Xác định hàm lượng ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 TRONG
SÂM NGỌC LINH TỰ NHIÊN VÀ SINH KHỐI TẾ BÀO
SÂM NGỌC LINH BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO
Trần Quang Trung*; Phan Thị Thu Hằng*; Nguyễn Văn Bạch*
TÓM TẮT
Áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) để định lượng 3 ginsenoside
(Rb1, Re và Rg1) trong sâm Ngọc Linh và trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, kết quả cho thấy:
+ Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh lần lượt là: 1,0916%,
0,1226% và 1,4215%.
+ Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh lần
lượt là: 0,3281%, 0,0817% và 0,3646%.
Như vậy, tổng hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh gấp 3,4 lần
tổng hàm lượng của 3 ginsenoside này trong sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.
* Từ khoá: Sâm Ngọc Linh; Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

DETERMINATION OF GINSENOSIDE Rb1, Re, Rg1 IN
NATURAL NGOCLINH GINSENG AND ITS PLANT CELL BY
HIGH PERFORMANCE THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
SUMMARY
Applying the method to quantifying ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in natural Ngọclinh ginseng
and its plant cell, the result showed that:
- The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of natural Ngọclinh ginseng was 1.0916%
0.1226% and 1.4215%, respectively.
- The quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 of Ngọclinh ginseng’s plant cell was
0.3281%, 0.0817% and 0.3646%, respectively.
The data indicated that total quantity of three ginsenoside Rb1, Re, Rg1 in 100 grams of
natural Ngọclinh ginseng was 3.4 times as much as its total quantity in 100 grams of
Ngọclinh ginseng’s plant cell.

* Key words: Ngoclinh ginseng, High performance thin layer chromatography.
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Trần Quang Trung ()
Ngày nhận bài: 26/12/2012; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 16/10/2013
Ngày bài báo được đăng: 19/11/2013
25


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sâm Ngọc Linh là dược liệu quý sinh
trưởng ở núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh
Quảng Nam và Kon Tum [2]. Ngoài ra,
từ sâm Ngọc Linh tự nhiên, Học viện
Quân y đã nghiên cứu, sản xuất thành
công sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.
Ginsenoside Rb1, Re, Rg1 là 3 hoạt chất
chính thuộc nhóm dammaran có trong
sâm Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh
khối tế bào sâm Ngọc Linh. Để tiêu
chuẩn hoá chất lượng của nguyên liệu và
các thành phẩm từ sâm Ngọc Linh tự
nhiên và sinh khối tế bào sâm Ngọc

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu nghiên cứu
* Nguyên liệu, dung môi, hoá chất:
- Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên

trên 10 năm tuổi (đã được Viện Dược
liệu - Bộ Y tế thẩm định).
- Sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh
(do Trung tâm Nghiên cứu Y học quân sự,
Học viện Quân y cung cấp).
- Chất chuẩn ginsenoside Rb1, Re, Rg1
loại SH (Hãng Chromadex, Mỹ).
- Các dung môi, hoá chất: đạt tiêu
chuẩn PA.

Linh, việc xác định hàm lượng 3 hoạt

* Dụng cụ và trang thiết bị:

chất trên là việc làm rất cần thiết.

- Hệ thống HPTLC của Hãng DESAGA.

Hiện nay, một số dược điển đã ứng
dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để

- Bản mỏng HPTLC 10 x 10 cm; 20 x
10 cm; 20 x 20 cm.

định lượng các chất trong phân tích định

- Micropipet 2 l; pipet tự động 1 -

lượng [3]. Tuy nhiên ở Việt Nam, chưa
có đề tài nào áp dụng phương pháp

HPTLC để xác định hàm lượng của
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm
Ngọc Linh tự nhiên và sinh khối tế bào
sâm Ngọc linh. Vì vậy, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu xác định hàm lượng
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong sâm
Ngọc Linh tự nhiên và trong sinh khối tế
bào sâm Ngọc Linh bằng phương pháp
HPTLC.

10 l, 1 - 20 l, 100 l, 200 l, 500 l.
- Cột chiết pha rắn C18.
- Máy lắc siêu âm Soniclean của
Australia.
- Máy ly tâm.
- Cân phân tích Mettler có độ chính
xác 0,1 mg.
- Dụng cụ chiết Soxhlet.
- Các loại dụng cụ thuỷ tinh có độ
chính xác thích hợp.
26


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Xây dựng đường chuẩn các gensenosid
Rb1, Re, Rg1:
Từ các chất chuẩn, pha dãy dung dịch
Rb1, Re, Rg1 có nồng độ khoảng 50, 150,

250, 350 và 450 mcg/ml. Tiến hành HPTLC
theo điều kiện của Trần Quang Trung và
CS đã xây dựng [4].
* Chiết xuất saponin toàn phần trong
mẫu thử:
Cân chính xác 1 gam bột sâm Ngọc
Linh (hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc
Linh) cho vào bình nón dung tích 100
ml, gắn được với bộ phận hồi lưu. Thêm
chính xác 50 ml methanol. Cân khối
lượng của bình nón đã chứa mẫu (bao
gồm cả nắp) được khối lượng m1. Đun
hồi lưu cách thủy trong 1 giờ (tính từ lúc
sôi). Để nguội bình nón và cân lại khối
lượng bình nón (gồm cả nắp) được khối
lượng m2. Nếu m2 < m1, thêm methanol
vào bình nón sau khi đun hồi lưu cho
đến khi đạt đến khối lượng m1 ban đầu.
Ly tâm với tốc độ 2.500 vòng/phút trong
10 phút.
Hút chính xác 25 ml dịch trong sau
khi ly tâm. Cô khô trên cách thủy. Hoà
tan cắn trong 5 ml nước cất. Sau đó, ứng
dụng phương pháp chiết pha rắn để xử
lý mẫu [1]. Cụ thể: cho dịch qua cột
chiết pha rắn (C18, 360 mg) đã được hoạt
hoá lần lượt bằng 5 ml methanol, 5 ml
methanol 50%, 5 ml H2O cất. Rửa cột đã
chứa mẫu lần lượt với 20 ml nước, 10 ml

methanol 30% với tốc độ 20 - 25 giọt/phút.
Bỏ các dịch rửa. Rửa giải bằng 40 ml
methanol. Lấy dịch rửa giải cô tới khô
trên cách thuỷ. Hoà tan cắn trong 10 ml
ethanol đem đi chấm sắc ký.
* Phương pháp xử lý mẫu:
- Mẫu thử:
+ Thân rễ (củ) sâm Ngọc Linh tự nhiên
rửa sạch, thái lát mỏng hoặc sinh khối
tế bào sâm Ngọc Linh, sấy khô ở 600C
trong 20 giờ. Nghiền thành bột.
+ Cân chính xác 1 gam bột, chiết theo
quy trình thu được dịch ethanol chấm
sắc ký.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp:
+ Chuẩn hỗn hợp 1: pha dung dịch
có ginsenoside Rb1 nồng độ 51,1875
mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ
20,0625 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng
độ 51,475 mcg/ml.
+ Chuẩn hỗn hợp 2: pha dung dịch có
ginsenoside Rb1 nồng độ 150,9375 mcg/ml;
ginsenoside Re nồng độ 40,125 mcg/ml;
ginsenoside Rg1 nồng độ 200,575 mcg/ml.
+ Chuẩn hỗn hợp 3: pha dung dịch
ginsenoside Rb 1 nồng độ 250,6875
mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ
60,1875 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng
độ 351,45 mcg/ml.
+ Chuẩn hỗn hợp 4: pha dung dịch

ginsenoside Rb1 nồng độ 350,4375 mcg/ml;
ginsenoside Re nồng độ 80,25 mcg/ml;
ginsenoside Rg1 nồng độ 500,55 mcg/ml.
27


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

+ Chuẩn hỗn hợp 5: pha dung dịch
ginsenoside Rb 1 nồng độ 450,1875
mcg/ml; ginsenoside Re nồng độ
100,3125 mcg/ml; ginsenoside Rg1 nồng
độ 651,425 mcg/ml.
* Định lượng các mẫu thử sâm Ngọc
Linh tự nhiên và các mẫu thử sinh khối
tế bào sâm Ngọc Linh:
- Dung dịch thử: dịch chiết saponin toàn
phần các mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên
và sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.
Dung dịch chuẩn: dung dịch chuẩn hỗn
hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong ethanol.
Chấm lần lượt 20 l mỗi dung dịch thử
và dung dịch chuẩn hỗn hợp lên bản mỏng
HPTLC và tiến hành sắc ký với các điều
kiện sau:
- Máy HPTLC (Hãng DESAGA).
- Pha động: chloroform/AcOEt/MeOH/
H2O (15/40/22/10).

- Bản mỏng HPTLC 20 x 10 cm hoạt

hóa ở 1000C trong 30 phút.
- Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4
10% trong ethanol.
Tiến hành định lượng bằng cách dựa
vào đường chuẩn. Diện tích pic mẫu thử
và mẫu chuẩn thực hiện trong cùng một
điều kiện sắc ký. Từ đó, tính hàm lượng
(%) ginsenoside Rb1, Re, Rg1 trong mẫu
sâm Ngọc linh tự nhiên và mẫu sinh khối
tế bào sâm Ngọc Linh theo công thức sau:

Trong đó:
Ct: nồng độ (mcg/ml) của ginsenoside
Rb1 (hoặc Re, Rg1) tương ứng với diện
tích pic thu được từ phổ đồ thông qua
đường chuẩn.
m: khối lượng (g) của sâm Ngọc Linh tự
nhiên hoặc sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh.
k: hệ số pha loãng dung dịch thử.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Rb1, Re, Rg1.

Nồng độ (mcg/ml)

Hình 1: Đường chuẩn ginsenoside Rb1
28


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

Nồng độ (mcg/ml)

Hình 2: Đường chuẩn ginsenoside Re.

Nồng độ (mcg/ml)

Hình 3: Đường chuẩn ginsenoside Rg1.

Trong khoảng nồng độ khảo sát
(50 - 450 mcg/ml) có sự tương quan
tuyến tính giữa nồng độ nồng độ các
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với diện tích
pic và r  1. Các đường chuẩn này có
thể sử dụng để định lượng 3 ginsenoside
Rb1, Re, Rg1 trong mẫu sâm Ngọc Linh
tự nhiên và sinh khối tế bào sâm
Ngọc Linh.

2. Kết quả xác định Rb1, Re, Rg1
trong mẫu thử sâm Ngọc Linh tự nhiên
và mẫu thử sinh khối tế bào sâm Ngọc
Linh bằng phƣơng pháp HPTLC.
* Tạo mẫu thử:
- Mẫu thử 1: cân chính xác 1 gam bột
sâm Ngọc Linh tự nhiên, chiết xuất theo
quy trình trên, thu được dịch ethanol
saponin toàn phần sâm Ngọc Linh tự
nhiên chấm sắc ký.
29

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

- Mẫu thử 2: cân chính xác 1 gam bột
sinh khối tế bào sâm Ngọc Linh, chiết
xuất theo quy trình trên, thu được dịch
ethanol saponin toàn phần sinh khối tế
bào sâm Ngọc Linh chấm sắc ký.
* Tiến hành định lượng:
- Chuẩn bị bản mỏng HPTLC có kích
thước 10 x 10 cm.
- Sấy bản mỏng ở nhiệt độ 1000C trong
30 phút.
- Chấm mẫu thử và dung dịch chuẩn
hỗn hợp ginsenoside Rb1, Re, Rg1 với
thể tích 20 l lên bản mỏng đã sấy.
- Triển khai sắc ký với hệ dung môi:
chloroform/AcOEt/MeOH/H2O (15/40/22/10).
- Sấy khô bản mỏng đã triển khai
xong trên thiết bị sấy chuyên dụng.
- Phun thuốc thử hiện màu là dung
dịch H2SO4 10% trong ethanol.
- Ghi phổ trên máy HPTLC. Tính diện
tích pic. Từ diện tích pic thu được và
phương trình hồi quy tuyến tính, tính
hàm lượng các ginsenoside Rb1, Re và Rg1.
Bảng 1: Hàm lượng các ginsenoside
trong mẫu sâm Ngọc Linh tự nhiên (n = 5).
STT

CÁC
GINSENOSIDE

HÀM
(%)

1

Ginsenoside Rb1

1,0916 ± 0,069

2

Ginsenoside Rg1

1,4215 ± 0,075

3

Ginsenoside Re

0,1226 ± 0,007

Tổng

LƯỢNG

2,6357 ± 0,2975

Bảng 2: Hàm lượng các ginsenoside
trong mẫu sinh khối tế bào sâm Ngọc
Linh.
STT

CÁC
GINSENOSIDE

HÀM
(%)

1

Ginsenoside Rb1

0,3281 ± 0,0197

2

Ginsenoside Rg1

0,3646 ± 0,0243

3

Ginsenoside Re

0,0817 ± 0,0073

Tổng

LƯỢNG

0,7744 ± 0,062

Tổng hàm lượng 3 ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 trong 100 g sâm Ngọc Linh là
2,6357%. Trong khi đó, hàm lượng của
3 ginsenoside trên trong sinh khối tế bào
sâm Ngoc Linh là 0,7744%. Như vậy,
hàm lượng 3 ginsenoside của sâm Ngọc
Linh tự nhiên gấp 3,4 lần so với sinh khối
tế bào sâm Ngọc Linh.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi rút
ra một số kết luận sau:
- Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự nhiên
lần lượt là: 1,0916%, 0,1226% và 1,4215%.
- Hàm lượng của 3 ginsenoside Rb1,
Re, Rg1 trong sinh khối tế bào sâm Ngọc
Linh lần lượt là: 0,3281, 0,0817% và
0,3646%.
- Tổng hàm lượng của 3 ginsenoside
Rb1, Re, Rg1 trong sâm Ngọc Linh tự
nhiên gấp 3,4 lần tổng hàm lượng của 3
ginsenoside này trong sinh khối tế bào
sâm Ngọc Linh.
30

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Tử An (Bộ môn Hoá phân tích và
độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội).
Phương pháp chiết ứng dụng trong kiểm
nghiệm thuốc và độc chất. 2002, tr.33-39 và
tr.76-83.
2. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận,
Nguyễn Thị Thu Hương. Sâm Việt Nam và
một số cây thuốc họ Nhân sâm. Nhà xuất bản
Khoa học và Kỹ thuật. 2007, tr.69-267.

3. Trần Quang Trung, Trịnh Văn Lẩu,
Nguyễn Văn Bạch. Nghiên cứu định lượng
ginsenoside Rb1, Re, Rg1 bằng phương
pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao. Tạp chí
Y - Dược học Quân sự. 2013, tập 38, số 1,
tr.13-18.
4. Pharmacopoeia of the Peoples’s
Republic of China. English Edition, Vol. I.
Chemical Industry Press, 2005, pp.205-207,
pp.223-225. Appendix VI, A, pp.38-40.

31


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

32