Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesteron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
--------------







--------------




NGUYỄN HẢI ðĂNG


NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERON




LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : CHĂN NUÔI
Mã số : 60.62.40


Người hướng dẫn khoa học : TS. ðỖ THỊ THẢO

HÀ NỘI - 2008
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
i


LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu của tôi trong luận văn
này là hoàn toàn trung thực, do tôi thực hiện và chưa sử dụng ñể bảo
vệ một học vị nào.
Các trích dẫn trong luận văn ñược ghi rõ tên tài liệu trích dẫn, tác
giả và nguồn gốc tài liệu ñó. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn.



Tác giả




Nguyễn Hải ðăng


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
ii

LỜI CẢM ƠN!

Trong quá trình thực hiện ñề tài của luận văn tốt nghiệp này, ngoài
sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ
nhiệt tình của các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi- Thuỷ sản cùng
toàn thể bạn bè, sự giúp ñỡ tận tình của tập thể cán bộ công nhân viên
Phòng công nghệ tế bào ñộng vật - Viện công nghệ sinh học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. ðỗ Thị Thảo và PGS. TS.
ðỗ Khắc Hiếu, phòng Công nghệ tế bào ñộng vật - viện Công nghệ sinh
học ñã tạo ñiều kiện, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực
hiện ñề tài này.
Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS -TS
Nguyễn Bá Mùi, cán bộ giảng dạy bộ môn sinh hoá - sinh lí ñộng vật -
Khoa Chăn nuôi - Thuỷ sản - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã
hướng dẫn và giúp ñỡ tôi tận tình ñể hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với gia ñình, bạn bè và những
người thân ñã luôn thường xuyên chia sẻ, ñộng viên tôi trong suốt quá
trình học tập.
Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm
2008
Tác giả



Nguyễn Hải ðăng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan...................................................................................................i
Lời cảm ơn .................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................ iii
Danh mục các chữ vết tắt................................................................................v
Danh mục các bảng .......................................................................................vi
Danh mục các hình ..................................................................................... vii
Danh mục các sơ ñồ .................................................................................. viii
1. MỞ ðẦU
................................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của ñề tài...........................................................................1
1.2. Mục ñích của ñề tài là..............................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
....................................................................................... 4
2.1. Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch..............................................................4
2.2. Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron ...........................................28
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực ñề tài............33
3. ðÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
................... 36
3.1. ðỐI TƯỢNG.........................................................................................36
3.2. NỘI DUNG ...........................................................................................37
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................................................37
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
............................................................................. 43
4.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA .....43
4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P
3
- Al...................48
4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron .........51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iv


4.4. Gây báng cho chuột ...............................................................................59
4.5. Kiểm tra hiệu giá kháng thể...................................................................59
5. KẾT LUẬN
............................................................................................................. 63
5.1. KẾT LUẬN...........................................................................................63
5.2. ðỀ NGHỊ ..............................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
........................................................................................ 65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
v


DANH MỤC CÁC TƯ VIẾT TẮT

P
3
- Al (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim)- Albumin.
P
3
- BSA (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim) - BSA
BSA (Bovine Serum Albumin)
ATCC (American Type Culture Collection)
DMEM (Dulbeco s Modified Eagles Medium)
DMSO (Dimethyl Sulphoxide)
EIA (Enzyme Immuno Assay)

ELISA (Enzyme Linking Immuno Sorbent)
FBS (Fetal Bovine Serum)
FSH (Follicle Stimulating Hormone)
FDA (Food and Drug Adminitration)
GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone)
HPRT (Hypoxanthin - Phospho - Ribosyl- Transferase)
HAT (Hypoxanthin - aminopterin- thimidine) medium
LH (Luteinizing Hormone)
PBS (Photphate Buffered Saline)
PEG (Polyethylen glycol) FCA (Freund complex Adjuvant)
RIA (Radio immuno assay)
CNSH (Công nghệ sinh học)
ðƯMD (ðáp ứng miễn dịch)
KN (Kháng nguyên)
KTðD (Kháng thể ñơn dòng)
PTL (Phân tử lượng)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vi


DANH MỤC CÁC BẢNG

Số bảng Tên bảng Trang

1. Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm
............................................ 44
2. Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết
thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P
3

– Al (n=5)
.................... 47
3. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp.
................. 50
4. Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai
.................................................................................................................................. 53
5. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron
trên 2 dòng tế bào.
................................................................................................ 54
6. Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn
............................. 55
7: Giá trị OD của dịch nổi của các giếng dương tính kháng progesteron có 1
dòng tế bào
............................................................................................................. 56
8. Tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra
.................... 58
9. So sánh hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng.
................................... 60
10. Kết quả tinh sạch kháng thể ñơn dòng bằng (SAS) và Propur Kit.
................ 61
11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thí nghiệm
................................................. 62

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
vii


DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hình Tên hình Trang

1. Cấu trỳc ñiển hỡnh của khỏng thể ............................................................11
2. Bề mặt của khỏng thể IgG ........................................................................12
3. Sơ ñồ cỏc chuỗi của một khỏng thể. .........................................................12
4. Cỏc ñộc tố của vi khuẩn bờn cạnh một tế bào cơ thể. ...............................14
5. Cỏc ñộc tố trờn bị trung hoà bởi khỏng thể...............................................15
6. Khỏng thể ñơn dũng liờn kết với một epitope ñặc hiệu.............................19
6. Cụng thức cấu tạo của progesteron ...........................................................30
7. (A) Tế bào Sp2/0 ở ñộ phúng ñại 10ì20; (B) Tế bàoP3X ở ñộ phúng ñại
10ì20 .......................................................................................................49
8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B
kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa
dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào
feeder; .....................................................................................................51
9. (A) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B
kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma
giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá
trình tách dòng.........................................................................................53
10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể ñơn dòng ở các ñộ pha loãng khác nhau; (A)
Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần................................................60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii


DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ

Số sơ ñồ Tên sơ ñồ Trang

1. Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng
.....................................................21
2a. Quá trình hình thành progesteron
............................................................30
2b. Quá trình thái biến của progesteron
........................................................30





1
1. MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của ñề tài
Công nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài
chinh phục tự nhiên ñể nâng cao ñiều kiện sống của con người. Thế giới cùng
nhau chia sẻ những kiến thức khoa học, thực hành và công nghệ. Bên cạnh
những lĩnh vực ñang phát triển rất cao như: công nghiệp ñiện tử, công nghệ
thông tin, chúng ta ñang chứng kiến sự gia tăng phát triển ngày càng lớn
mạnh của công nghệ sinh học (CNSH).
Có nhiều lĩnh vực CNSH khác nhau theo ñối tượng ứng dụng như
CNSH phân tử, CNSH thực vật, CNSH ñộng vật…CNSH có ứng dụng rộng
rãi trong y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hóa chất, vật liệu mới,
nông lâm ngư nghiệp, bảo vệ môi sinh và ngày nay trong thể thao ñỉnh cao
CNSH cũng ñược áp dụng một cách hiệu quả.
Trong CNSH, tế bào ñược coi là ñối tượng trung tâm vô cùng quan
trọng. Chúng có cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao ñổi chất
như một nhà máy hóa học với nhiều ưu việt. Do tế bào có nhiều ưu thế nên
CNSH ñã sử dụng tế bào làm nhà máy sản xuất và là công cụ thử nghiệm.

CNSH tế bào người và ñộng vật có nhiều ứng dụng trực tiếp liên quan ñến
con người nên phát triển rất nhanh, nó ñáp ứng nhiều nhu cầu cho phòng và
chữa trị bệnh và nhiều ứng dụng trong nông nghiệp nhất là trong lĩnh vực
chăn nuôi…ðặc biệt, trong thế kỉ XX ñã có 3 phát minh nền tảng của CNSH
ñộng vật mà cả thế giới phải xôn xao và công nhận, ñó là kháng thể ñơn dòng,
tế bào gốc, và nhân bản vô tính ñộng vật.
Sự ra ñời của kháng thể ñơn dòng là một bước tiến quan trọng, ñặc biệt
là trong chẩn ñoán và có triển vọng lớn trong sản xuất thuốc hướng mục tiêu.


2
Trong quá trình hội nhập kinh tế, phát triển ngành chăn nuôi là chiến
lược trong phát triển ngành nông nghiệp nước ta. ðời sống người dân ngày
càng ñược nâng cao, nhu cầu về các sản phẩm thịt, trứng, sữa tăng mạnh, do
ñó công tác phát triển nhanh ñàn gia súc, gia cầm cần ñược quan tâm, chú
trọng. Bên cạnh việc ứng dụng các kích dục tố ñể nâng cao khả năng sinh sản
thì hướng nghiên cứu sử dụng kháng thể ñơn dòng ñể chẩn ñoán sớm có thai,
phát hiện các rối loạn sinh sản ở con cái…có giá trị thực tiễn. Do trong thời
gian ñầu của quá trình mang thai, bào thai còn quá nhỏ, toàn bộ cơ quan sinh
dục còn biến ñổi chưa nhiều nên rất khó chẩn ñoán khi khám bằng phương
pháp quan sát bên ngoài, sờ, nắn, gõ, nghe, khám qua trực tràng, khám qua
âm ñạo…Mặt khác, còn có thể nhầm với triệu chứng một số bệnh ở cơ quan
sinh dục nên càng khó khăn hơn. Ngoài ra, do mối liên quan giữa hệ thống
màng nhung của nhau thai và niêm mạc tử cung chưa chặt chẽ nên dễ gây xảy
thai.
Progesteron là hormon sinh sản ñược tiết ra chủ yếu từ thể vàng buồng
trứng và một phần do nhau thai. Hàm lượng progesteron có liên quan chặt chẽ
ñến ñộng thái của quá trình sinh sản. Progesteron là hormon “chìa khóa" ñể
thiết lập và duy trì một chu kì sinh sản bình thường của con cái.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ñịnh lượng progesteron trong

huyết thanh, sữa và nước tiểu ñã cho kết quả trong ứng dụng chẩn ñoán có
thai sớm và các bệnh sinh sản liên quan. Tuy nhiên, các phương pháp hóa lí
ñòi hỏi nồng ñộ progesteron phải cao (mg/ml), tách chiết, tinh sạch phức tạp
mới xác ñịnh ñược kết quả. Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể ñơn dòng
(monoclonal antibody) cho kết quả nhạy (µg/ml) không ñòi hỏi tách chiết và
tinh sạch, ñộ chính xác cao hơn.
Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
"Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng
progesteron".



3
1.2 Mục ñích của ñề tài
- Sản xuất ñược kháng thể ñơn dòng kháng progesteron có thể ñược sử
dụng vào các mục ñích ñịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (Huyết
thanh, nước tiểu, nước bọt v.v.)

4

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch
Sinh vật luôn luôn bị ñe dọa bởi các tác nhân gây bệnh và các tác nhân
có hại khác, do vậy phải có sự thích ứng ña dạng ñể bảo vệ mình.
Miễn dịch là khả năng của cơ thể chống lại các kháng nguyên. Kháng
nguyên (KN) là những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như vi trùng, virus, chất ñộc…
ðáp ứng miễn dịch (ðƯMD) là phản ứng của cơ thể nhận ra vật lạ và
loại trừ chúng ra khỏi cơ thể.
Có hai loại ðƯMD là: ðƯMD tự nhiên và ðƯMD thu ñược.
2.1.1. ðƯMD tự nhiên
ðƯMD tự nhiên là ñặc tính không mắc phải một số bệnh của một số
loài hay một số giống sinh vật nhất ñịnh ở lứa tuổi nhất ñịnh và có ngay khi
cơ thể sinh ra, mang tính chất di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, không
ñòi hỏi sự tiếp xúc mầm bệnh (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16].
Có hai loại ðƯMD tự nhiên: ðƯMD tự nhiên tuyệt ñối và ðƯMD tự
nhiên tương ñối.
a. ðƯMD tự nhiên tuyệt ñối
ðây là ðƯMD mà trong bất cứ ñiều kiện nào, hoàn cảnh nào cũng không
bị mất ñi, có thể tiêm vào cơ thể ñộng vật một lượng lớn mầm bệnh cũng
không có khả năng gây bệnh, ví dụ: Bất cứ dưới ñiều kiện nào, bò không bao
giờ mắc bệnh tị thư của ngựa, bệnh dịch tả lợn, ngựa không bao giờ mắc bệnh
dịch tả trâu bò…
b. ðƯMD tự nhiên tương ñối

Là tính miễn dịch có thể thay ñổi khi chịu một sự tác ñộng nào ñó trong
một ñiều kiện và thời gian nhất ñịnh như khi chịu tác dụng cao của ñộc lực vi
sinh vật, hoặc thay ñổi nhiệt ñộ hay sức ñề kháng của cơ thể giảm …


5
Ví dụ: bình thường gà không bao giờ mắc bệnh nhiệt thán nhưng khi ngâm
chân gà trong nước lạnh cho thân nhiệt giảm xuống rồi gây nhiễm vi khuẩn
nhiệt thán thì gà bị bệnh.
2.1.2. ðƯMD thu ñược
ðƯMD thu ñược có hai loại: ðƯMD thu ñược chủ ñộng và ðƯMD thu
ñược bị ñộng.
Trong ðƯMD thu ñược chủ ñộng, cơ thể tiếp nhận kháng nguyên và có
thể tự tổng hợp ra kháng thể. Trong ðƯMD thu ñược bị ñộng, cơ thể ñược
tiếp nhận trực tiếp kháng thể (ví dụ: tiêm truyền kháng thể hay kháng huyết
thanh).
a. Miễn dịch thu ñược chủ ñộng tự nhiên
Là tính miễn dịch mà cơ thể có ñược sau khi mắc một số bệnh nhất ñịnh
trong tự nhiên mà qua khỏi. Loại miễn dịch này có thể kéo dài rất lâu có khi
suốt ñời.
Ví dụ: Sau khi mắc bệnh ñậu mùa mà qua khỏi thì không bao giờ mắc lại
nữa; hay nếu bị bệnh sởi mà qua khỏi thì không bao giờ mắc nữa.
Ngoài ra trong quá trình sống của người và ñộng vật do tiếp xúc dần dần
với vi sinh vật, mà không bị bệnh, nhưng nó ñã hình thành cho mình một khả
năng miễn dịch với các bệnh do vi sinh vật ñó gây nên. Ví dụ miễn dịch hình
thành ñối với bệnh bạch cầu, bệnh ho gà.
b. Miễn dịch thu ñược chủ ñộng nhân tạo
Là miễn dịch có ñược của cơ thể sau khi ñược tiếp nhận chủ ñộng những
chế phẩm vi sinh vật như các vacxin, giải ñộc tố… lúc này cơ thể ñã huy ñộng
các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch sản xuất ra các yếu tố chống lại mầm

bệnh nếu chúng vào lần sau, ñó là các kháng thể ñặc hiệu. ðây là loại miễn
dịch hình thành với mục ñích làm cho cơ thể tập dượt trước, ñể khi vi sinh vật
có ñộc lực xâm nhập vào thì cơ thể sẽ chủ ñộng loại trừ chúng. Chính ñây là
cơ sở cho việc tiêm phòng vacxin: Lao, Dịch tả lợn, ðóng dấu lợn…Tiêm


6
phòng vacxin chính là tạo miễn dịch thu ñươc chủ ñộng nhân tạo cho cơ thể
(Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]. Tiêm vacxin giúp cơ thể tăng khả năng bảo
vệ mình trước tác hại của mầm bệnh. Nhưng ñứng về phương diện miễn dịch
thì miễn dịch chủ ñộng phần nhiều là miễn dịch tương ñối vì nó có thể bị mất
ñi sau một thời gian hoặc bị phá hoại nếu ta tiêm vào cơ thể một lượng lớn vi
sinh vật, ñiều này ñòi hỏi khi tiêm phòng một số bệnh phải chú ý tiêm ñịnh
kỳ.
c. Miễn dịch thu ñược bị ñộng tự nhiên
Trẻ sơ sinh, gia súc non thu ñược các yếu tố miễn dịch, các kháng thể
ñặc hiệu từ cơ thể mẹ truyền sang qua nhau thai hay kháng thể truyền qua sữa
ñầu cho gia súc non ñược gọi là MDTð bị ñộng tự nhiên.
d. Miễn dịch thu ñược bị ñộng nhân tạo
Là ñáp ứng miễn dịch thu ñược từ bên ngoài ñưa vào giúp cơ thể chiến
thắng ñược bệnh tật. Trong trường hợp này, cơ thể không tham gia tạo kháng
thể mà kháng thể ñược cung cấp cho cơ thể từ bên ngoài. MDTð bị ñộng
nhân tạo ứng dụng trong chữa bệnh. Ví dụ: tiêm giải ñộc tố uốn ván cho
người nhiễm uốn ván, tiêm kháng huyết thanh phòng dại…
2.1.3. Các cơ quan và tế bào tham gia vào ñáp ứng miễn dịch
Thực chất của quá trình ðƯMD là hoạt ñộng của hai loại tế bào
lympho B và lympho T với sự tham gia của ñại thực bào và sự phối hợp ñiều
khiển của các cơ quan dạng lympho.
2.1.3.1. Các cơ quan dạng lympho
Các cơ quan dạng lympho trung tâm là nơi mà quá trình biệt hóa của

lympho bào xảy ra không cần ñến sự kích thích của kháng nguyên, ñó là nơi
biệt hoá của các tế bào nguồn thành các tế bào lympho T chín hoặc lympho B
chín.
Các cơ quan dạng lympho gồm có:


7
*Tủy xương (Bone narrow): là cơ quan tạo máu của cơ thể ñóng vai trò quan
trọng trong việc sản xuất ra các tế bào nguồn của các dòng lympho bào khác
nhau và của ñại thực bào. Các tế bào lympho nguồn (non) sẽ ñi ñến các cơ
quan lympho khác ñể biệt hóa thành tế bào lympho B hoặc lympho T.
*Tuyến ức (Thymus): nằm ngay sát sau xương ức, xuất hiện ở tháng thứ ba
của thời kì bào thai, hoàn thiện và ñạt tối ña về hoạt ñộng ở giai ñoạn trước
tuổi dậy thì. Tuyến ức có các nang làm nhiệm vụ sản xuất các tế bào lympho.
Các tế bào lympho ñược sinh ra từ tuyến ức hay từ tủy xương di tản xuống
ñều ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tế bào lympho phụ thuộc
tuyến ức hay còn gọi là lympho T (Thymus).
*Túi Fabricius (Brusa Fabricius)
Túi này chỉ có ở loài chim, nằm phía trên trực tràng, sát lỗ huyệt. Túi
có cấu tạo gồm rất nhiều nang, các nang này là nơi sản xuất các tế bào
lympho. Các tế bào lympho một phần do túi Fabricius tiết ra, một phần di tản
từ tủy xương ñến, ñều ñược tập trung tại ñây ñể huấn luyện, biệt hóa trở thành
tế bào lympho B chịu trách nhiệm ñáp ứng miễn dịch dịch thể hay còn gọi là
tế bào không phụ thuộc tuyến ức.
Ở người và ñộng vật có vú, (cá, bò sát…) không có túi fabricius, mọi
chức năng của túi fabricius do các cơ quan tương ñương ñảm nhận, ñó là tủy
xương và các cơ quan lympho ngoại vi (hạch, lá lách…).
Sau khi trở thành lympho B, các tế bào này ñến các cơ quan như lá lách
, hạch … ñể ñón ñợi kháng nguyên, tiếp xúc với kháng nguyên và chúng ñược
biệt hóa ñể trở thành tế bào sản xuất kháng thể dịch thể.

* Các cơ quan dạng lympho ngoại vi
`*Hạch lâm ba: là một trong những nơi diễn ra ðƯMD chống lại kháng
nguyên khi chúng xâm nhập vào cơ thể.


8
*Lá lách: là cơ quan lympho lớn, có ðƯMD ñối với các kháng nguyên vào
ñường máu, vùng tủy trắng của lá lách có chứa các nang lympho và quá trình
ðƯMD diễn ra ở ñây.
* Các cơ quan khác: Ngoài ra, các hạch hạnh nhân (cơ quan dạng lympho ở
vùng vòm họng, vùng gốc lưỡi), các ñảo nằm phân bố rải rác ở ruột non
(mảng payer) hay ở các phế nang, phế quản, ñường sinh dục, tiết niệu cũng
ñều có các nang lympho nằm ngay dưới lớp biểu mô có chức năng trong miễn
dịch.
2.1.3.2. Tế bào miễn dịch
Trong quá trình tạo kháng thể của cơ thể phải kể ñến vai trò của 3 loại tế bào:
* ðại thực bào: bắt nguồn từ tủy xương, vào máu và có khả năng thực
bào, chúng có mặt ở các hạch, lá lách, gan, phổi, chúng tham gia vào miễn
dịch thực bào, tiêu diệt các tế bào lạ bằng thực bào. ðại thực bào có vai trò
tiếp nhận, hoạt hóa, chuyển vận thông tin, duy trì kháng nguyên và phối hợp
chặt chẽ với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.
* Lympho B: Các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản ñến túi
fabricius (ở chim) hay lách (của thú) ñược huấn luyện, biệt hóa thành tiền
lympho B, sau ñó tiếp tục ñược biệt hóa thành các lympho chưa chín. Ở hệ
máu ngoại vi, các lympho chưa chín ñược biệt hóa thành các lympho B chín,
rồi trở thành tương bào plasma, chính các tương bào này mới là các tế bào
trực tiếp sản xuất ra các kháng thể dịch thể (IgM, IgA, IgG, IgD, IgE)
(Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]. Kháng thể này ñi vào máu, tồn tại trong
huyết thanh và dịch của cơ thể. Tương bào (plasma) có vai trò chủ yếu trong
ðƯMD dịch thể, một tỉ lệ nhỏ tế bào lympho B là những tế bào mang “trí nhớ

miễn dịch”. Ở người và ñộng vật không có túi fabricius thì tủy xương và các
cơ quan lympho khác như hạch, lá lách…ñảm nhận chức năng của túi
Fabricius trong quá trình hình thành tế bào lympho B.


9
* Lympho T: các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản xuống
tuyến ức và ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tiền lympho T,
chúng tiếp tục ñược biệt hóa ở vùng vỏ tuyến ức ñể trở thành lympho T chưa
chín. Các lympho T chưa chín ñược tiếp tục biệt hóa thành lympho T chín ñi
vào hệ máu ngoại vi và ñi ñến các cơ quan, tổ chức khác tại các vùng phụ
thuộc tuyến ức của hạch, lách. Khi ñại thực bào ñưa thông tin kháng nguyên
ñến, các lympho T tiếp nhận rồi biệt hóa trở thành nguyên bào lympho T rồi
tiếp tục trở thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chứa kháng thể
ñặc hiệu trên màng tế bào, gọi ñó là kháng thể tế bào. Quá trình ðƯMD tế
bào do quần thể lympho T phụ trách, thể hiện khả năng tự bảo vệ của cơ thể.
Ví dụ: các bệnh nhiễm trùng gây bởi các vi sinh vật kí sinh trong nội bào (do
virus, vi khuẩn, nấm, ñộng vật ñơn bào), các mầm bệnh này chỉ có thể bị tiêu
diệt hoàn toàn khi có ðƯMD tế bào (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16].
Kháng thể tế bào thường tồn tại trong các tổ chức mô và các cơ quan cơ thể .
2.1.4. Kháng nguyên (Antigen)
Kháng nguyên là vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể gây ra ðƯMD ñặc
hiệu. Không phải tất cả các vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể ñều là kháng
nguyên, chúng phải có kích cỡ ít nhất bằng kích cỡ của một epitope (nhóm
quyết ñịnh kháng nguyên) mới có thể gây ra ðƯMD.
Ví dụ: Nếu kháng nguyên là chuỗi polypeptit thì trọng lượng phân tử phải lớn
hơn 1000 Dalton mới kích thích cơ thể sinh ra kháng thể.
Tính ñặc hiệu kháng nguyên – kháng thể :
Có thể tạm ñịnh nghĩa kháng nguyên là những chất có ñặc tính sau:
- Tính miễn dịch: là khả năng kích thích cơ thể có một ñáp ứng miễn dịch

- Tính ñặc hiệu: là khả năng kết hợp ñặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng
thể ñặc hiệu tương ứng. Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, kháng nguyên
có khả năng kết hợp ñặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt lympho T mẫn cảm.
Tính chất này không phải do toàn bộ cấu trúc của các phân tử kháng nguyên


10
quyết ñịnh mà là các “nhóm quyết ñịnh kháng nguyên” (epitope) nằm trên bề
mặt phân tử kháng nguyên.
-Tính ña trị kháng nguyên: khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể các
tế bào trình diện bắt giữ và biến chúng thành các epitope khác nhau, vì thế mà
kích thích cơ thể sinh ra nhiều kháng thể tương ứng. ðiều này giải thích tại
sao khi tiêm chủng vacxin vi khuẩn nhược ñộc A sẽ thu ñược huyết thanh
chứa nhiều loại kháng thể chống lại A, ñược gọi là một họ kháng thể A (Vũ
Triệu An và cộng sự, 1998) [02].
Căn cứ vào ñặc tính và ñiều kiện kháng nguyên mà chia kháng nguyên
thành hai loại: kháng nguyên hoàn toàn (antigen) và kháng nguyên không
hoàn toàn (hapten).
Kháng nguyên hoàn toàn có ñầy ñủ hai khả năng kích thích cơ thể sinh
kháng thể và sự kết hợp ñặc hiệu với kháng thể do chính kháng nguyên kích
thích sinh ra. Hầu hết các kháng nguyên hoàn toàn có bản chất protein như
các cấu phần của cơ thể ñộng vật, thực vật, vi sinh vật, nọc ñộc ñộng vật…
Kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên,
là những chất có trọng lượng phân tử thấp không có tính kích thích sinh miễn
dịch nhưng có tính ñặc hiệu của kháng nguyên là khả năng kết hợp ñặc hiệu
với kháng thể tương ứng (Lê Văn Hùng, 2002) [08]. Hay nói cách khác là tự
bản thân không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể. ðể trở thành
kháng nguyên hoàn toàn, kháng nguyên không hoàn toàn phải gắn với một
chất mang (carrier), tạo thành phức hợp hapten- carrier và cơ thể phản ứng
với phức hợp này sinh ra kháng thể.

Carrier là những chất có trọng lượng phân tử lớn như BSA…dùng ñể
kết hợp với hapten tạo ra kháng nguyên hoàn toàn.
* ðiều kiện ñể kháng nguyên có tính miễn dịch:
- Kháng nguyên phải có kích thước phân tử lớn (Ngưỡng tối thiểu của
trọng lượng phân tử là 1000 Da) Tuy nhiên có chất có trọng lượng phân tử


11
nhỏ nhưng chúng tìm cách gắn với protein khác ñể trở thành kháng nguyên
hoàn chỉnh; ngược lại một số chất có trọng lượng phân tử lớn như Dextran tới
200.000 Da nhưng không có tính sinh miễn dịch hoặc có nhưng rất yếu.
- Kháng nguyên phải có ít nhất một epitope khác loài vì hệ thống miễn
dịch không phản ứng với epitope cùng loài.
Khái niệm epitope: là những cấu trúc trên bề mặt tác nhân gây bệnh, có
khả năng tác dụng tương hỗ riêng biệt với những thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt
của một số tế bào lympho. Như vậy toàn bộ cấu trúc (tác nhân gây bệnh,
những hạt phân tử) mà trên ñó những epitope hiện diện ñược gọi là kháng
nguyên.
2.1.5. Kháng thể và phản ứng kháng nguyên- kháng thể
2.1.5.1. Kháng thể (Antibody)
a- ðịnh nghĩa
: Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất
glycoprotein) do các tế bào lympho B cũng như tương bào (biệt hoá từ
lympho B) tiết ra ñể hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ
như: vi khuẩn hoặc vi rút. Mỗi kháng thể có thể nhận biết một hay một số
epitope tương ñồng.

Hình 1. Cấu trúc ñiển hình của kháng thể Hình 2. Bề mặt của kháng thể IgG

12

Hình 3. Sơ ñồ các chuỗi của một kháng thể
.
b- Cấu tạo của kháng thể
Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng
(H, heavy, màu tím trong hình 3) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light,
màu xanh lá trong hình 3) cũng giống hệt nhau. Có hai loại chuỗi nhẹ κ
(kappa) và λ (lambda), do ñó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin
chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ. Các chuỗi của immunoglobulin liên kết
với nhau bởi các cầu nối disulfide
và có ñộ ñàn hồi nhất ñịnh (hình 1 và 2).
Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố ñịnh nhưng phần ñầu của hai "cánh
tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, ñể tạo nên các vị trí
kết hợp có khả năng phản ứng ñặc hiệu với các kháng nguyên
tương ứng, ñiều
này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó. Có thể tạm so sánh
sự ñặc hiệu của phản ứng kháng thể - kháng nguyên như ổ khóa và chìa khóa.
Các domain
hằng ñịnh (C, constant,) ñặc trưng bởi các chuỗi amino
acide khá giống nhau giữa các kháng thể. Domain hằng ñịnh của chuỗi nhẹ ký
hiệu là C
L
. Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng ñịnh, tùy theo lớp
kháng thể C
H
1, C
H
2, C
H

3 và C
H
4.
Các domain hằng ñịnh không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng
làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do ñó,


13
phần "chân" của chữ Y còn ñược gọi là Fc (tức là phần hoạt ñộng sinh học
của kháng thể F: fragment, c: cristallisable)
Các domain biến thiên mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V,
variable) ở ñầu tận hai "cánh tay" của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 domain biến
thiên trên chuỗi nặng (V
H
) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (V
L
) tạo nên
vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope). Như vậy, mỗi
immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị trí này giống nhau
như ñúc, qua ñó một kháng thể có thể gắn ñược với 2 kháng nguyên giống
nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận gắn kháng
nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Domain kháng nguyên nơi gắn vào
kháng thể gọi là epitope.
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa
các kháng thể. Chính sự biến thiên ña dạng này giúp cho hệ thống các kháng
thể nhận biết ñược nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau.
Trong miễn dịch dịch thể, cơ thể sau khi chịu sự kích thích của tác nhân
gây bệnh, các tế bào lympho B ñược biệt hóa sản xuất kháng thể dịch thể ñặc hiệu,
ñây là chất dịch sinh học hòa tan trong huyết thanh và trong dịch của cơ thể.
Kháng thể dịch thể có tính ñặc hiệu với kháng nguyên mức ñộ ñặc hiệu

của kháng nguyên phụ thuộc vào tính riêng biệt của epitope mà nó phân biệt.
Trong huyết thanh có nhiều thành phần, ñó là α, β, γ globulin và albumin,
trong ñó chủ yếu là γ globulin, vì vậy người ta thường gọi kháng thể là globulin
miễn dịch hay imunoglobulin, kí hiệu là Ig. Hiện nay, người ta ñã biết có 5 loại
kháng thể dịch thể ñặc hiệu là IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Chúng có cấu trúc gần
giống nhau gồm chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng
thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ khác nhau ở cấu trúc chuỗi nặng. Cả
hai chuỗi ñều có vùng ổn ñịnh (constant region) và vùng dễ biến ñổi (variable


14
region). Hai vùng biến ñổi của chuỗi nặng, chuỗi nhẹ ñều nằm kề nhau tạo vị trí
kết hợp kháng nguyên của phân tử kháng thể ñặc hiệu cho từng kháng nguyên.
c- Vai trò của kháng thể
Trong một ñáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: gắn với
kháng nguyên, kích hoạt hệ thống bổ thể và huy ñộng các tế bào miễn dịch.
Liên kết với kháng nguyên

Hình 4. Các ñộc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể.
Các immunoglobulin có khả năng nhận diện và gắn một cách ñặc hiệu
với 1 kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên. Một thí dụ ñể miêu
tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống ñộc tố vi khuẩn. Kháng thể
gắn với ñộc tố và qua ñó trung hòa ñộc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các
ñộc tố trên lên các thụ thể tế bào. Như vậy, các tế bào cơ thể tránh ñược các
rối loạn do các ñộc tố ñó gây ra (hình 4 và 5).
Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám ñược vào
các tế bào cơ thể. Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là adhesine
, còn
virus sở hữu các protein cố ñịnh trên lớp vỏ ngoài. Các kháng thể kháng-
adhesine và kháng-proteine capside virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn

vào các tế bào ñích của chúng.
Hoạt hóa bổ thể
Một trong những cơ chế bảo vệ cơ thể của kháng thể là việc hoạt hóa
dòng thác bổ thể
. Bổ thể là tập hợp các protein huyết tương khi ñược hoạt hóa
sẽ tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại bằng cách (1) ñục các lỗ thủng trên vi khuẩn,


15
(2) tạo ñiều kiện cho hiện tượng thực bào, (3) thanh lọc các phức hợp miễn
dịch và (4) phóng thích các phân tử hóa hướng ñộng.




Hình 5. Các ñộc tố trên bị trung hoà bởi kháng thể
Hoạt hóa các tế bào miễn dịch
Sau khi gắn vào kháng nguyên ở ñầu biến thiên (Fab), kháng thể có thể
liên kết với các tế bào miễn dịch ở ñầu hằng ñịnh (Fc). Những tương tác này
có tầm quan trọng ñặc biệt trong ñáp ứng miễn dịch. Như vậy, các kháng thể
gắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một ñại thực bào và khởi ñộng hiện
tượng thực bào. Các tế bào lympho NK
(Natural Killer) có thể thực hiện chức
năng ñộc tế bào
và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể
( /> [40].
Quy luật hình thành kháng thể ñặc hiệu
Kháng thể không sản sinh ra ngay sau khi kháng nguyên xâm nhập vào
cơ thể mà kháng thể chỉ xuất hiện sau 6 – 7 ngày, rồi sau ñó tăng dần, ñạt mức
ñộ tối ña sau từ 2 ñến 3 tuần, sau ñó từ từ giảm dần và biến mất sau vài tuần,

vài tháng hoặc vài năm.
Sau khi có kháng nguyên kích thích, các tế bào có thẩm quyền miễn
dịch tiếp nhận kháng nguyên và phải mất một thời gian biệt hóa, phân chia


16
thành tế bào sản xuất kháng thể, lúc ñó mới có kháng thể xuất hiện, sớm nhất
là IgM nối tiếp là IgG.
Nếu ñưa kháng nguyên thêm một lần nữa vào cơ thể có tính chất nhắc
nhở, thì thời gian xuất hiện kháng thể sẽ sớm hơn và kháng thể sinh ra cũng
nhiều hơn, bởi vì khi bị kháng nguyên lần ñầu kích thích một số tế bào có
thẩm quyền miễn dịch ñã biệt hóa trở thành tế bào tiếp nhận thông tin kháng
nguyên, cất giữ lại trở thành tế bào nhớ. Khi KN vào lần sau và tiếp xúc ñược
với các tế bào này, chúng chỉ việc “nhớ lại” ñể sản xuất kháng thể. ðây là cơ
sở của hiện tượng trí nhớ miễn dịch (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16].
Sự hình thành và tồn tại của kháng thể chịu ảnh hưởng của nhiều yếu
tố, ñặc biệt là ñặc tính, bản chất của kháng nguyên kích thích, khả năng ñáp
ứng miễn dịch của cơ thể và ñiều kiện ngoại cảnh cơ thể ñó tồn tại.