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư. Methyl
hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A…. đã được phát
hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi.
Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng
xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời,

1


sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại
hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung
thư phổi điển hình.
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi
phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế
khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện
nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra
phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột
biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên
quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu:
1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân
ung thư biểu mô tuyển ở phổi.
2. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột
biến và biểu hiện protein EGFR.
Nội dung nghiên cứu
1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh. Thu thập mẫu bệnh
phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề.

2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên
quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR.
3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl
nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1,
MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm
bệnh nhân trong nghiên cứu.
4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl
hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.

2


Đóng góp mới của luận án
Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử
của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được
tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến
của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau:
1.

Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa

của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều
trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
2.

Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa các

gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR
và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến
ở phổi.

3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Ung thƣ phổi
1.1.1. Thực trạng ung thư phổi
Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư phổi
trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1.1) [35]. Đây vẫn ung thư phổ
biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất là ở
Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người). Tỷ lệ
mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ nữ, ung
thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số).
Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau
ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc
lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu
(23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000
người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35]. Hiệp
hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có
thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư
được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm
quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến
155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư
[102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong
do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư
vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có
khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư.
Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong

110/100 000 người (Hình 1.2). Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam
giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam và
nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6 905
ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp

4


(14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân. Dự báo, đến năm
2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả
hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung
thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 –
41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35].

Hình 1.1. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35].

Hình 1.2. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35].

5


1.1.2. Phân loại ung thư phổi
Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84].
Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng
bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô,
gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và
hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi. Để phục vụ cho mục đích
điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ
(NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC –
Small Cell Lung Cancer) (Hình 1.3) [72].

1.1.2.1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ
Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó
ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung
thư biểu mô tế bào lớn [57].
Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường
hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu
mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135]. Đây
cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112].
Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng
25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy,
là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi. Ung thư biểu mô tế
bào vẩy có xu hướng được tìm thấy ở phần trung tâm của phổi, gần một đường hô
hấp chính (phế quản), thường gặp ở nam giới và có liên quan mật thiết với tiền sử
hút thuốc lá nhiều hơn so với hầu hết các loại ung thư phổi khác [65].
Ung thư biểu mô tế bào lớn (LCC – Large Cell Cancer) chiếm khoảng 10 –
15% số trường hợp mắc ung thư phổi. Sở dĩ tên gọi như vậy vì tế bào ung thư có
kích thước rất lớn, với sự dư thừa tế bào chất, nhân tế bào lớn và hạch nhân dễ thấy
[84]. Ung thư biểu mô tế bào lớn có thể xuất hiện ở bất kỳ phần nào của phổi. Nó có
xu hướng phát triển và lan truyền nhanh chóng, điều này có thể làm cho việc điều trị
trở nên khó khăn hơn. Một phân nhóm của ung thư biểu mô tế bào lớn, được gọi là
ung thư biểu mô tế bào thần kinh lớn, là một loại ung thư phát triển nhanh, rất giống
với ung thư phổi tế bào nhỏ [84].
6


Ngoài ra ung thư phổi không tế bào nhỏ còn có thêm một số phân típ khác
hiếm gặp như là carcinoid và thần kinh nội tiết [84].

Hình 1.3. Phân loại mô bệnh học trong ung thư phổi [57].
1.1.2.2. Ung thư phổi tế bào nhỏ

Đặc điểm nổi bật của ung thư phổi tế bào nhỏ là các tế bào chứa dày đặc các
hạt tiết thể dịch thần kinh đó là những túi tiết chứa hormone thần kinh nội tiết, do đó
khối u loại này có liên quan đến với hội chứng cận ung thư/nội tiết [118, 135]. Đa số
trường hợp bệnh phát sinh ở đường dẫn khí lớn (phế quản chính và phế quản thùy).
Khoảng 60 – 70% trường hợp bệnh được phát hiện ở giai đoạn đã lan rộng và không
thể tiến hành xạ trị ở một phạm vi đơn lẻ [57].
1.1.3. Các giai đoạn ung thư phổi
Ung thư được phân chia theo các giai đoạn phát triển dựa vào kích thước, vị
trí của khối u nguyên phát, mức độ xâm lấn cũng như khả năng di căn. Hiện nay, hệ
thống phân loại giai đoạn ung thư phổi đang được sử dụng phổ biến nhất là hệ
thống TNM, dựa trên kích thước khối u (Tumor), số hạch lympho phát sinh (Node)
và mức độ di căn (Metastasis). Theo hệ thống phân loại này, tiến triển của ung thư
phổi có thể chia thành các giai đoạn từ 0 (STAGE 0) đến IV (STAGE IV) [3].
Giai đoạn 0 tương ứng với ung thư phổi không xâm lấn, không có hạch,
không di căn xa. Giai đoạn này, các tế bào ung thư chỉ khu trú, không hề xuất hiện
7


bất cứ một tế bào ung thư hay tế bào dị thường nào xuất hiện ngoài vùng phổi/phế
quản, hay có biểu hiện tấn công các vùng mô lành xung quanh [3].
Giai đoạn I tương ứng với ung thư phổi xâm lấn, các tế bào ung thư bắt đầu
lan tỏa và tấn công các phần mô lành, với kích thước khối u ≤ 5 cm. Ở giai đoạn
này, sự xâm lấn mới chỉ diễn ra rất ít, chủ yếu bao xung quanh phổi hoặc lá tạng
màng phổi, không xâm lấn vào phế quản thùy; chưa có hiện tượng di căn hạch. Giai
đoạn I được chia làm IA, IB tùy thuộc vào kích thước khối u [3]. Thời gian sống
thêm sau 5 năm đối với những bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn I khoảng 65%
(55 – 90,5%). Thời gian sống thêm của bệnh nhân nhóm này phụ thuộc vào kích
thước khối u khi phát hiện bệnh. Đối với bệnh nhân ở giai đoạn T1N0, tỷ lệ sống
sau 5 năm là 82%, sau 10 năm là 74%. Trong khi tỷ lệ này ở nhóm bệnh nhân T2N0
giảm xuống lần lượt là 68% và 60% [84].

Giai đoạn II được chia ra làm IIA và IIB. IIA mô tả ung thư xâm lấn dưới
dạng khối u có kích thước nhỏ hơn 5 cm, di căn hạch cạnh phế quản cùng bên
và/hoặc hạch cạnh rốn phổi, bao gồm cả xâm lấn trực tiếp vào hạch, chưa có di căn
xa. IIB mô tả ung thư xâm lấn dưới dạng khối u có kích thước có thể lớn hơn 5cm
và nhỏ hơn 7 cm, có di căn hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh rốn
phổi; hoặc khối u có kích thước lớn hơn 7 cm, hoặc có xâm lấn trực tiếp vào thành
ngực, cơ hoành, thần kinh hoành, màng phổi trung thất, hoặc lá thành màng tim [3].
Thời gian sống sau 5 năm của bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn II là 42%. Đặc
điểm của mô bênh học của khối u cũng có ảnh hưởng đến thời gian sống thêm.
Bệnh nhân thuộc nhóm T1 ung thư biểu mô tế bào vẩy có 75% sống sau 5 năm,
nhưng con số này chỉ là 25% ở bệnh nhân T2 ung thư biểu mô tuyến [84].
Giai đoạn III tương ứng với ung thư có di căn hạch lympho, các hạch này tập
trung thành cụm hoặc gắn lên các cấu trúc khác. Giai đoạn III được chia ra làm IIIA
và IIIB. Giai đoạn III mô tả ung thư xâm lấn chưa có di căn xa, khối u nguyên phát
có kích thước có thể lên đến 7 cm, hoặc xâm lấn vào lá tạng màng phổi, có liên
quan đến phế quản, hoặc xâm lấn vào thành ngực, cơ hoành, lá thành màng tim;
hoặc khối u có kích thước bất kỳ đã xâm nhiễm vào trung thất, lan vào tim, mạch
máu lớn, khí quản, thực quản, thân đốt sống, hoặc đã có tràn dịch màng phổi ác tính.
Giai đoạn IIIA và IIIB khác nhau ở tình trạng di căn hạch của khối u, trong đó

8


IIIB có di căn hạch trung thất đối bên, hạch rốn phổi đối bên, di căn hạch cơ bậc
thang cùng bên hoặc đối bên, hoặc hạch thượng đòn. Ngược lại, IIIA được mô tả
hoặc không có di căn hạch, hoặc hạch cạnh phế quản cùng bên và/hoặc hạch cạnh
rốn phổi, hoặc di căn hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch dưới carina [3]. Thời
gian sống trung bình của bệnh nhân nhóm IIIA là 12 tháng và chỉ có 9 – 15% trường
hợp có thể sống thêm 5 năm. Trong khi đó, thời gian sống trung bình của bệnh nhân
giai đoạn IIIB là 8 tháng và chỉ có dưới 5% bệnh nhân có thể sống sót sau 5 năm

[84].
Giai đoạn IV mô tả ung thư phổi xâm lấn dưới dạng di căn ra xa và hình
thành các hạch lympho ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể. Ở giai đoạn này, có
các khối riêng biệt ở một thùy đối bên, hoặc khối u có các khối ở màng phổi, hoặc
có các tổn thương ác tính ở màng phổi [3]. Với những bệnh nhân giai đoạn IV việc
phẫu thuật loại bỏ khối u là điều gần như không thể. Thời gian sống thêm của bệnh
nhân nhóm này rất ngắn, đồng thời rất hiếm bệnh nhân có thế sống sót quá 5 năm
[84]. Tuy nhiên, trong một số trường hợp hiếm gặp, bệnh nhân có thể được phẫu
thuật thành công, làm cải thiện đáng kể chất lượng cuộc sống và thời gian sống
thêm. Thời gian sống sau 5 năm có thể lên tới 13 – 21% và thời gian sống trung
bình là 14 tháng [84].
1.2. Ung thƣ biểu mô tuyến của phổi
1.2.1 Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến
Ung thư biểu mô tuyến chiếm khoảng 40% số trường hợp ung thư phổi (Hình
1.3). Ung thư này thường bắt đầu ở những tế bào tiết thông thường như là tế bào tiết
chất nhầy [57, 84]. Ung thư biểu mô tuyến xảy ra ở những người đã từng hoặc đang
hút thuốc, nhưng phổ biến nhất ở những người không hút thuốc. Ngoài ra, ung thư
biểu mô tuyến ở phổi phổ biến ở nữ giới hơn nam giới và hay gặp ở những người trẻ
tuổi hơn những loại ung thư phổi khác [84].
Ung thư biểu mô tuyến của phổi thường được tìm thấy ở phần bên ngoài của
phổi. Mặc dù có xu hướng phát triển chậm hơn so với những dạng ung thư phổi
khác và khả năng phát hiện trước khi ung thư lan rộng nhưng nó lại rất khác nhau
giữa các bệnh nhân. Những bệnh nhân ung thư phổi tại chỗ (Adenocarcinoma in
situ) thường có tiên lượng tốt hơn so với những loại ung thư phổi khác [57, 84].
9


Ung thư biểu mô tuyến ngoại vi ở phổi được cho là phát sinh từ các tổn
thương tiền ung thư được gọi là tế bào ung thư tân sản (Neuoplasia) sau đó phát
triển thành các tế bào ung thư phân chia quá mức không điển hình (Atipical

Adenomatous Hyperplasias - AAH), AAH được coi là hình ảnh mô học đầu tiên
trong quá trình hình thành khối u ác tính (Hình 1.4) [41]. AAH mang những biến
đổi di tuyền và di truyền ngoại gen tương tự với những biến đổi được tìm thấy trong
ung thư tuyến của phổi kể cả đột biến KRAS, EGFR, TP53, mất đoạn dị hợp tử tại
cánh dài nhiễm sắc thể số 9 và cánh ngắn nhiễm sắc thể số 16, và biến đổi đi truyền
ngoại gen WNT [59]. Từ các AAH sẽ tiếp tục hình thành ung thư biểu mô tuyến tại
chỗ (AIS – Adenocarcinoma in situ) hay còn được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế
nang (BAC – Bronchioloalveolar Carcinoma); lần đầu tiên tiến tới giai đoạn tiền
ung thư trước khi được gọi là ung thư biểu mô tiểu phế nang (BAC). Đây được coi
là giai đoạn không xâm lấn của những tế bào ung thư tuyến tân sản nhưng chúng thể
hiện sự tăng kích thước và hình thái tế bào không điển hình. Giai đoạn tiếp theo của
ung thư là sự hình thành xâm lấn tối thiểu (MIA – Minimally Invasive
Adenocarcinoma), được định nghĩa là một ung thư biểu mô tuyến nhỏ (kích thước
nhỏ hơn 3 cm) với thành phần chủ yếu là tổn thương lepidic và xâm lấn nhỏ hơn
5mm tại một vị trí. Sau đó khối u chuyển sang quá trình xâm lấn (Invasive
Carcinoma) mặc dù các yếu tố không xâm lấn có thể tồn tại ở các cạnh của các khối
u [59].
Di căn là giai đoạn cuối cùng trong quá trình phát triển của khối u. Ung thư
biểu mô phổi có thể di căn theo hệ bạch huyết cũng như mạch máu. Sự di căn theo
con đường mạch máu thường thấy ở các khối u ở giai đoạn thấp, thường dẫn đến
tăng tỷ lệ tái phát cũng như rút ngắn thời gian sống sót của bệnh nhân. Trong khi di
căn qua đường bạch huyết thường mất nhiều thời gian hơn cho sự hình thành khối u
di căn, di căn qua đường bạch huyết sẽ hình thành những khối u di căn xa [39]. Ung
thư biểu mô phổi có một số địa điểm ưu tiên cho di căn như: Não, xương và tuyến
thượng thận. Các cơ quan khác có di căn thường ở giai đoạn cuối của bệnh. Đối với
các loại ung thư phổi khác nhau có sự ưu tiên hình thành khối u di căn không giống
nhau, chẳng hạn như di căn gan trong ung thư biểu mô phổi tế bào nhỏ và di căn
não trong ung thư tuyến mô [39].

10

Hình 1.4. Quá trình hình thành ung thư biểu mô tuyến [59].
1.2.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến
Khối u trong ung thư biểu mô tuyến thể hiện sự biệt hóa tuyến với một hay
nhiều dạng phát triển gồm một số dạng chính: Tổn thương lepidic, chùm nang, nhú,
vi nhú hoặc dạng đặc … (Hình 1.5) [57, 84].
Tổn thương lepidic: Đây là sự phát triển không điển hình các tế bào vuông
đơn dọc theo thành phế nang có đặc điểm: Cấu trúc phế nang vẫn được duy trì;
không có sẹo xơ trung tâm hay lan rộng; thường có dày thành phế nang; không có
hoặc ít phát triển dạng tầng; không tạo cấu trúc nhú. Nếu trên mảnh sinh thiết chỉ
thấy phát triển đơn thuần thành phần lepidic thì không loại trừ u có thành phần xâm
nhập [84].
Ung thư biểu mô tuyến nhú (Papillary Adenocarcinoma): U thường đơn độc
bao gồm cấu trúc nhú được phủ bởi tế bào kích thước lớn, không điển hình với nhân
lớn, tăng sắc, hạt nhân rõ, nhiều nhân chia (Hình 1.5A) [84].
11