Độc tố SEB (Staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn tụ cầu vàng

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

ĐỘC TỐ SEB (Staphylococcal enterotoxin B)
CỦA VI KHUẨN TỤ CẦU VÀNG
Hoàng Cao Sạ*; Hoàng Đặng An Sinh**; Phạm Đức Minh***
TÓM TẮT
Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn tụ cầu. Đối tượng và
phương pháp: nghiên cứu sử dụng các kháng thể đơn dòng kháng độc tố SEB của vi khuẩn
Staphylococcus aureus. Que thử hoạt động dựa trên nguyên lý phản ứng mi n dịch kháng
nguyên-kháng thể xảy ra trên màng mỏng. So sánh khả năng phát hiện của que thử với kỹ
thuật ELISA trên mẫu nhi m SEB. Kết quả: que thử có khả năng phát hiện độc tố SEB ở nồng
độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu 100%. Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố SEB trên mẫu
thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 57% so với kỹ thuật ELISA. Kết luận: Học viện
Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn tụ
cầu với quy mô trong phòng thí nghiệm. Que thử nhanh có giá thành thấp, d sử dụng, khả
năng áp dụng cao trong thực ti n y học và cộng đồng.
* Từ khóa: Vi khuẩn tụ cầu; Độc tố vi khuẩn tụ cầu; Que thử nhanh.

Development of a Rapid Test to Detect SEB (Staphylococcal
enterotoxin B)
Summary
Objectives: To produce lateral flow test for rapid detection of SEB (Staphylococcal enterotoxin B).
Subjects and methods: This study uses monoclonal antibody against SEB. The lateral test
operate based on antigen-antibody immune response on a thin membrane. The detection ability
of the test strip was compared with ELISA on SEB-contaminated samples. Results: The lateral
flow tests have the ability to detect SEB at concentrations of 50 ng/ml and a specificity of 100%.
At the concentration of 50 ng/ml and 25 ng/ml of SEB toxin in the samples, the test strip has a
respective sensitivity of 95% and 57%; compared to ELISA. Conclusion: Military Medical
University has initial successfully made the lateral flow test to detect SEB toxin of Staphylococcus
aureus. The strips are low-cost, easy to use and have high applicability in practice and
community medicine.

* Key words: Staphylococcus aureus; SEB; Lateral flow test.
* Bệnh viện Đa khoa TP. Nam Định
** Học viện Quân y
*** Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Phạm Đức Minh ()
Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 02/03/2016
Ngày bài báo được đăng: 08/03/2016

44


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong các tác nhân gây ngộ độc thực
phẩm do độc tố vi sinh vật, độc tố SEB
(Staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn
tụ cầu vàng là nguyên nhân hay gặp, có thể
gây sốc độc tố dẫn đến tử vong [1, 7].
Ngoài nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm,
vi khuẩn tụ cầu vàng còn có thể gây
nhi m khuẩn huyết do chủng đa kháng
thuốc rất nguy hiểm, tỷ lệ tử vong cao [8].
Trong hoạt động quân sự, độc tố vi khuẩn
tụ cầu còn có nguy cơ sử dụng trực tiếp
như một vũ khí sinh học nguy hiểm.
Tại Hoa Kỳ, S. aureus là 1 trong 5 tác
nhân gây bệnh hàng đầu liên quan đến
bệnh truyền qua thực phẩm. Trung tâm
Kiểm soát và Ngăn ngừa Bệnh (CDC) ước

tính hàng năm có khoảng 240.000 bệnh
nhân với 1.000 ca nhập viện và 6 trường
hợp tử vong liên quan đến ngộ độc thức
ăn do tụ cầu vàng [7].
Tại Việt Nam, tình hình vệ sinh an toàn
thực phẩm đang ở mức báo động, ngộ
độc thực phẩm trong cộng đồng do độc tố
của tụ cầu vàng thường xuyên xảy ra [1].
Chính vì vậy, phát hiện độc tố vi khuẩn tụ
cầu vàng trong thực phẩm và một số
bệnh phẩm khác giúp cho quá trình chẩn
đoán, điều trị và dự phòng đạt kết quả
cao [1, 4].
Hiện nay, que thử nhanh đã và đang
chiếm ưu thế trong ứng dụng y học và
các lĩnh vực liên quan. Nguyên lý của que
thử nhanh được Singer và Plotz (1956)
[6] khởi đầu nghiên cứu và phát triển,
cho đến nay nghiên cứu có nhiều cải tiến.
Đối tượng phát hiện và nguyên liệu chế
tạo que thử nhanh không chỉ dừng lại ở
kháng nguyên, kháng thể mà có thể là

các sợi Oligos [5]. Với ưu điểm giá thành
thấp, d áp dụng, độ chính xác cao, que
thử nhanh đang là mục tiêu của nhiều
phòng thí nghiệm cũng như các công ty
sản xuất sản phẩm liên quan đến sinh
học phân tử. Học viện Quân y hiện đang
quản lý và khai thác một hệ thống dây

chuyền sản xuất que thử nhanh, bước
đầu chế tạo thành công một số loại que
thử ứng dụng trong chẩn đoán [2, 4, 5].
Hệ thống phun que thử (Arista, Hoa Kỳ),
có khả năng hoạt động bán tự động hoặc
tự động hoàn toàn với công suất từ 1.000 10.000 que thử/24 giờ.
Hiện tại có một số phương pháp
thường dùng để phát hiện vi khuẩn tụ
cầu vàng và độc tố SEB trong thực phẩm
bao gồm: nuôi cấy; phương pháp ELISA;
phương pháp khuếch đại gen (PCR), que
thử nhanh [8]. Trong đó que thử nhanh có
ưu thế trong sàng lọc và được ưu tiên
sử dụng. Xuất phát từ những yêu cầu đó,
đề tài nhằm: Chế tạo thành công que thử
nhanh phát hiện độc tố SEB của vi khuẩn
tụ cầu với quy mô trong phòng thí nghiệm.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
. Đối tƣợng nghiên cứu.
- Độc tố chuẩn: độc tố SEB (Staphylococcal
enterotoxin B) của vi khuẩn tụ cầu, code
S4881 (Sigma).
- Độc tố đối chứng: (1) độc tố SEA
(Staphylococcal enterotoxin A) của vi
khuẩn tụ cầu, code S9399 (Sigma); (2)
độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile
toxin) của vi khuẩn E. coli, code E8656
(Sigma); (3) độc tố CTX (Cholerae toxin)
của vi khuẩn tả, code G-117 (Enza Life

Sciences).

45


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

2. Vật liệu nghiên cứu.
* Dụng cụ, thiết bị: dụng cụ và thiết bị
chuyên dụng của Phòng Vi sinh vật và
Mầm bệnh sinh học, hệ thống sản xuất
que thử nhanh (Hãng Arista, Hoa Kỳ) tại
Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân
sự, Học viện Quân y.
* Kháng thể:
Có 3 kháng thể được gắn lên màng:
kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt
giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3).
Kháng thể phát hiện (Detection Antibody)
là C86400M sẽ được gắn với hạt vàng,
sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp
(Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture
antibody) là C86220M, sẽ gắn lên màng
NC ở vị trí test line. Kháng thể kiểm tra là
ABCAM-0500, sẽ gắn lên màng NC ở vị
trí vạch đối chứng (control line).

3. Phƣơ g pháp ghi

cứu.

* Phương pháp chế tạo que thử nhanh:
- Thiết kế:
Thiết kế chế tạo que thử nhanh dựa
theo quy trình của Công ty Arista (Hoa
Kỳ). Đầu tiên các loại màng sẽ được xử lý
bằng dung môi thích hợp, để khô, tiếp theo
phun lên màng kháng thể, cuối cùng lắp
ghép các bộ phận và giữ chặt trên một đế
nhựa. Quá trình tiến hành ở điều kiện
nhiệt độ khoảng 25oC, độ ẩm tương đối
dưới 40%. Sau khi hoàn thành, cất giữ
sản phẩm trong gói hàn nhiệt kín, có vật
liệu chống ẩm bảo quản.

* Màng gắn trên que thử:
Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ
phận chính sau: màng hút mẫu (Sample
pad); màng chứa chất cộng hợp màu
(Conjugate pad); màng NC (Nitrocellulose
membrance); màng hút trên (Absorbent
pad) và đế nhựa giữ (Plastic adhesive
backing card) của que thử. Được đặt mua
của Công ty Ahlstrom, P.O. Box 329,
Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki,
Phần Lan và Công ty Advanced Microdevices
(mdi), 20-21 Industrial Area, Ambala Cantt
133 006, Ấn Độ.
* Dung môi xử lý màng:
Các màng đều có chức năng riêng biệt

và tối ưu hóa hoạt động của que thử, đều
phải xử lý trước khi gắn lên test. Mỗi
dung môi sẽ đặc hiệu cho một loại màng
nhất định và làm tăng hoạt tính của màng
sau xử lý.

46

1. Màng hút mẫu
2. Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1)
3. Màng phát hiện đầu tiên
4. Màng nitrocellulose
5 (a). Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2)
5 (b). Vạch đối chứng (chứa KT3)
6. Màng hút trên
7. Đế nhựa giữ

Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test
phát hiện nhanh.
- Nguyên lý hoạt động của que thử:
Kháng thể phát hiện (KT1) sẽ gắn với
kháng nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể
bắt giữ (KT2). Nếu phản ứng mi n dịch
đặc hiệu xảy ra sẽ cho kết quả vạch
dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp
gặp kháng thể kiểm tra (KT3) sẽ làm xuất
hiện màu tại vạch đối chứng.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

- Tối ưu hóa:
Công đoạn tối ưu hóa sẽ cho công
thức phối hợp tối ưu giữa nồng độ kháng
thể cũng như các hóa chất khác trên que
nhúng sao cho đảm bảo nguyên tắc “sử
dụng hàm lượng tối thiểu các chất để tạo
được thiết bị có tính năng tối ưu”.
* Phương pháp thử nghiệm que nhúng
với mẫu thử:
Đối chiếu que nhúng với kỹ thuật ELISA
trong thử nghiệm với mẫu độc tố để xác
định độ nhạy và độ đặc hiệu. Đánh giá độ
nhạy của que thử qua khả năng phát hiện
mẫu SEB ở các nồng độ pha loãng khác
nhau (5 - 200 ng/ml). Kiểm chứng độ đặc

hiệu với độc tố SEA của vi khuẩn tụ cầu,
độc tố không chịu nhiệt LT của vi khuẩn
E. coli và độc tố CTX của vi khuẩn tả.
4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.
* Địa điểm nghiên cứu: Labo Vi sinh và
các mầm bệnh sinh học, Trung tâm nghiên
cứu Y Dược học Quân sự, Học viện
Quân y và Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện
Quân y 103.
* Thời gian nghiên cứu: từ 10 - 2014 đến
10 - 2015.
5. Xử lý số liệu.
Quản lý và phân tích số liệu bằng phần

mềm Epi.info 7.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Chế tạo và tối ƣu hóa que hú g.
* Nồng độ kháng thể trên màng que thử:

Hình 1: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.

Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.

47


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card.
Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test.
Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card cho
tín hiệu có thể nhận biết được.
* Khả năng phát hiện của que thử trên mẫu độc tố chuẩn:

Hình 4: Thử que nhúng với độc tố SEB ở nồng độ 25 ng/ml.

Hình 5: Thử que nhúng với độc tố SEB ở nồng độ 50 ng/ml.
Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test.
Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét khi mẫu SEB ở nồng độ 50 ng/ml
sau thời gian 15 phút.
2. Tí h đặc hiệu của que thử.

48

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

Hình 6: Thử que nhúng với các độc tố SEA, CTX, LT nồng độ 100 ng/ml.
Vị trí KT3: vạch chứng; vị trí KT2: vạch test.
Que thử cho kết quả âm tính (tín hiệu tại vạch chứng KT3) với độc tố SEA của vi
khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố CTX của vi khuẩn tả và độc tố LT của vi khuẩn
Escherichia coli đều cho kết quả âm tính.
3. So sánh que thử với kỹ thuật ELISA trong phát hiệ độc tố SEB.
Bảng 1: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhi m
SEB nồng độ 50 ng/ml.
ELISA

Kết quả

Tổng

(+)

(-)

(+)

114

0

114

(-)

6

0

6

120

0

120

Que thử nhanh
Tổng

Se [95%CI] = 0,95 [0,89 - 0,98]

Bảng 2: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhi m
SEB nồng độ 25 ng/ml.
ELISA

Kết quả

Tổng

(+)

(-)

(+)

68

0

68

(-)

51

1

52

119

1

40

Que thử nhanh
Tổng

Se [95%CI] = 0,57 [0,48 - 0,66]

Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố SEB trên mẫu thử, que thử có độ nhạy
lần lượt 95% và 57% so với kỹ thuật ELISA về khả năng phát hiện độc tố SEB.

49


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

BÀN LUẬN
1. Quy trình chế tạo que thử nhanh.
Nghiên cứu sử dụng kết quả từ một
khảo sát trước đó của tác giả trên 04
kháng thể đơn dòng phát hiện độc tố SEB
cho thấy các kháng thể có khả năng phát
hiện kháng nguyên khác nhau, xếp theo
thứ tự tăng dần của độ nhạy lần lượt là:
C01544M, C01543M, C86220M, C86400M.
Dựa trên những kết quả đó, quá trình
sàng lọc và lựa chọn sẽ cho cặp kháng
thể tối ưu để sử dụng trên que thử. Kết
quả khảo nghiệm cho thấy khi nồng độ
kháng thể 0,5 µg/card tại màng cộng hợp
và màng NC của cặp kháng thể C86220M,
C86400M sẽ cho tín hiệu rõ.

nhau. Kết quả cho thấy tín hiệu của que
thử có thể phát hiện được bằng mắt
thường khi nồng độ độc tố trong mẫu thử
là 50 ng/ml trong 5 - 10 phút.
Do thời gian phát hiện nhanh, nên trên
thực tế que thử nhanh sẽ giúp ích trong
sàng lọc nhanh các mẫu thực phẩm nhi m

độc tố trước khi tiến hành xét nghiệm sâu
hơn, điều này làm giảm chi phí trong xét
nghiệm chẩn đoán. Khi áp dụng phương
pháp này cùng với những phương pháp
khác, đặc biệt phương pháp khuếch đại
gen định lượng và mi n dịch định lượng,
các nhà khoa học có thể trả lời nhanh và
chính xác về chủng loại vi khuẩn, số lượng

Sản xuất que thử cần quan tâm đến
giá thành sản phẩm, do vậy cần sử dụng
lượng nguyên liệu tối thiểu để có sản
phẩm đạt yêu cầu. Chính vì những lý do
này nên công thức phối hợp tối ưu về
hàm lượng kháng thể tại màng cộng hợp
(KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra
(KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng
(KT3) lần lượt: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card. Với
các nguyên liệu và hóa chất phục vụ chế
tạo que thử hiện tại, giá thành 01 que thử
khoảng 10.000 VND. Trong tương lai, có
thể nghiên cứu dùng kháng thể polyclonal
thay thế cho monoclonal nhằm tăng ngưỡng
phát hiện và giảm chi phí tạo kít.

mầm bệnh bị nhi m trong thực phẩm và

2. Khả ă g phát hiện của que thử
nhanh với độc tố SEB của vi khuẩn tụ
cầu vàng.

kỹ thuật ELISA để so sánh khả năng phát

Que thử nhanh sau khi tối ưu được
thử với độc tố SEB ở các nồng độ khác

thấy que thử có độ tương đồng cao

50

nồng độ độc tố có trong mẫu [4].
Để đánh giá tính đặc hiệu của que thử,
một số đối tượng được chọn là độc tố
SEA của vi khuẩn tụ cầu vàng và độc tố
của hai vi khuẩn đường ruột phổ biến và
có tính độc cao, đó là độc tố không chịu
nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn
E. coli và độc tố CTX (Cholerae toxin) của
vi khuẩn tả. Kết quả cho thấy que thử
không có phản ứng chéo với 2 loại độc tố
SEA, LT và CTX.
Dựa trên sự tương đồng về nguyên lý
mi n dịch [3, 6], nghiên cứu đã lựa chọn
hiện độc tố SEB trên mẫu nghiên cứu ở
những nồng độ khác nhau. Kết quả cho
(95%) với ELISA ở nồng độ 50 ng/ml và


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016

thấp hơn (57%) ở nồng độ 25 ng/ml. Điều

toàn có thể đáp ứng được yêu cầu thực

này có thể do ngưỡng phát hiện của

tế khi điều tra vụ dịch.

ELISA (10 ng/ml) thấp hơn nhiều so với

Nhờ đặc tính này, que thử tạo ra do có
thể phát hiện nhanh và chính xác độc tố
SEB nên có thể khẳng định nguyên nhân
gây ngộ độc trực tiếp. Chứng tỏ que thử
có ý nghĩa thực ti n cao khi so với các
kỹ thuật chỉ phát hiện được vi khuẩn
S. aureus đơn thuần.

que thử nhanh (50 ng/ml) [3] nên khả
năng phát hiện của ELISA nhạy hơn so
với que thử nhanh, đặc biệt ở những mẫu
có nồng độ thấp. Trên thực tế, để chẩn
đoán chính xác, cần phối hợp một số kỹ
thuật, trong đó que thử nhanh chỉ là
nghiệm pháp sàng lọc [4, 5].
3. Giá trị ứng dụng thực tiễn của
que thử nhanh phát hiệ độc tố SEB
của vi khuẩn tụ cầu.
Tại Việt Nam, tình huống hay gặp ngộ
độc thực phẩm do tụ cầu khuẩn vàng

(Staphylococcus aureus) là ở tiệc cưới,
liên hoan. Do phải chuẩn bị cho nhiều
suất ăn nên thức ăn cần nấu trước và để
qua đêm (> 6 giờ). Tụ cầu khuẩn nhi m
từ môi trường hoặc từ người chế biến sẽ
phát triển rất nhanh trong thức ăn có hàm
lượng dinh dưỡng thích hợp (trứng, thịt,
hải sản) và sinh ra độc tố đường ruột.
Độc tố này rất bền với nhiệt, do đó trước
khi ăn, mặc dù có đun lại cũng không huỷ
được độc tố. Khi ăn phải thức ăn có
nhi m độc tố SEB, chỉ sau 30 phút đến 1
giờ sẽ xuất hiện các triệu chứng nôn
mửa, tiêu chảy [1].
Do ngưỡng gây bệnh của độc tố SEB
rất thấp, chỉ cần 100 ng độc tố đã có thể
gây ra triệu chứng ngộ độc nên kỹ thuật
phát hiện cần có độ nhạy cao [8]. Que

KẾT LUẬN
Đã chế tạo được que thử nhanh phát
hiện độc tố vi khuẩn tụ cầu vàng ở quy
mô phòng thí nghiệm. Que thử sử dụng
kháng thể phát hiện (Detection Antibody)
là C86400M với khối lượng 0,5 µg/card,
kháng thể bắt giữ (Capture antibody) là
C86220M với khối lượng 0,5 µg/card và
kháng thể kiểm tra (Control antibody) là
ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card.
Que thử có khả năng phát hiện được độc

tố SEB ở nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc
hiệu tuyệt đối và độ nhạy 95% so với kỹ
thuật ELISA tại nồng độ này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Hùng Long, Phạm Đức Minh.
Thực trạng ngộ độc thực phẩm giai đoạn
2006 - 2010. Tạp chí Y - Dược học Quân sự.
2015, Vol 40, No 2, tr.02-09.
2. Phạm Đức Minh, Lê Quốc Tuấn,
Nguyễn Hùng Long, Hoàng Văn Lương.
Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện
trực khuẩn Listeria monocytogenes. Tạp chí

thử nhanh trong nghiên cứu này có

Y - Dược học Quân sự. 2012, Vol 37, No 2,

ngưỡng phát hiện 50 ng/ml nên hoàn

tr.72-77.

51


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016
3. Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long,

6. Singer JM and Plotz CM. The latex

Hoàng Văn Lương. Nghiên cứu ứng dụng

fixation test. Application to the serologic

kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố vi khuẩn tả.

diagnosis of rheumatoid arthritis. American
Journal of Medicine. 1956, 21, pp.888-892.

Tạp chí Y học Việt Nam. 2014, tập 419, 6 (1),
tr.46-49.
4. Phạm Đức Minh, Hoàng Văn Lương.
Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện
độc tố vi khuẩn tả. Tạp chí Y - Dược học
Quân sự. 2015, Vol 40, No 2, tr.18-24.

7. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ,
Tauxe RV, Widdowson MA, Roy SL, Jones
JL, Griffin PM. Foodborne illness acquired in
the United States-major pathogens. Emerg
Infect Dis. 2011, 17 (1), pp.7-15.

5. Hong Nhung Tran et al. Optical nanoparticles:

8. Tallent SM, Degrasse JA, Wang N,
Mattis DM, Kranz DM. Novel platform for the

synthesis and biomedical application. Adv.

detection of Staphylococcus aureus enterotoxin

Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 6 (2015) 023002

B in foods. Appl Environ Microbiol. 2013, 79 (5),

(14pp). doi:10.1088/2043-6262/6/2/023002.

pp.1422-1427.

52