Phân tích di truyền từ một tế bào để phát hiện đột biến gây bệnh beta thalassemia bằng phương pháp minisequencing

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TỪ MỘT TẾ BÀO ĐỂ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH BETA-THALASSEMIA
BẰNG PHƢƠNG PHÁP MINISEQUENCING
Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang*; Đặng Tiến Trường* Nguyễn Đình Tảo*
Triệu Tiến Sang*; Nguyễn Thu Hà**; Hoàng Đặng An Sinh*
TÓM TẮT
Mục tiêu: hoàn thiện quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh beta -thalassemia từ 1 tế bào
bạch cầu bằng phương pháp minisequensing. Đối tượng và phương pháp: tế bào bạch cầu
lympho của 9 bệnh nhân (BN) hoặc người mang đột biến gen beta-globin được tách khỏi máu
toàn phần bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng dùng ficoll, lấy 1 bạch cầu dưới kính hiển vi soi
nổi, sau đó ly giải tế bào, nhân gen beta-globin bằng nested PCR, chạy minisequensing, điện di
tự động phát hiện đột biến gây bệnh đối chiếu với kết quả phân tích từ máu toàn phần bằng
phương pháp ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR. Kết quả và kết luận: các đột biến trên đối
tượng trong phạm vi nghiên cứu đều được phát hiện khi phân tích với 1 tế bào bạch cầu, phù
hợp kết quả phân tích từ máu ngoại vi toàn phần để phục vụ cho chẩn đoán di truyền trước
chuyển phôi.
* Từ khóa: Beta-thalassemia; Một tế bào; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ; Minisequencing.

Single Cell Genetic Analysis for Mutation Detection in Beta-thalassemia
Using Minisequencing Method
Summary
Objectives: Setting up a protocol for detection of beta-thalsassemia induced mutations from
unique lymphocyte using minisequencing method. Subjects and methods: 9 peripheral blood
lymphocytes of beta-thalassemia patients or beta-globin mutation carriers were isolated using
density gradient centrifugation with ficoll. One lymphocyte was taken using stereoscopic microscope,
then lysised. Beta-globin gene was amplified with nested PCR. Minisequencing and electrophoresis
were performed to detect mutations in comparison with ARMS-PCR and multiplex ARMS-PCR
method. Results and conclusions: All kinds of common mutations in the subjects were detected
using unique lymphocyte as same result using whole peripheral blood sample.

* Key words: Beta-thalssemia; Single cell; Preimplantation genetic diagnosis; Minisequencing.
* Học viện Quân y
** Viện Huyết học Truyền máu Trung ương
Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa ()
Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/11/2014
Ngày bài báo được đăng: 27/12/2014

32


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

ĐẶT VẤN ĐỀ
Beta-thalassemia là một trong những
bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trên
thế giới [1]. Ở Việt Nam, ước tính có
khoảng 5 triệu người mang gen và bị
bệnh. Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ
được sinh ra mắc bệnh thalassemia. Các
đột biến gen beta-globin gây ra bệnh
beta-thalassemia thường là các đột biến
điểm. Tại khu vực Đông Nam Á, một số
đột biến thường gặp là: Cd17, Cd 41/42,
Cd71/72, -28, IVS1-1, IVS1-5, IVS2-654,
CD26, CD95 [2].
Điều trị cho những BN này tạo ra gánh
nặng cả về kinh tế cũng như tinh thần cho
gia đình và toàn xã hội. Chính vì vậy, việc
phòng bệnh và khống chế sự phát tán
bệnh ra cộng đồng là rất cấp thiết.

Hiện nay, bằng một số biện pháp can
thiệp chẩn đoán trước sinh như chọc hút
nước ối hay sinh thiết gai rau đã phần
nào hạn chế sinh ra những trẻ bị bệnh.
Tuy nhiên, những phương pháp này
thường tiến hành khá muộn, nếu dừng
thai kỳ sẽ ảnh hưởng lớn tới sức khỏe
thai phụ. Chẩn đoán di truyền trước
chuyển phôi (Preimplantation genetic
diagnosis - PGD) là phương pháp sàng
lọc phôi bất thường về mặt di truyền
được thực hiện trước khi cấy phôi vào tử
cung người mẹ, đây là một phương pháp
dự phòng hiệu quả các bệnh di truyền,
trong đó có beta-thalassemia [3, 4, 5, 6].
Tuy nhiên, đây là một kỹ thuật khó, chỉ
tiến hành trên 1 hoặc 2 tế bào [1].
Minisequencing là phương pháp trực tiếp,
sử dụng các mồi đặc hiệu và nucleotid
gắn huỳnh quang để phát hiện đột biến
điểm [2]. Để thực hiện kỹ thuật này, cần
có một quy trình phát hiện đột biến gen
33

trên 1 tế bào. Do đó, chúng tôi thực hiện
nghiên cứu này với mục tiêu: Hoàn thiện
quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh
beta-thalassemia từ 1 tế bào bạch cầu
bằng phương pháp minisequensing, làm
tiền đề cho chẩn đoán di truyền trước

chuyển phôi.
ĐỐI TƢỢNG, HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
9 mẫu máu của 9 thành viên thuộc 3
gia đình gồm bố, mẹ mang gen đột biến
gây bệnh beta-thalassemia có con bị
bệnh beta-thalassemia đang điều trị tại
Trung tâm Thalassemia, Viện Huyết học
Truyền máu Trung ương, có kết quả sàng
lọc đột biến beta-thalassemia từ ADN
máu toàn phần bằng phương pháp
ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR
(làm đối chứng). Tất cả các trường hợp
được lấy 5 ml máu cho vào ống chống
đông bằng EDTA để tiến hành các bước
tiếp theo (tách tế bào, ly trích ADN, nhân
gen, tiến hành giải trình tự tại Trung tâm
Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học
viện Quân y).
2. Hóa chất.
- Hóa chất tách bạch cầu: dung dịch
cân bằng, dung dịch ficoll (d = 1,077).
- Hóa chất ly giải tế bào: dung dịch
KOH 0,2 M, dung dịch tricine 0,2 M.
- Hóa chất tinh sạch: SAP, EXO1.
- Hóa chất điện di tự động: hidi-formamid,
geneScan-120 LIZ.
- Hóa chất cho PCR: PCR Reaction
mix, ADN polymerase, primers, minisequensing

primers, SNaPshot multiplex kit.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

- Thiết bị: máy ly tâm văng, kính hiển vi
soi nổi có độ phóng đại 320X, buồng thao
tác PCR (Mỹ), máy PCR ABI 9700
(Applied Biosystem), hốt ủ hóa chất (Hàn
Quốc), máy điện di tự động 3130xl Genetic
analyzer, hệ thống điện di trên gen.
3. Phƣơng pháp nghiên cứu.
- Tách tế bào bạch cầu bằng phương
pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng ficoll-paque
theo quy trình của nhà sản xuất.
- Pha loãng bạch cầu bằng dung dịch
PBS 1X, gắp 1 tế bào bạch cầu trên kính
hiển vi soi nổi đặt vào ống PCR 0,2 ml.
- Ly giải tế bào bằng 5 μl KOH 0,2 M, ủ
650C trong 10 phút, trung hòa KOH bằng
5 μl tricine 0,2 M.
- Tiến hành phản ứng nested PCR
theo Wang và CS (2003), có cải biên [2].
Cụ thể:

+ PCR vòng 1: nhân gen beta-globin
với thể tích 50 μl chứa dịch ly giải 1 tế
bào bạch cầu; 0,2 μm mỗi primer vòng 1;
0,2 mM mỗi loại deoxyribonucleotid
triphosphat (dNTP) và 2,5 đơn vị HotStarTaq

ADN polymerase (Qiagen) trong 1X PCR
buffer chứa 1,5 mM MgCl2.
+ PCR vòng 2: nhân gen beta-globin,
sử dụng 3 μl sản phẩm PCR vòng 1 với
thể tích 50 μl. Thành phần phản ứng
tương tự như vòng 1, ngoại trừ ADN
polymerase giảm còn 1 đơn vị. Chu trình
nhiệt tương tự như PCR vòng 1.
- Minisequencing được tiến hành với
SNaPshotTM multiplex ready reaction mix
(Applied Biosystems) và 0,2 μm mỗi
minisequencing primer theo quy trình của
nhà sản xuất.
- Trình tự mồi gen beta-globin 2 vòng:

beta-F1*

ACGGCTGTCATCACTTAGAC

HUMHBB: 62010-62029

beta-R1*

AAGAGGTATGAACATGATTAGC

HUMHBB: 63466-63445

BGLO-2F

GTCATCACTTAGACCTCACC

HUMHBB: 62016-62035

BGLO-2R

CAGAATAATCCAGCCTTATCC

HUMHBB: 63424-63404

1.457 bp

1.409 bp

Bảng 1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nested PCR.
phót
0

95 C

45 giây

0

56 C

45 giây

0

72 C

2 phút

0

5 phút

72 C

chu kú

30 chu kỳ

1 chu kỳ

Sản phẩm nhân vòng 2 được tinh sạch bằng 2 enzym SAP và EXO1, chạy multiplex
minisequensing theo quy trình kit ABI PRIMER TSNaPshot Multiplex (Applied Biosystems)
với các mồi minisequencing.

34


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

Bảng 2: Trình tự các mồi sử dụng cho
minisequencing.

SNP-654

TGATAATTTCTGGGTTAAGG

SNP-28

(gact)7 GATGGCTCTGCCCTGACTT

Cd 26)

(gact)3 CAACCTGCCCAGGGCCT

Cd 17R

act (gact)7
CAACTTCATCCACGTTCACCT

Cd 28R

(gact)6 GATGGCTCTGCCCTGACTT

Cd 71/72F
IVSI-1R

kế, băng điện di rõ, nét, đẹp, không thấy
sản phẩm phụ.
2. Kết quả điện di tự động phát hiện
đột biến.
A TT
THB16

T
THM16

C

ct (gact)8
AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA
TCTTGTAACCTTGATACCAA

Sản phẩm minisequencing được điện
di huỳnh quang trên máy 3130xl Genetic
analyzer, phân tích bằng phần mềm
GeneMapper ID v 3.2. Đánh giá kết quả
phát hiện đột biến dựa vào kích thước,
màu sắc và độ lớn của các pic thu được
trên điện di huỳnh quang.
KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn
1. Kết quả nhân gen beta-globin.

Hình 2: Hình ảnh điện di tự động sản
phẩm minisequencing mẫu THM16
và THB16.
THM16 (mẫu máu của người mẹ gia
đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd26,
pic bên phải màu đen là nucleotid C (bình
thường), pic bên trái màu đỏ là nucleotid
T (đột biến).
THB16 (mẫu máu của người bố gia
đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd17,
pic bên phải xanh lá cây là nucleotid A
(đột biến), pic bên trái đỏ là nucleotid T
(bình thường).

A

T

T
THC16

Hình 1: Hình ảnh điện di trên gel agarose
sản phẩm khuếch đại vòng 2
gen beta-globin.
Marker ADN 1 kp (dải giữa); chứng âm
(dải thứ nhất); chứng dương (dải thứ hai);
9 dải còn lại: băng gen beta-globin, kích
thước tương đương 1.409 bp của 9 thành
viên thuộc 3 gia đình.
Sản phẩm nhân gen có chất lượng tốt,
kích thước phù hợp với dự kiến theo thiết
35

C

Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản
phẩm minisequencing mẫu THC16.
THC16 (mẫu máu của người con
gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử
Cd26/Cd17.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015
A

A

T

T

Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản
phẩm minisequencing mẫu
THB24,THM24.
THB24,THM24 (mẫu máu của người
bố, mẹ gia đình 24) mang kiểu gen dị hợp
tử Cd17, pic bên phải xanh lá cây là
nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ là
nucleotid T (bình thường).
A

Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản
phẩm minisequencing mẫu THM48 và
THB48.
THM48 (mẫu máu của người mẹ gia
đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử IVS1-1,
pic phải màu đen là nucleotid C (bình
thường), pic trái màu đỏ là nucleotid T
(đột biến).
THB48 (mẫu máu của người bố gia
đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử
Cd41/42, pic phải xanh da trời là
nucleotid G (đột biến), pic trái màu đen là
nucleotid C (bình thường).

Hình 5: Hình ảnh điện di tự động sản
phẩm minisequencing mẫu THC24.
THC24 (mẫu máu của người con gia
đình 24) mang kiểu gen đồng hợp tử
Cd17, chỉ xuất hiện 1 pic xanh lá cây,
nucleotid A (đột biến).
A

Kết quả điện di minisequencing phân
tích xác định đột biến rõ ràng, phát hiện
được cả 9 trường hợp: người lành mang
gen (THM16, THB16, THM24, THB24,
THM48, THB48), đồng hợp tử gây bệnh
(THC24) và dị hợp tử của 2 đột biến
(THC16, THC48).
Dưới đây là kết quả tổng hợp phát
hiện các đột biến gen beta-globin từ 1 tế
bào bạch cầu tách từ máu ngoại vi của 9
thành viên thuộc 3 gia đình có con mắc
bệnh beta-thalassemia.

36


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

Bảng 3: Kết quả phát hiện đột biến gây bệnh beta-thalassemia.

1

THB16

Cd17

Cd17

2

THM16

Cd26

Cd26

3

THC16

Cd17/Cd26

Cd17/Cd26

4

THB24

Cd17

Cd17

5

THM24

Cd17

Cd17

6

THC24

Cd17/Cd17

Cd17/Cd17

7

THB48

Cd41/42

Cd41/42

8

THM48

IVS1-1

IVS1-1

9

THC48

Cd41/42/IVS1-1

Cd41/42/IVS1-1

Tất cả 9 thành viên thuộc 3 gia đình đều phát hiện được đột biến, thấy được di
truyền đột biến từ bố mẹ cho con. Các đột biến giống với kết quả sàng lọc trên máu
toàn phần bằng phương pháp ARMS-PCR và multiplex ARMS-PCR.
2. Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC,
KẾT LUẬN
Qua phân tích 9 mẫu thuộc 3 gia đình
BN hoặc người mang gen đột biến gây
bệnh beta-thalassemia, đối chiếu kết quả
phân tích phát hiện đột biến bằng hai
phương pháp ARMS-multiplex PCR từ mẫu
máu toàn phần và minisequencing từ 1 tế
bào bạch cầu, chúng tôi rút ra kết luận:
- Đã hoàn thiện được quy trình phát
hiện đột biến trên gen beta-globin gây
bệnh beta-thalassemia từ 1 tế bào bằng
phương pháp minisequensing.
- Bốn loại đột biến gen beta golobin
thường gặp gây bệnh beta-thalassemia
đã được phát hiện là Cd17, Cd26,

Cd41/42 và IVS1-1 bằng phương pháp
minisequencing từ 1 tế bào phù hợp với
phương pháp ARMS PCR và multiplex
ARMS-PCR từ máu toàn phần.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ng IS, Law HY. Challenges in screening
and prevention of thalassaemia in Singapore.
Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and
Child Health. 2003, 2, pp.29-38.

37

Chong SS. Multiplex minisequencing screen
for common Southeast Asian and Indian beta
thalassaemia mutations. Clin Chem. 2003, 49,
pp.209-218.
3. Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O,
Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al.
Preimplantation diagnosis of thalassaemias. J
Assist Reprod Genet. 1998, 15, pp.219-225.
4. Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang
XY, Zeng YH et al. Successful preimplantation
genetic diagnosis for alpha- and betathalassaemia in China. Prenat Diagn. 2006,
26, pp.1021-1028.
5. De Rycke M, Van de Velde H, Sermon
K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al.
Preimplantation genetic diagnosis for sicklecell anemia and for beta-thalassaemia. Prenat
Diagn. 2001, 21, pp.214-222.
6. Kanavakis E, Vrettou C, Palmer G, Tzetis
M, Mastrominas M, Traeger- Synodinos J.

Preimplantation genetic diagnosis in 10 couples
at risk for transmitting beta-thalassaemia major:
clinical experience including the initiation of
six singleton pregnancies. Prenat Diagn.
1999, 19, pp.1217-1222.


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015

38