Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibodies-Mab)

SẢN XUẤT

KHÁNG THỂ
ĐƠN DÒNG
(Monoclonal antibodies-Mab)


Định nghĩa
Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó
được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B
trong điều kiện in vitro

Là kháng thể với một đặc hiệu
duy nhất cho một vị trí epitope
duy nhất của kháng nguyên
(Milstein)


:

George Kohler và César Milstein – Nobel Y-Sinh học 1984


Kháng thể đa dòng

Kháng thể đơn dòng

Tương tác KN-KT
không chuyên biệt

Tương tác KN-KT

chuyên biệt

Dễ sản xuất

Đòi hỏi kỹ thuật cao

Giới hạn về số lượng

Không giới hạn về số lượng


Kháng thể đơn dòng
1

4

epitope
2

3

Huyết thanh

Kháng thể đa dòng
Kháng thể đơn dòng


8 bước tạo MAb
•
•

•
•
•
•

Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag
Gây đáp ứng miễn dịch
Thu TB lách và TB myeloma
Dung hợp TB lách với TB myeloma
Sàng lọc, dòng hóa hybridoma
Nhân sinh khối MAb bằng phương pháp
in vitro hay in vivo
• Tinh chế MAb
• Thu nhận, kiểm tra MAb


(1a) Chọn động vật gây nhiễm
• Động vật thường được sử dụng để tạo
hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley
rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…
• Mouse là mô hình lý tưởng nhất:
đáp ứng miễn dịch mạnh
tổng hợp kháng thể nhanh
• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản
xuất MAb: BALB/c và C57BL/6


BALB/c

Lai taïo 1967 taïi Ñöùc

•
•
•
•

C57BL/6

Lai taïo 1982 taïi Myõ

Lai cùng dòng
Chuột cái
6-8 tuần tuổi
“sạch tuyệt đối”


Rat

Hamster


Hệ thống chuồng chuột sạch


(1b) Chọn Ag
• Quyết định sự thành công của quy trình
• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản
phẩm tạo thành
• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm
(MAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)

Antigen
• Được nhận diện bởi MAb mục tiêu
• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh
• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt
Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật
protein tái tổ hợp.
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các
hapten phối hợp với protein, vaccine thương
phẩm hay là một phân tử protein nào đó


Các vị trí tiêm Ag

Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)
Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)
Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)
Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)

Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)


(2) Gây đáp ứng MD
Nguyên tắc 1

Phải gây ĐƯMD khác loài
Sử dụng động vật gây nhiễm là mouse
thì phải dùng kháng nguyên có nguồn
gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng

miễn dịch


(2) Gây đáp ứng MD
Nguyên tắc 2

Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng
một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả
năng dung hợp của nó với tế bào lách
- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên
chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay
X63/Ag.8653
- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn
dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3


(2) Gây đáp ứng MD
Nguyên tắc 3

Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương
dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum
• IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương
dầu
• ALUM (Aluminum hydroxide gel)


Với kháng nguyên là protein
Tiêm 10-100g/1 chuột/1 lần
Tá dược thường được sử dụng là CFA

Với kháng nguyên là tế bào
Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần
Tá dược thường được sử dụng là ALUM


Quy trình gây ĐƯMD ở mouse
Ngày

Thao tác

Tá dược

Vị trí tiêm

0

Tiêm mũi cơ bản

CFA

s.c.

14

Tiêm nhắc lại lần 1

IFA

s.c.

28

Tiêm nhắc lại lần 2

IFA

s.c.

36

Thu serum

42

Nghỉ trước khi dung hợp
(hay tiêm nhắc lần 3)

IFA

s.c.

52

Tiêm nhắc lại lần cuối

55

Thu tế bào lách sau khi đã xác định
hiệu giá của Ig trong huyết thanh

i.v.


Quy trình gây ĐƯMD ở rat
Chất bổ trợ

Vò trí tieâm

CFA

i.p.

21 Tiêm nhắc lần 1

IFA

i.p.

42 Tiêm nhắc lần 2

IFA

i.p.

IFA

i.p.

IFA

i.p.

Ngaøy

THAO TAÙC
0 Tiêm mũi cơ bản

52 Kiểm tra serum
53 ELISA

63 Tiêm nhắc lần 3
73 Kiểm tra serum
74 ELISA
84 Tiêm nhắc lần 4
94 Kiểm tra serum
95 ELISA
98 Tiêm nhắc lần cuối
101-110 Thu lách

i.v.


Xác định hiệu giá kháng thể

(1) Pha loãng huyết thanh
theo từng bậc

Undiluted
Huyết

thanh
serum
ban
đầu

1/2

1/4

1/2

1/4

Chứng âm
1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
control

(2) Bổ sung một lượng nhất
định KN vào mỗi tube

Huyết
thanh
Undiluted
ban
đầu
serum

(3) Ủ - xác định độ pha
loãng cao nhất vẫn cho
phản ứng (trong trường

hợp này là 1/16)

Chứng âm
1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
control



Chọn lọc hybridoma
Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)
Tổng hợp nucleotide

Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)

Môi trường chọn lọc HAT

B cell
de novo

Salvage

(HGPRT+)

Chết

Hybridoma
de novo
Salvage
(HGPRT+)

Sống

Myeloma
de novo
Salvage
(HGPRT-)

Chết



Môi trường chọn lọc HAT
Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con đường:
– Con đường De novo cần hoạt động của enzyme
dihydrofolate reductase (DHFR)
– Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine
guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine
– Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR  tế
bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage
– Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine
(hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage


Dung hợp tế bào lách với myeloma
Chuột
Dầu khoáng
Chuột đã được gây MD

Plasmacytoma (Bào tương ung thư)

Myeloma

Lympho B

Không sản xuất Ig
Có bộ máy tiết Ig
“Bất tử” trong in vitro

Sản xuất Ig
Không tồn tại lâu dài trong in vitro

Dung hợp

Hybridoma
Sản xuất Ig
Có bộ máy tiết Ig
“Bất tử” trong in vitro