Nghiên cứu tạo đột biến khử độc và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp staphylococcal enterotoxin b (seb) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong thực phẩm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


i


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
-------*-------



PHAN THỊ HOÀNG HẢO


NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN KHỬ ĐỘC
VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ
HỢP STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN B (SEB) PHỤC
VỤ CHO VIỆC CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN TỤ CẦU VÀNG
TRONG THỰC PHẨM


Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NCVC Chu Hoàng Hà




Thái Nguyên, Năm 2010






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây do tôi và nhóm cộng
sự nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học
thực hiện từ tháng 3 tới tháng 9 năm 2010.

Hà Nội, ngày 27 tháng 09 năm 2010
Học viên ký tên

Phan Thị Hoàng Hảo














Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


iii
LỜI CẢM ƠN
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. NCVC Chu
Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, TS. Phạm Bích Ngọc phòng Công nghệ tế bào
thực vật, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá
trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS. Nghiêm Ngọc Minh đã cho phép tôi tham
gia thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho tạo kít phát hiện nhanh ngộ độc thực phẩm do độc
tố tụ cầu vàng”
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình của TS. Lê Văn Sơn, TS. Lâm Đại Nhân, CN. Hoàng Hà, Ths. Lê Thu Ngọc

và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật cùng các bạn sinh viên trong phòng.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh
học, Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học
đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và
Viện.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành
bản luận văn này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!


Phan Thị Hoàng Hảo







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


iv
MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. ix
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. xi
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3

1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc tố ruột
staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam................................ 3
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm ....................................................... 3
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Saphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam .................... 4
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................................... 6
1.2.1. Đặc điểm phân loại ...................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học ................................................................................ 6
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc .......................................................................... 6
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh .................................................................... 7
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ............................................... 10
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B .............................................. 10
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B ....................................... 10






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


v
1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B .................................... 12
1.3.3. Staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp và tiềm năng ứng dụng ............ 14
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 16
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ............................................ 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid ....................................................................... 16
2.1.2. Các bộ kít .................................................................................................... 16
2.1.3. Hóa chất, máy móc và thiết bị ................................................................... 16

2.1.4. Môi trƣờng và đệm .................................................................................... 17
2.1.5. Cặp mồi sử dụng ........................................................................................ 17
2.1.6. Phần mềm................................................................................................... 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 17
2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 17
2.2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 18
2.2.2.1. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................. 18
2.2.2.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR)...................... 20
2.2.2.3. Phƣơng pháp xử lý enzym hạn chế ........................................................ 20
2.2.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch ADN từ gel agarose .......................................... 22
2.2.2.5. Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào vector .......................................... 23






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


vi
2.2.2.6. Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào vi khuẩn Escherichia
coli DH5α ............................................................................................................. 24
2.2.2.7. Phƣơng pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn Escherichia coli
DH5α .................................................................................................................... 24
2.2.2.8. Biểu hiện protein staphylococcal enterotoxin B tái tổ hợp trong tế bào
vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21(DE3) ...................................................... 26
2.2.2.9. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide .......................... 26
2.2.2.10. Phƣơng pháp tinh sạch protein ............................................................ 27
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28

3.1. Kết quả nhân gen seb phục vụ cho thiết kế vector biểu hiện ...................... 29
3.1.1. Thiết kế mồi ............................................................................................... 30
3.1.2. Kết quả PCR nhân gen seb ........................................................................ 31
3.1.3. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên gen seb .................................. 32
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện pET21a+ mang gen seb đột biến ........... 34
3.2.1. Xử lý enzym hạn chế tạo đầu cắt so le trên pET21a+ .............................. 34
3.2.2. Phản ứng gắn đoạn gen đích seb vào vector biểu hiện ............................. 36
3.2.3. Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng phản ứng colony-PCR ......... 37
3.2.4. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzym hạn chế ................... 38
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện ……. ……….……40
3.3. Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEB tái tổ hợp ......................... 39






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


vii
3.3.1. Biến nạp vector tá i tổ hợ p pET21a+/SEB vào Escherichia coli chủng
BL21(DE3) ........................................................................................................... 40
3.3.2. Kiểm tra sự biểu hiện gen seb.................................................................... 41
3.3.3. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện gen seb ...................................................... 43
3.3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp SEB .............................................................. 47
KẾT LUẬN .......................................................................................................... 49
KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


viii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Deoxyribonucleic acid
APS Ammonium persulphate
ARN Ribonucleic Acid
bp Base pair
cs Cộng sự
dH
2
O Nước khử ion
dNTP Deoxyribonucleotide
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
IPTG
Isopropylthio--D-galactoside
Kb Kilobase
LB Luria and Bertani
PBS Phosphate buffer saline
PCR Polymerase Chain Reaction
S. aureus Staphylococcus aureus
SDS Sodium dodecyl sulfate
SEB Staphylococcal enterotoxin B

SEs Staphylococcal enterotoxins
v/p Vòng / phút








Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


ix


DANH MỤC BẢNG












Bảng Tên bảng Trang

1.1 Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009 5
2.1 Chu kì phản ứng PCR 20
2.2 Công thức pha gel tách (12%) 27
2.3 Công thức pha gel cô (5%) 27
3.1 Trình tự cặp mồi nhân bản đoạn gen seb đột biến từ vector GS45350 31






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


x







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


xi
DANH MỤC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử 7
1.2 Các độc tố quyết định của S. aureus 8

1.4 Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB 12
1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T 13
2.1 Sơ đồ các bước thí nghiệm 18
3.1 Các axit amin sai khác giữa protein SEB đột biến và protein SEB kiểu dại 29
3.2 Sơ đồ vector GS45350 mang gen seb đột biến 30
3.3 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và
mSEB- R
32
3.4 Điện di sản phẩm seb sau tinh sạch 33
3.5 Điện di plasmid pET21a+ 35
3.6 Điện di plasmid pET21a+ sau khi cắt bằng các enzym hạn chế 35
3.7 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp pET21a+/SEB vào tế bào khả biến E.
coli DH5α
36
3.8 Kết quả điện di colony-PCR để chọn dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ
hợp
37
3.9 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pET21a+/SEB của các dòng
khuẩn lạc
38
3.10 So sánh trình tự nucleotide của wtseb và mtseb bằng phần mềm Bioedit 39
3.11 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen seb bằng cặp mồi mSEB- F và R 41






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

xii
3.12 Điện di so sánh protein tổng số của các tế bào E.coli BL21(DE3) 42
3.13 Điện di so sánh khả năng biểu hiện protein SEB ở các nhiệt độ khác nhau 45
3.14 So sánh khả năng biểu hiện protein SEB tại các điều kiện khác nhau 46
3.15 Điện di kiểm tra protein SEB dạng tan trước khi tinh sạch 47
3.16 Điện di kết quả tinh sạch protein SEB tái tổ hợp 48











Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


1
MỞ ĐẦU
Thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn, độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn chứa các chất
có tính độc hại đối với người ăn là một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến
trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền khoa học và y học phát triển cũng như
các nước lạc hậu, kém phát triển. Tại Việt Nam, trong những năm gần đây số vụ
nhiễm độc thực phẩm cũng ngày càng tăng và hậu quả ngày càng nghiêm trọng.
Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất ở
người và có khả năng gây nhiều bệnh khác nhau. Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể

do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột
chiếm ưu thế về số lượng. Độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) bền với
nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S.
aureus. Hiện nay, việc phòng bệnh và điều trị bệnh ngộ độc do tụ cầu gặp rất nhiều
khó khăn vì không phát hiện kịp thời tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc xác định sự có
mặt SEB trong mẫu bệnh phẩm và thực phẩm đóng vai trò hết sức quan trọng.
Trên thế giới và tại Việt Nam hiện nay cũng đã phát triển các loại kít phát hiện
nhanh tác nhân gây bệnh dựa trên nguyên tắc liên kết miễn dịch, phương pháp này
đòi hỏi cần có kháng thể đặc hiệu. Do vậy việc biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên
SEB tái tổ hợp không có độc tính, có khả năng gây phản ứng miễn dịch tạo các
kháng thể IgG đặc hiệu là cấp thiết.
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo đột
biến khử độc và biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal
enterotoxin B (SEB) phục vụ cho việc chế tạo kít phát hiện tụ cầu vàng trong
thực phẩm. ”










Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


2
Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung
Nghiên cứu hệ thống biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
staphylococcal enterotoxin B (SEB) đã được gây đột biến loại độc tính phục vụ cho
việc chế tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng (S. aureus) trong thực phẩm.
Mục tiêu cụ thể
- Thiết kế hệ vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã
được gây đột biến loại độc tính.
- Biểu hiện và tinh sạch protein SEB trong tế bào vi khuẩn E. coli tạo nguyên liệu
tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm.
Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện được mục tiêu đặt ra, đề tài thực hiện những nội dung chính sau:
- Nghiên cứu tạo vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp SEB đã
được gây đột biến loại độc tính.
- Nghiên cứu các điều kiện để tối ưu khả năng biểu hiện protein SEB trong tế bào vi
khuẩn E. coli.
- Tinh sạch protein SEB để sử dụng làm nguyên liệu tạo kít phát hiện vi khuẩn tụ
cầu vàng trong thực phẩm.











Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc tố
ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Khái quát về bệnh ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm là một bệnh cấp tính xảy ra khi ăn phải thức ăn bị nhiễm
vi khuẩn hoặc độc tố của vi khuẩn hoặc thức ăn có chứa các chất độc hại đối với
người ăn. Bệnh có tính chất đột ngột, có thể nhiễm độc cho nhiều người tại cùng
một thời điểm khi họ tiêu thụ cùng 1 loại thức ăn. Ngộ độc thực phẩm có những
triệu chứng của một bệnh cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy .v.v hoặc kèm theo các
triệu chứng khác tùy theo từng loại tác nhân gây ngộ độc [43].
Thế giới đang trong kỷ nguyên toàn cầu hoá, việc sản xuất và phân phối sản
phẩm thực phẩm không bị bó hẹp trong không gian địa lý dẫn đến khả năng lan tràn
khắp thế giới các bệnh do thực phẩm ô nhiễm. Đồng thời, trong quá trình công
nghiệp hoá, thực phẩm thường được sản xuất hàng loạt, đã làm số ca mắc các bệnh
do thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể trong vòng 10 năm trở lại đây [21]. Hậu quả và
thiệt hại kinh tế do các bệnh lây truyền qua thực phẩm rất lớn và có xu hướng ngày
càng tăng.
Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm: vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng và virus;
trong đó các loại vi khuẩn gây ra tới 90% ca bệnh và tử vong ở người [9]. Trong số
các nguyên nhân đã được xác định, một số vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc cấp
tính rất nguy hiểm, với tỷ lệ tử vong cao như: Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio chlolera, Samonella aureuslmonella,
Campylobacterer, Yersinia enterocolitica .v.v [12]. Ở các nước châu Á, tụ cầu vàng
(S. aureus) là nguyên nhân hàng đầu gây ra ngộ độc [2] .
Thực phẩm ô nhiễm các vi sinh vật và các độc tố của chúng là một trong
những nguyên nhân gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, xảy ra ở các các nước có nền
khoa học và y học phát triển cũng như các nước lạc hậu, kém phát triển [37]. Tại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


4
Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp
nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), thịt hun khói (100%), xúc xích
(96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v. Đáng chú ý là vi khuẩn S. aureus
thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn [5].
1.1.2. Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus và độc
tố ruột staphylococcal enterotoxin B trên thế giới và tại Việt Nam
Tụ cầu S. aureus là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận
sớm nhất vào đầu những năm 1880. Sự liên quan của tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm
độc thức ăn được biết đến từ năm 1914, nhưng mãi tới năm 1930, Dack và cs mới
xác định được nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu có thể gây ra bởi các độc tố ruột có
trong dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [4].
Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực
phẩm do S. aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là
ruốc); 22% các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7%
từ cá, sò, ốc .v.v và 3,5% từ trứng [38]. Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S.
aureus được ghi nhận trong hai năm (1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt
là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng và các
sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [17]. Tại Hoa
Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S. aureus được báo cáo giữa các
năm 1975 và 1982 thì 36% là do tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát,
11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên

quan tới sữa và hải sản [41]. Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ
nhiễm tụ cầu nhất cũng khác nhau.
Cho tới nay tại Việt Nam thực tế chưa có những thống kê cụ thể về số ca mắc
hay tử vong do ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB. Có nhiều nguyên nhân gây
khó khăn cho quá trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm do SEB: 1)
Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm sự điều trị tại các cơ sở chuyên
khoa; 2) Chẩn đoán tại khoa cấp cứu các bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


5
hiện gần giống bệnh do SEB gây ra, nên chưa kết luận đúng bệnh; 3) Việc tiến hành
các nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột
SEB của tụ cầu vàng ở Việt Nam hiện nay còn khá mới mẻ, chủ yếu vẫn dựa vào
các phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức và thời gian kéo dài. Do đó,
khi bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu và các nội độc tố như SEB sẽ gặp nguy hiểm gấp
bội vì SEB là một siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , có thể dẫn
tới tử vong ở người.
Bảng 1.1. Sơ bộ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng trên toàn quốc từ 2007 – 2009.


Dựa theo bảng 1.2 trên đây, chúng tôi nhận thấy tình trạng xuất hiện vi sinh
vật S. aureus ở các loại thực phẩm diễn ra khá phổ biến trong cả nước. Vi khuẩn có
thể gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người trong cùng một thời điểm khi họ cùng tiêu

STT

Địa điểm

Thời gian
Số người
mắc bệnh
Đặc điểm
bệnh nhân
1 Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ 9/2007 100 Học sinh
2
Mầm non Vườn Hồng, P9 - Tân Bình; Tiểu học Âu
Cơ, Q11 - TP HCM
12/ 2007 65
Trẻ em
(từ 2-5 tuổi)
3 Minh Long - Quảng Ngãi 2/2008 53 Người dân
4 Hà Nội 5/2008 122
Khách dự
đám cưới
5 Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008 100 Công nhân
6 Sơn La 9/2008 581 Người dân
7 Tiểu học Tam Bình, Q. Thủ Đức -TP HCM 11/ 2008 51
Học sinh và
phụ huynh
8
Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng
Hải Dương
8/2009 160 Công nhân

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


6
thụ một loại thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm do S. aureus có thể xảy ra với bất kì
đối tượng nào. Tuy nhiên, người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ
dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc nặng nề hơn [3].
Việc tìm ra phương pháp phát hiện sớm S. aureus và độc tố SEB của nó gây
nhiễm trùng nhiễm độc trực tiếp trên thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng và cấp
thiết, nhằm loại bỏ và có biện pháp xử lý sớm đối với các thực phẩm đang nhiễm
độc nhiễm trùng. Chính vì vậy, việc tiến hành đề tài này sẽ là một nhu cầu thực tiễn
và cấp bách.
1.2. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ
Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphyococcus
aureus.
- Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884 [6].
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ
cầu có coagulase và tụ cầu không có coagulase. S. aureus gây bệnh ngộ độc thực
phẩm là tụ cầu có coagulase. Nhờ enzym này mà trên môi trường nuôi cấy có máu,
vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng nên còn được gọi là tụ cầu vàng.
Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng
nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn. Nhưng dựa

vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn.
Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm
I, II, III, IV. Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S. aureus [4].
1.2.2. Đặc điểm vi khuẩn học
1.2.2.1. Hình dạng và kích thƣớc
Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa
chùm nho) là những cầu khuẩn có đường kính khoảng 1 μm, không di động và sắp






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


7
xếp theo mọi hướng tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho. Chúng là các
cầu khuẩn Gram dương, không có lông, không tạo nha bào và thường không có vỏ
(Hình 1.1).

Ngoài ra, cầu khuẩn S. aureus không có khả năng tạo bào tử như các vi khuẩn
Chlamydomonas perfringens, Chlamydomonas botulinum, và Bacillus cereus cũng
thường được tìm thấy trong các thực phẩm nhiễm khuẩn [41].
1.2.2.2. Độc tố và khả năng gây bệnh
- Các loại độc tố
Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốc nhiễm
độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic;
độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung
huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin (staphylokinase); coagulase;
hyaluronidase; β – lactamase và độc tố ruột (enterotoxin) – trong đó có SEB [4].
Ngoài ra, tụ cầu có hệ enzym phong phú góp phần làm tăng độc lực của chúng đối
với các tế bào vật chủ.
Hình 1.1. Hình ảnh các vi khuẩn S. aureus dưới kính hiển vi điện tử.






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


8
Hình 1.2. Các độc tố quyết định của S. aureus
(Nguồn:

Độc tố ruột được sản xuất bởi phần lớn các chủng tụ cầu vàng, nhưng không
phải là tất cả mọi chủng. Các độc tố này là những protein tương đối bền với nhiệt,
nên không bị phá hủy bởi sự đun nấu, có trọng lượng phân tử từ 28000-30000
Dalton và bao gồm 6 loại (type) được ký hiệu từ A tới E [4]. Ono và cs (2008), đã
phát hiện ra 2 loại độc tố mới là SES và SET cũng nằm trong nhóm những độc tố
ruột do S. aureus tạo ra [27]. Về miễn dịch, các loại này được phân biệt khá rõ ràng,
mặc dù giữa chúng có những kháng nguyên chéo. Về cơ chế gây bệnh, độc tố ruột
kích thích miễn dịch ở cơ thể vật chủ tạo ra một lượng lớn interleukin I và II. Các
enterotoxin có thể được xác định bằng các kỹ thuật miễn dịch [4]. Trong các dạng
độc tố ruột do S. aureus sinh ra thì các độc tố SEA, B, C và D là những độc tố
thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố của tụ cầu. Ngoài ra
SEB còn là một trong những nhóm độc tố do vi sinh vật sản sinh ra được liệt kê
trong danh mục vũ khí sinh học dùng để tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh
sinh học [16].







Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

9
- Cơ chế gây bệnh
Việc tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý
nghĩa quan trọng trong quá trình phòng chống bệnh. Bước quan trọng đầu tiên trong
quá trình tương tác giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ là sự bám dính (adherence)
của tác nhân gây bệnh vào các bề mặt của vật chủ. Các bề mặt này bao gồm da,
niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đường tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn (tổ chức
lympho, biểu mô dạ dày ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô). Giống như các vi
khuẩn Gram dương khác là Streptococcus và Mycobacteria, S. aureus bám dích vào
bề mặt vật chủ nhờ các adhensin có bản chất polypeptide. Một khi đã bám dính vào
bề mặt tế bào vật chủ, tác nhân gây bệnh như S. aureus mới có khả năng khởi động
các quá trình hóa sinh đặc hiệu gây bệnh như tăng sinh, bài tiết độc tố, xâm nhập và
hoạt hóa các chuỗi tín hiệu của tế bào vật chủ. S. aureus sẽ tiếp tục tiến sâu vào
trong cơ thể vật chủ để tiếp tục chu trình xâm nhập (invasion). S. aureus xâm nhập
ngoại bào bằng cách tiết một số enzym như: hyaluronidase; hemolysine, leukocidin;
exfoliatine .v.v, phá hủy các thành phần cấu tạo tế bào vật chủ [44, 45].
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu có thể do ăn, uống phải độc tố ruột của tụ cầu hoặc
do tụ cầu vàng vốn cư trú ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng. Nguyên nhân là
sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi
khuẩn đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt, tạo điều kiện thuận lợi cho tụ
cầu vàng tăng trưởng về số lượng. Ngoài bệnh nguyên do là tụ cầu, một số trường
hợp có thêm vai trò của vi khuẩn Clostridium difficile [4]. Ước tính khoảng 0,1 μg
S. aureus đã đủ gây ngộ độc thực phẩm ở người. Tuy nhiên, lượng này cũng có thể
thay đổi tùy thuộc độ nhạy cảm với tác nhân ở mỗi bệnh nhân [14, 41].
- Triệu chứng ngộ độc thức ăn do nhiễm tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Ngộ độc thức ăn do tụ cầu S. aureus và độc tố của nó thường có các triệu
chứng cấp tính. Thời gian ủ bệnh của tụ cầu vàng ngắn hơn (chỉ 1-6 giờ) thời gian ủ
bệnh của nhóm vi khuẩn đường ruột gây ngộ độc thức ăn khác (trung bình 2-3 giờ).

Bệnh nhân ngộ độc thức ăn do tụ cầu xuất hiện các triệu chứng nôn ói, đau quặn






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


10
bụng và tiêu chảy dữ dội, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước. Triệu
chứng tiêu chảy do tụ cầu cũng không kèm theo máu và ít mất nước hơn so với tả
và E. coli. Bệnh nhân không sốt hay phát ban, đây là đặc điểm để phân biệt giữa
ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng với các nhóm vi khuẩn khác; thần kinh người
bệnh bình thường. Phần lớn trường hợp bệnh tự khỏi và hồi phục trong vòng 8-24
giờ sau khởi phát nhưng trường hợp nặng có thể bị tụt huyết áp và gây tử vong.
Bệnh nhân ngoài ra có thể bị sốc do mất nhiều nước và chất điện giải. Khác với ngộ
độc thực phẩm do vi khuẩn thông thường không gây sốt hoặc sốt nhẹ, bệnh nhân
mắc ngộ độc do độc tố SEB của S. aureus sẽ bị sốt cao [3].
1.2.3. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus
Hiện nay người ta cũng đã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ
cầu vàng được kí hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315,
Mu50, RF122 .v.v. [7, 15, 19, 8, 23, 18]. Ví dụ: Steven và cs đã thành công trong
việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng S. aureus COL. Kết quả giải
trình tự đã được ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và
CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo đó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ít các
cặp G-C, điều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng
tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác [34].
Trong số các chủng S. aureus phân lập từ các mẫu thực phẩm, tỷ lệ giống

enterotoxigenic được ước tính khoảng 25% [10]. Tại Pháp, trong số 61 chủng phân
lập từ pho-mát và sữa tươi có 15,9% chủng là giống enterotoxigenic [30]. Ở Pháp,
trong 332 chủng S. aureus được phân lập từ nhiều loại thức ăn có 57% chủng chứa
các gen seg, seh, sei và sej xuất hiện với tần số cao hơn hẳn chủng chứa gen sea và
see, trước đây vốn được xem là chiếm ưu thế [29, 41].
1.3. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B
1.3.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B
SEB là 1 trong các nội độc tố được sinh ra bởi vi khuẩn S. aureus. Thông
thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận
chuyển ion và nước của ruột, do đó được gọi là enterotoxin (độc tố ruột) [11].






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


11
Độc tố ruột SEB bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ
ngộ độc thực phẩm do S. aureus [11]. Độc tố ruột SEB được hình thành khi tụ cầu
S. aureus sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ môi trường gia tăng đột
ngột, thiếu oxy, sự mất cân bằng trong áp suất thẩm thấu .v.v [3].
Đóng vai trò là một trong những nội độc tố quyết định của vi khuẩn S. aureus
nên SEB được nghiên cứu khá chi tiết. Trình tự axit amin của SEB đã được xác
định từ năm 1970 [20]. Giống như các cấu trúc protein ngoại bào khác của S.aureus
thường được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy hay trong thực phẩm bị ô nhiễm,
protein SEB bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 axit amin ở đầu
N’. Đoạn trình tự tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEB tiết ra ngoài môi trường

nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhất định. SEB dạng hoạt
động trong môi trường ngoài tế bào gồm 239 amino axit trong 1 chuỗi polypeptit
đơn, có khối lượng phân tử khoảng 28,336 KDa. Ở dạng hoạt động protein SEB có
cấu trúc gồm: 7 cấu trúc xoắn α, 14 phiến gấp nếp β và một cầu nối disulphit nối
cystein ở vị trí 120 và 140 [46]. Theo Gleason và cs (2009), protein SEB có 2 vùng
cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặt chẽ nên cho phép SEB chống
lại sự tác động của các proteases, gồm trypsin, chymotrypsin và papain có trong
ruột [11].
Staphylococcal enterotoxin B có cấu trúc và đặc tính sinh học gần giống với
các độc tố ruột khác là A, C, D, E, F, G ,S, T cùng do vi khuẩn S. aureus tạo ra. Đặc
biệt, trình tự axit amin của SEB có mối tương đồng cao với trình tự axit amin độc tố
ruột C1 cũng có 239 axit amin [13]. SEB chỉ thiếu các vị trí bám của kẽm so với các
siêu kháng nguyên staphylococcal enterotoxin A, C2 và D chỉ có một vị trí bám trên
phân tử MHC nhóm II. Phân tích chi tiết vị trí bám trên TCR của các kháng nguyên
SEA, SEB và SEC2 sẽ chỉ ra sự khác biệt dẫn tới hiệu quả bám lên vùng Vβ [11].
Năm 1986, Christopher và cs đã xác định thành công trình tự gen seb của
chủng vi khuẩn S. aureus S6. Theo đó, trình tự của 1 gen seb hoàn thiện được tính
từ codon mở đầu ATG ở vị trí nucleotide 244, sau đó là vùng khung đọc mở gồm






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


12
798 nucleotide, và kết thúc tại codon TGA tại vị trí nucleotide thứ 1042 [13]. Đoạn
gen seb phân lập từ các chủng được phân lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau đã

được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu chi tiết. Trình tự gen seb của các chủng
khác nhau như PM36 (AB479118, ATCC14458, AY518386), COL (CP000046,
AF410775) .v.v đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI) [26, 15, 40].
Cấu trúc tinh thể của protein SEB trình bày ở hình 1.4 được xác định ở độ
phân giải 1,5 A là độ phân giải cao nhất cho đến nay dành cho 1 siêu kháng nguyên.






1.3.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B
Staphylococcal enterotoxin B (SEB) là trung gian kích thích các lympho T ở
hệ miễn dịch của các vật chủ. Các độc tố liên kết trực tiếp đến phức hợp protein
(MHC) lớp II trên bề mặt tế bào đích, sau đó kích thích gia tăng số lượng lớn các
lympho T. SEB được coi là một "siêu kháng nguyên” của vi khuẩn vì có thể tạo
thành một “cầu nối” giữa MHC lớp II của các tế bào trình diện kháng nguyên và
vùng Vβ của các thụ thể tế bào T như CD 4, CD 8; từ đó, kích thích hoạt hóa các tế
Hình 1.4. Mô phỏng cấu trúc 3 chiều của protein SEB
(Nguồn : http//www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=3SEB )






Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


13

bào T biểu hiện các đoạn gen Vβ mà không cần thiết phải có một quá trình chế biến
và trình diện thông thường. Điều này gây ra sự sản sinh một số lượng lớn của
cytokine, interleukin 2 (IL-2), các yếu tố hoại tử khối u β (TNF-β), và các
interferon. Nếu ăn thực phẩm có SEB bệnh nhân có các triệu chứng như chán ăn,
buồn nôn, nôn, và tiêu chảy. Các triệu chứng này xuất hiện là do các cytokine trong
các tế bào T của lông ruột được sinh ra ồ ạt [11].
















SEB dễ dàng hòa tan trong nước, tính chất hóa học tương đối ổn định. SEB có
khả năng chịu tác động cơ học ở mức vừa phải và có thể chịu được nhiệt độ sôi
trong vài phút. Nếu được bảo quản trong môi trường đông lạnh khô, SEB có thể
được lưu trữ trong hơn một năm [11].
Hình 1.5 Siêu kháng nguyên và miễn dịch không thụ động của các tế bào T.
Siêu kháng nguyên bám trực tiếp vào phức hợp MHC lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên
bên ngoài vị trí bám thông thường của kháng nguyên. 1/5 các tế bào T trong cơ thể bị kích thích
sản xuất cytokin một cách ồ ạt gây lên hiện tượng shock độc tính trong cơ thể.

(Nguồn: