Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu bán chi liên (scutellaria barbata D.don) bằng phương pháp điện di mao quản (CE)

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG DƯỢC LIỆU
BÁN CHI LIÊN (SCUTELLARIA BARBATA D.DON)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE)
Ngô Thị Thanh Diệp*, Nguyễn Thị Huyền Thương*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di
mao quản CE.
Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu là apigenin có trong dược liệu Bán chi liên. Nghiên
cứu được thực hiện trên 5 mẫu Bán chi liên thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ
Chí Minh. Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình
định lượng apigenin và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu thu thập được.
Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin bằng phương pháp điện di mao quản với
các thông số: Bước sóng phát hiện268 nm, Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế 15
kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt độ cột mao quản 25 0C, thời gian điện di 15 phút. Quy trình định lượng đạt tính
đặc hiệu, tính phù hợp của hệ thống với RSD của mẫu chuẩn và mẫu thử sau 6 lần tiêm mẫu lần lượt là 3,11%
và 2,96%, khoảng tuyến tính của apigenin ở nồng độ 20 – 150 μg/ml (R2 = 0,9995), độ lặp lại của phương pháp
với RSD = 3,71%, độ đúng với tỷ lệ phục hồi cao. Sử dụng quy trình đã xây dựng xác định hàm lượng apigenin
trong 5 mẫu dược liệu được thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh thu
được kết quả lần lượt là 1,82 mg/g, 0,60 mg/g, 2,74 mg/g, 3,07 mg/g, 2,85 mg/g.
Kết luận Hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên khá cao khoảng từ 1,80 – 3,10 mg/g, trong đó đặc
biệt thấp ở mẫu Nghệ An (chỉ khoảng 0,60 mg/g).
Từ khóa: Bán chi liên, apigenin, điện di mao quản.

ABSTRACT
QUANTITATIVE DETERMINATION OF APIGENIN IN THE HERBAL BAN CHI LIEN (SCUTELLARIA
BARBATA D. DON) BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

Ngo Thi Thanh Diep, Nguyen Thi Huyen Thuong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 144 - 149
Objective: Quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis method
Materials and methods: Object in the study is apigenin in the herbal Ban chi lien. The study was made on
5 Ban chi lien samples purchased in Hanoi city, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh city.
Since then, development and evaluation of quantitative procedure apigenin is conducted by capillary
electrophoresis methods. Using established and evaluated method for determination quantitative of apigenin in
collected Ban chi lien samples.
Results: Developed and evaluated the quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis
methods with parameters: wavelength detection 268 nm, buffer solution alkaline borate pH = 8.8, buffer
concentration 40 mM, voltage 15 kV, sample injection time 2 s, capillary column temperature 25 0C, developed
time 15 minutes. Quantitative procedure has specificity,compatibility of CE system with RSD of the standard
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: DS.Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588

144

Email:

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

sample and samples are respectively 3.110% and 2.957%, linearity of apigenin is 20 –150 μg/ml (R2 = 0.9995),
repeatability of the parameters of the method with RSD = 3.71%, the recovery rate was good. Applying the
developed procedure to determine apigenin in 5 samples purchased at Hanoi City, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak
province and Ho Chi Minh City, obtained results are respectively 1.82 mg/g, 0.60 mg/g, 2.74 mg/g, 3.07 mg/g,

2.85 mg/g.
Conclusion: Apigenin concentrations in the samples Ban chi lien are quite high in range from 1.80 to 3.10
mg/g, but the one in Nghe An province is specially low (only about 0.60 mg/g).
Keywords: Scutellaria barbata D. Don, apigenin, capillary electrophoresis.

ĐẶT VẤN ĐỀ:
Bán chi liên Scutellaria barbata D. Don là một
loại cây thân thảo thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae).
Cây thuốc này có mặt trong nhiều bài thuốc dân
gian với tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu
tiêu sưng, giảm đau và chống khối u tân sinh.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy
sự có mặt của flavon apigenin – một flavon có
tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống ôxy hoá
cao trong dược liệu Bán chi liên với hàm lượng
đáng kể.
Ở nước ta, Bán chi liên được nhân dân sử
dụng nhiều nhưng nguồn dược liệu này chủ yếu
vẫn nhập từ Trung Quốc, chưa có tiêu chuẩn
kiểm tra chất lượng cho dược liệu.Vì vậy, mục
tiêu của đề tài này là xây dựng quy trình định
lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên để
góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm soát chất lượng
dược liệu này. Phương pháp điện di mao quản
được lựa chọn do có tính chọn lọc cao cho phép
xác định được chính xác hàm lượng của
apigenin trong dược liệu.

ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Đối tượng

5 mẫu dược liệu Bán chi liên được thu mua
tại các địa phương: Hà nội (BCL1), Nghệ An
(BCL 2), Đắc lắc (BCL 3),Bình định (BCL 4),
Tp.HCM (BCL 5). Mất khối lượng do làm khô (h)
của các mẫu dược liệu được xác định lần lượt là
12,45%; 12,14%; 12,02%; 12,25%; 12,77%.

Hóa chất, dung môi
Chất đối chiếu: Apigenin độ tinh khiết 95%
do BM Dược liệu, khoa Dược, ĐH Y Dược TP.
HCM cung cấp.

Chuyên Đề Dược Học

Ethanol, ethyl acetat(TQ), methanol, natri
hydroxyd, kali clorid, acid boric (Merck).

Thiết bị
Máy điện di mao quản, đầu dò UV Aligent
CE 7100 (Đức), bể siêu âm Elma (Đức), cân phân
tích Satorius TE 412, cân xác định độ ẩm Satorius
MA 45.

Phương pháp nghiên cứu:
Tiến hành khảo sát các điều kiện để tiến
hành điện di mao quảnnhư pH và nồng độ của
dung dịch đệm, điện thế tiến hành điện di, thời
gian tiêm mẫu, nhiệt độ cột mao quản, thời gian
điện di để tìm ra các điều kiện thích hợp nhất.
Xây dựng quy trình định lượng apigenin

trong dược liệu:
Chất đối chiếu:
Cân chính xác 10 mg apigenin chuẩn, cho
vào bình định mức 50 ml, hòa tan và điền đến
vạch bằng MeOH, thu được dung dịch chuẩn C0
có nồng độ 200 µg/ml.
Từ dung dịch chuẩn C0pha thành dung dịch
chuẩn có nồng độ 100 µg/ml.
Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác 1 g dược liệu cho vào bình
nón 250 ml, thêm chính xác 100 ml dung môi
ethanol 50% và cân chính xác bình nón đến 0,01
g. Đun hồi lưu ở nhiệt độ 80 – 90 0C trong60
phút. Để nguội và cân, điều chỉnh khối lượng
erlen đến khối lượng ban đầu bằng dung môi.
Lắc đều và lọc nhanh qua giấy lọc khô. Bỏ 10 ml
dịch lọc đầu, thu được dung dịch T.
Lấy chính xác 50 ml dung dịch T, cô đến cắn.
Hòa cắn vào 20 ml nước, siêu âm 10 phút, cho

145


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

vào bình lắng gạn lắc với 60 ml EtOAc (chia làm
3 lần, mỗi lần 20 ml). Gộp các dịch EtOAc, bốc
hơi đến cắn khô. Hòa tan cắn vào MeOH, cho

vào bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch
bằng MeOH, siêu âm trong 5 phút. Lọc qua
màng lọc 0,45 µm cho vào lọ đựng mẫu, siêu âm
3 phút trước khi cho vào máy.

chiều dài hiệu lực 56 cm, đường kính trong 50
µm (Aligent).
Phát hiện apigenin ở bước sóng 268 nm.
Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8
Nồng độ đệm 40 mM
Điện thế 15 kV
Thời gian tiêm mẫu 2 s

Điều kiện điện di:

Nhiệt độ cột mao quản 25 0C

Máy điện di mao quản đầu dò UV Aligent
CE 7100

Thời gian điện di 15 phút.

Mao quản silicagel nung chảy 64,5 cm có
Hàm lượng apigenin (mg/g) trong dược liệu khô được tính theo công thức:

X=

Cc × CorrA t ×10 ×100 ×100
3

CorrA c × 50 ×10 × (100 − h)

=

2 × Cc × CorrA t
CorrA c × m × (100 − h)

Trong đó: CorrAc và CorAt lần lượt là diện tích đỉnh đã được chuẩn hóa của mẫu chuẩn và mẫu thử; Cc là nồng độ của
mẫu chuẩn (μg/ml) và m là khối lượng dược liệu (g), h là mất khối lượng do làm khô của dược liệu (%).

Quy trình định lượng sau khi xây dựng được
thẩm định theo ICH về tính phù hợp của hệ
thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp
lại và độ đúng.
Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm
định để xác định hàm lượng apigenin trong các
mẫu Bán chi liên đã thu thập đươc.

KẾT QUẢ
Bước sóng phát hiện: Phổ UV tại thời gian di
chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu có
bước sóng hấp thụ cực đại tại 268 nm. Do đó, lựa
chọn 268 nm là bước sóng phát hiện (hình 1,2)

DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 05-29-22\010-0101.D)
mAU
3

Apigenin
9.858

chuan
2.5

2

1.5

1

0.5

0
0

2

4

6

8

10

12

14

min

Hình 1: Điện di đồ của mẫu đối chiếu apigenin

146

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

*DAD1, 9.785 (3.0 mAU, - ) Ref=0.005 & 14.998 of 010-0101.D
mAU
5

4.5

4

3.5

3

2.5

2
220

240

260

280

300

320

340

360

nm

380

Hình 2: Phổ UV tại thời gian di chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu
các điều kiện thích hợp là: pH dung dịch đệm:
Lần lượt thay đổi một trong các điều kiện
8,8; Nồng độ dung dịch đệm: 40 mmol; Điện thế
điện di (các điều kiện khác được cố định) như
15 kV; Thời gian tiêm mẫu 2 s; Nhiệt độ cột mao
pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch đệm,
quản 25 0C; Thời gian điện di 15 phút.
điện thế, thời gian tiêm mẫu để xác định các điều
kiện thích hợp cho quy trình. Kết quả cho thấy
DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 06-26-49\010-0101.D)
mAU
4

Apigenin
9.788

3.5

3

2.5

2

1.5

1

0.5

0
0

2

4

6

10

12

14

min

Hình 3: Điện di đồ của mẫu thử thu mua tại Tp.HCM với các điều kiện đã thiết lập.
có sự tăng diện tích pic.Mặt khác điện di đồ mẫu
Quy trình định lượng với các điều kiện điện
trắng không có pic nào khác trùng với pic
di đã được xác định trên được thẩm định các
apigenin trong điện di đồ mẫu chuẩn.Từ đó cho
thông số sau:
thấy quy trình có tính đặc hiệu.
Tính tương thích của hệ thống: Sau khi bơm
6 lần 1 mẫu đối chiếu, 1 mẫu thử qua hệ thống,
RSD của thời gian di chuyển thu được lần lượt là
0,70% và 0,79%, RSD của diện tích pic là 3,11%
và 2,96%.
Tính đặc hiệu: Ở điện di đồ của mẫu thử và
mẫu chuẩn đều có pic apigenin với cùng thời
gian di chuyển. Điện di đồ của mẫu thử thêm
chuẩn ở cùng thời gian di chuyển của apigenin

Chuyên Đề Dược Học

Khoảng tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn
C0pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng
20 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml, 150
µg/ml trong MeOH. Tiến hành điện di dung
dịch chuẩn ở điều kiện đã khảo sát, thu được

diện tích của pic apigenin tương ứng với từng
nồng độ. Xử lý dữ liệu bằng Excel 2007 cho thấy
có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và

147


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

diện tích đỉnh được chuẩn hóa của các dung dịch
chuẩn theo phương trình y = 0,0119x+0,0023. Sử
dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số 0,0023 không
có ý nghĩa thống kê, như vậy phương trình hồi
quy được rút gọn y = 0,0119x; R2 = 0,9995 trong
khoảng nồng độ apigenin từ 20 – 150 µg/ml.

khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng apigenin
trong mẫu thử.Kết quả độ phục hồi thu được ở
các mức chuẩn thêm vào đều ở khoảng 93,39 –
96,06% cho thấy quy trình có độ đúng phù hợp.
Sử dụng quy trình đã thẩm định trên để xác
định hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi
liên thu mua được, kết quả thu được thể hiện ở
bảng 2 cho thấy hàm lượng apigenin trong các
mẫu BCL1, BCL3, BCL4, BCL5 khá cao (khoảng
1,80 – 3,10 mg/g). Mẫu BCL2 (thu mua tại Nghệ
An) có hàm lượng apigenin rất thấp so với các
mẫu BCL còn lại, chỉ khoảng 0,60 mg/g.

Bảng 2: Kết quả xác định hàm lượng apigenin trong
các mẫu BCL
Mẫu

Hình 4:Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính
giữa nồng độ và diện tích đỉnh được chuẩn hóa của
các dung dịch mẫu chuẩn
Độ lặp lại: Tiến hành xác định hàm lượng
apigenin trong 6 mẫu thử riêng biệt của mẫu
dược liệu Bán chi liên thu mua tại TP.HCM
(BCL5) có mất khối lượng do làm khô h=12,77%.
Mẫu chuẩn được tiến hành song song có nồng
độ thực tế là Cc = 95 µg/ml với CorrAc = 1,1525.
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 1 cho thấy quy
trình có độ lặp lại tốt với RSD < 5%.

BCL2

BCL3

BCL4

BCL5

Bảng 1: Kết quả khảo sát độ lặp lại
Stt Khối lượng Diện tích
Hàm
Kết quả xử lý
dược liệu
đỉnh đã

lượng
thống kê
(g)
chuẩn hóa Apigenin
CorrA
(mg/g)
1
1,0005
1,3744
2,5962
n=6
2
1,0003
1,4579
2,7545
= 2,7696
3
1,0004
1,4814
2,7986
4
1,0005
1,4826
2,8006
SD = 0,1028
5
1,0004
1,5419
2,9129
RSD =

6
1,0002
1,4579
2,7548

3,71%
Độ đúng: Được khảo sát trên mẫu BCL5 đã
dùng khảo sát độ lặp lại. Thêm vào các mẫu
lượng chất đối chiếu apigenin tương ứng với

148

BCL1

Khối lượng Diện tích Hàm lượng
apigenin
dược liệu
đỉnh đã
(g)
chuẩn hóa, thu được
(mg/g)
CorrA
1,0005
0,8679
1,8444
0,9997
0,8918
1,9018
1,0004
0,8058

1,7126
1,0004
0,2560
0,5422
1,0005
0,3223
0,6826
1,0000
0,2686
0,5691
1,0005
1,3427
2,8394
1,0002
1,2538
2,6522
0.9998
1,2893
2,7284
1,0003
1,4938
3,1679
0,9996
1,3967
2,9640
1,0000
1,4505
3,0770
1.0002
1,3769

2,9377
1,0004
1,2893
2,7502
1,0005
1,3379
2,8536

Hàm
lượng
trung bình
(mg/g)
1,8179 ±
0,0949
0,5979 ±
0,0745
2,7400 ±
0,0941
3,0696 ±
0,1021
2,8472 ±
0,0938

KẾT LUẬN
Sau thời gian tiến hành đề tài chúng tôi thu
được một số kết quả sau:
Xây dựng được quy trình định lượng
apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng
phương pháp điện di mao quản CE.
Thẩm định quy trình đã xây dựng

Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm
định để xác định hàm lượng của apigenin trong
một số mẫu Bán chi liên thu mua được.

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

TÀI LIỆU THAM KHẢO:
1.

2.

3.

ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of
analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp. 1 13.
Marchart E, Krenn L, Kopp B (2003), Quantification of the
flavonoids in Passiflora incarnata by capillary electrophoresis,
J. Planta Med, Vol. 69 (5), pp 452-456.
Võ Thị Bạch Huệ, Vĩnh Định (2008), Hóa phân tích, tập 2, Nhà
xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 77 - 103.

Chuyên Đề Dược Học

Ngày nhận bài báo:

10.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013
Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

149