Nghiên cứu định lượng đồng thời ginsenosid RG1, RE, RB1 và RD trong viên nang ukata bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI GINSENOSID
RG1, RE, RB1 VÀ RD TRONG VIÊN NANG UKATA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguyễn Chu Huy*; Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương*
Nguyễn Văn Bạch*; Đào Văn Đôn*
TÓM TẮT
Phương pháp HPLC định lượng đồng thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên nang cứng
Ukata đã được xây dựng và thẩm định. Pha động gåm acetonitril - nước, cột phân tích Gemini C18
(250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ dòng 1,5 ml/phút. Các ginsenosid được tách
hoàn toàn trong thời gian 50 phút. Giới hạn định lượng của ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd nằm trong
khoảng 6,0 - 8,0 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các ginsenosid có mối tương quan tuyến tính với hệ
số tương quan ≈ 1. Phương pháp có độ chính xác cao, độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi
ginsenosid từ 93 - 100%. Phương pháp này có thể được sử dụng để định lượng ginsenosid Rg1, Re,
Rb1 và Rd trong viên nang cứng Ukata và các sản phẩm khác có chứa tam thất.
* Từ khóa: Ginsenosid; Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC.

SIMULTANEOUS DETERMINATION OF GINSENOSIDE
RG1, RE, RB1 AND RD IN UKATA CAPSULES BY HPLC
SUMMARY
A HPLC method for the simultaneous determination of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata
capsules was validated. Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6
nm, 5 µm) column, UV detection at 203 nm and flow at 1.5 ml/min, the ginsenosides were separated
satisfactorily within 50 minutes. The quantitation limits of ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd were about
6.0 to 8.0 µg/ml. The calibration curve of each ginsenoside had a correlation coefficient close to 1.
The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were 93 - 100% for all
ginsenosides. This method should be used to detemine ginsenoside Rg1, Re, Rb1 and Rd in Ukata
capsules and other products containing Panax pseudoginseng.
* Key words: Ginsenoside, Rg1; Re; Rb1; Rd; HPLC.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Việt Nam, thuốc chống ung thư chủ
yếu có nguồn gốc hóa dược, phải nhập khẩu
với giá thành cao, không chủ động được
nguồn nguyên liệu, phụ thuộc nhiều vào các

hãng dược phẩm nước ngoài, trong khi đó
nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có của Việt
Nam vẫn chưa được tận dụng. Thực trạng này
cho thấy, cần phải nghiên cứu sản xuất thuốc

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn ()
Ngày nhận bài: 14/10/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/11/2013
Ngày bài báo được đăng: 12/12/2013

42


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

điều trị ung thư từ nguồn nguyên liệu trong
nước, tạo ra được sản phẩm chất lượng tốt,
giá cả hợp lý, phù hợp điều kiện kinh tế Việt
Nam. Xuất phát từ vấn đề trên, Học viện
Quân y đã tiến hành nghiên cứu bào chế
viên nang cứng Ukata với tác dụng hỗ trợ
điều trị ung thư. Sản phẩm có thành phần
tam thất với hoạt chất chính là các ginsenosid
[1]. Đây là những hoạt chất chính góp phần

tạo ra tác dụng của sản phẩm. Vì vậy, chỉ
tiêu định lượng này cần được đánh giá để
đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng tốt, góp
phần bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Nguyên vật liệu nghiên cứu.
* Đối tượng nghiên cứu:
- Viên nang cứng Ukata (lô 0812, NSX
08.08.2012, HSD 08.08.2014) được sản xuất
tại Học viện Quân y, đạt TCCS.
- Thành phần viên nang cứng Ukata: cao
khô bèo hoa dâu 60 mg; cao khô nghệ 100
mg; cao khô tam thất 80 mg, tá dược (talc,
magnesi stearat) vừa đủ 1 viên.
- Mẫu trắng: là mẫu tự tạo không chứa
tam thất.
* Dung môi, hoá chất:
- Chất chuẩn: ginsenosid Rg1 (98,5%), Rb1
(99,0%), Re (99,2%), Rd (99,3%) của SigmaAldrich.
- Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu
chuẩn HPLC.
- Các hoá chất, dung môi khác: ethanol,
methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether,
H2SO4 đặc... đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.
* Thiết bị và dụng cụ phân tích:
Tất cả các thiết bị phân tích đều được chuẩn
hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005, bao gồm:

- Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC

Alliance Waters 2695D, 4 kênh dung môi,
bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột,
detector PDA (203 nm), cột sắc ký Gemini
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)... Phần mềm xử
lý số liệu Empower® 2.
- Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích
Sartorius độ chính xác ± 0,1 mg, các dụng
cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ
chính xác phù hợp.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Khảo sát quy trình định lượng:
Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [2,
3, 4], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu
như sau:
Lấy 20 viên nang cứng Ukata, bóc bỏ vỏ
nang, trộn đều. Xác định khối lượng trung
bình viên. Cân chính xác 1,0 gam bột viên
nang, thêm 15 ml MeOH, hòa tan bằng máy
siêu âm. Ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút.
Hút lấy dịch trong. Cắn tiếp tục hòa tan như
thế thêm 2 lần nữa (10 ml x 2 lần). Tập
trung dịch dịch chiết, bốc hơi chân không
tới cắn, hòa tan cắn bằng 10 ml MeOH. Lọc
qua màng lọc 0,45 µm, đem dịch lọc phân
tích HPLC.
- Điều kiện sắc ký [2, 3, 4]: cột Gemini
C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector PDA ghi
phổ 200 - 400 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút,
thể tích bơm mẫu 10 µl. Tiến hành khảo sát
pha động ACN:H2O chạy theo chương trình

gradient.
* Thẩm định quy trình định lượng:
Thẩm định quy trình định lượng theo
ICH gồm các chỉ tiêu: tính tương thích của
hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu,
khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát
hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác,
độ đúng.

43


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Khảo sát quy trình định lƣợng.
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo sát điều kiện sắc ký theo phương pháp nghiên cứu,
ghi sắc ký đồ và phân tích kết quả. Lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời
4 ginsenosid như sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm). Detector PDA 203nm; tốc độ
dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl. Pha động ACN:nước chạy theo chương trình sau:
0 - > 20 phút: 19 - > 20% ACN; 20 - > 30 phút: 20 - > 32% ACN; 30 - > 40 phút: 32 - > 36%
ACN; 40 - > 50 phút: 36 - > 38% ACN.
2. Thẩm định quy trình định lƣợng.
* Tính tương thích hệ thống sắc ký:
Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp Rg1, Re, Rb1 và Rd có nồng độ 50 µg/ml, tiến hành phân
tích sắc ký HPLC 5 lần liên tiếp theo điều kiện đã lựa chọn.
Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
(m/s)
TT
Rg1

Re

Rb1

Rd

Rg1

Re

Rb1

Rd

1

26,91

27,34

39,01

44,03

121094

148579

89957

95763

2

27,02

27,11

38,05

43,89

120634

147556

90238

94613

3

26,93

26,45

39,55

44,93

119234

146867

91078

93971

4

26,94

27,31

38,46

44,02

121154

149668

91555

94722

5

27,03

27,33

39,12

44,78

119134

147578

91473

93587

X

26,97

27,11

38,84

44,33

120250

148050

90860

94531

RSD

0,22

1,4

1,52

1,11

0,8

0,7

0,8

0,9

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu thời gian lưu và diện tích pic của các
ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd đều nhỏ hơn 2%. Như vậy, hệ thống sắc ký hoàn toàn đáp
ứng yêu cầu để phân tích ginsenosid trên.
* Độ chọn lọc - đặc hiệu:
Tiến hành phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong
MeOH ở nồng độ 50 µg/ml và mẫu thử.
44

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

(a)

Rb1

Rd

Rg1 Re

(b)

Rg1
Rb1

(c) Rd
Re

Hình 1: Sắc ký đồ của 4 ginsenosid trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).
Sắc ký đồ của mẫu chuẩn hỗn hợp ginsenosid và mẫu thử Ukata cho thấy: tại thời điểm
xuất hiện pic của ginsenosid của mẫu chuẩn, không xuất hiện pic tương ứng trên mẫu
trắng. Đồng thời, tại thời điểm đó trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện đáp ứng pic tách
hoàn toàn khỏi pic tạp, pic của ginsenosid ở mẫu chuẩn và mẫu thử sắc nét, cân đối. Như
vậy, phương pháp có tính chọn lọc, đặc hiệu cao.
* Khoảng nồng độ tuyến tính:
Chuẩn bị một dãy chuẩn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd với nồng độ trong khoảng từ 20 500 µg/ml. Tiến hành phân tích HPLC theo điều kiện đã lựa chọn.
Bảng 2: Kết quả xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ginsenosid.
C (µg/ml)

20

50

100

200

500

Spic (Rg1) (μV.s)

51063

118994

227967

475735

1181541

Spic (Re) (μV.s)

57892

144456

305441

609638

1495955

Spic (Rb1) (μV.s)

38869

89671

175917

382500

918084

Spic (Rd) (μV.s)

41201

91709

196457

386913

961521

y(Rg1) = 2363 x - 126; R² = 0,9999
Phương trình hồi quy
tuyến tính

y(Re) = 2997x + 1203,1; R² = 0,9999
y(Rb1) = 1842,1x + 479,92; R² = 0,9994
y(Rd) = 1922,3x + 1086,9; R² = 0,9999

45


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid.
Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd
trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ≈ 1.
* Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn
phát hiện và giới hạn định lượng ginsenosid. Từ đó, tiến hành pha thử 4 - 5 nồng độ quanh
điểm dự kiến, kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của Rg1 (2 µg/ml), Re (2 µg/ml), Rb1 (3
µg/ml), Rd (3 µg/ml); giới hạn định lượng dưới của 4 ginsenosid Rg1 (6 µg/ml), Re (6 µg/ml),
Rb1 (8 µg/ml), Rd (8 µg/ml).
* Độ chính xác:
Pha các mẫu LQC (40 µg/ml), MQC (120 µg/ml) và HQC (400 µg/ml), mỗi nồng độ pha
5 mẫu độc lập. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.
Bảng 3: Diện tích pic và ginsenosid ở nồng độ LQC, MQC và HQC.
Rg1
G i n s e n o sDTi d
(µV×s)

Re
RSD
(%)

950833

MQC (120
µg/ml)

948694

RSD
(%)

1214364

949253
HQC (400
µg/ml)

DT (µV×s)

Rb1

1225750

RSD
(%)

734467

1225814
0,3

DT
(µV×s)

Rd

732739

768187
0,2

767627

947301

1217309

736812

772956

953879

1213870

733982

770945

285441

356824

223100

232148

282874

355099

226715

229407

284072
282104
279924

0,7

356059
350338
354366

0,7

221572

RSD

(%)

770817

734067
0,5

DT
(µV×s)

0,9

230729

222634

230637

223487

231432

0,3

0,4

46


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

(1)

LQC (40 µg/ml)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

92138

115736

77738

82402

91954

117294

76468

79468

89316

1,8

117446

1,4

78068

1,6

80714

93781

118945

78093

80563

93089

120034

75245

81249

(9)

1,3

Với nồng độ mẫu kiểm soát LQC, MQC, HQC khi tiến hành phân tích trong ngày cho
kết quả có độ lặp lại cao với RSD < 2%. Như vậy, quy trình phân tích có độ lặp lại cao.
* Độ đúng:
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn (0,4 mg; 1,2 mg; 4 mg). Tiến hành
xử lý mẫu và phân tích HPLC theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn.
Bảng 4: Tỷ lệ thu hồi ginsenosid trong viên nang Ukata.
L ù O n g

L ¦ î n g

T û

(mg)

(%)

c h u È n
v à o

0,4 mg

RSD (%)

1,2 mg

RSD (%)

4 mg

RSD (%)

Rg1

Re

Rb1

Rd

Rg1

Re

Rb1

Rd

0,401

0,393

0,387

0,388

100,0

98,3

96,8

97,0

0,388

0,384

0,375

0,377

97,0

96,0

93,8

94,3

0,397

0,38

0,376

0,373

99,3

95,0

94,0

93,3

1,6

1,7

1,8

2,0

1,6

1,8

1,8

2,0

1,191

1,186

1,161

1,161

99,3

98,8

96,8

96,8

1,161

1,155

1,155

1,171

96,8

96,3

96,3

97,6

1,177

1,165

1,161

1,177

98,1

97,1

96,8

98,1

1,3

1,4

0,3

0,7

1,3

1,3

0,3

0,7

3,969

3,932

3,955

3,943

99,2

98,3

98,9

98,6

3,916

3,961

3,978

3,969

97,9

99,0

99,5

99,2

3,929

3,981

3,920

3,982

98,2

99,5

98,0

99,6

0,7

0,6

0,7

0,5

0,7

0,6

0,7

0,5

Tỷ lệ thu hồi của ginsensosid Rg1, Re, Rb1 và Rd đạt 93% - 100%. Điều đó cho thấy phương
pháp chiết đã lựa chọn cho phép chiết gần như hoàn toàn ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd.

47


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

3. Định lƣợng ginsenosid trong viên
nang Ukata.

là 5,9 mg/viên; 0,68 mg/viên; 5,2 mg/viên và
1,3 mg/viên.

Ukata ở lô 0812, NSX 08.08.2012 được
định lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd
theo quy trình đã xây dựng và thẩm định ở
trên. Phân tích 5 mẫu:

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bảng 5: Hàm lượng ginsenosid trong

viên nang cứng Ukata.
H µ m
g i n s e n o Rsg1 i d
(mg/viên)

X ± SD (n=5)

Re

Rb1

Rd

5,914

0,681

5,157

1,318

±
0,084

±
0,012

±
0,097

±
0,022

Hàm lượng hoạt chất trong viên nang
Ukata như sau: Rg1 = 5,914 ± 0,084 mg/viên;
Re = 0,681 ± 0,012 mg/viên; Rb1 = 5,157 ±
0,097 mg/viên; Rd = 1,318 ± 0,022 mg/viên.
Kết quả định lượng này là cơ sở để đề xuất
tiêu chuẩn hàm lượng hoạt chất của viên
nang Ukata trong tiêu chuẩn cơ sở.

1. Viện Dược liệu. Cây thuốc và động vật làm
thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2002.
2. Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Đào
Văn Đôn, Hoàng Văn Lương, Trịnh Văn Lẩu.
Nghiên cứu định lượng một số ginsenosid chính
trong sinh khối sâm Ngọc Linh bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tạp chí Dược
học. 2008, số 390, tr.41-43.
3. Aik-Jiang Lau , Soo-On Woo , Hwee-Ling
Koh. Analysis of saponins in raw and steamed
Panax notoginseng using high-performance liquid
chromatography with diode array detection. Journal
of Chromatography A. 2003, pp 77-87.
4. Lie Li, Jin-lan Zhang, Yu-xin Sheng, De-an
Guo, Qiao Wang, Hong-zhu Guo. Simultaneous
quantification of six major active saponins of
Panax notoginseng by high - performance liquid
chromatography - UV method. Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis. 2005, 38, pp.45-51.

KẾT LUẬN
Phương pháp HPLC định lượng đồng
thời ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd trong viên
nang Ukata được xây dựng và thẩm định.
Hoạt chất ginsenosid trong mẫu được chiết
siêu âm bằng dung môi MeOH. Điều kiện
HPLC: pha động sử dụng acetonitril - nước,
cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm,
5 mm), detector UV tại 203 nm và tốc độ
dòng 1,5 ml/phút. Quy trình này được thẩm
định đầy đủ theo hướng dẫn của FDA. Hàm
lượng ginsenosid Rg1, Re, Rb1 và Rd lần lượt

48


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014

49