Xây dựng quy trình định lượng methamphetamin trong tóc bằng sắc ký khí khối phổ

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



DƢƠNG QUỲNH TRÂM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
METHAMPHETAMIN TRONG TÓC
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ





HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



DƢƠNG QUỲNH TRÂM

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
METHAMPHETAMIN TRONG TÓC
BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. ThS. Phạm Lê Minh
2. ThS. Phạm Quốc Chinh
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia




HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến ThS. Phạm Lê Minh, giảng viên

Bộ môn Hóa phân tích và độc chất trường ĐH Dược HN đã tạo mọi điều kiện cho
em tham gia hoàn thành khóa luận tại Viện Pháp y Quốc Gia.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Phạm Quốc Chinh, cán bộ Khoa
Hóa pháp – Viện Pháp y Quốc gia, người đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời
gian, tâm huyết, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cám ơn tới Ban Giám đốc Viện Pháp y Quốc gia và Khoa
Hóa phân tích và độc chất– Trường ĐH Dược HN đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ em
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ ở Khoa Hóa pháp – Viện
Pháp y Quốc gia đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong quá trình tiến hành thí
nghiệm.
Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn động
viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Dƣơng Quỳnh Trâm








MỤC LỤC
Đặt vấn đề 1
Chƣơng 1: Tổng quan 3
1.1. Tổng quan về nhóm ATS 3
1.2. Tổng quan về methamphetamin 5

1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa 5
1.2.2. Tác dụng dược lý 5
1.2.3. Dược động học và phân bố trong tóc 7
1.3. Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc 9
1.3.1. Cấu trúc của tóc 9
1.3.2. Các phương pháp chiết methamphetamin trong tóc 9
1.4. Tổng quan về sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 10
1.4.1. Khái niệm 10
1.4.2. Hệ thống GC-MS 11
1.4.3. Một số kỹ thuật MS 14
1.5. Các phương pháp xác định methamphetamin trong tóc 15
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ 15
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) 15
1.5.3. Phương pháp miễn dịch 15
Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 16
2.1. Nguyên liệu, thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc 17
2.2.2. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu thực 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17


2.3.1. Lấy mẫu, chuẩn bị mẫu nghiên cứu 17
2.3.2. Pha các dung dịch chuẩn 17
2.3.3. Xử lý mẫu, chiết và tạo dẫn xuất 18
2.3.4. Định lượng methamphetamin trong mẫu tóc 19
2.3.4.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký 19
2.3.4.2. Lựa chọn nội chuẩn 19
2.3.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích 19
2.3.5. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng MA trong mẫu tóc 20

2.4. Phương pháp xử lý số liệu 20
Chƣơng 3: Thực nghiệm và kết quả 22
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA bằng GC-MS 22
3.1.1. Thiết lập chương trình GC-MS xác định MA 22
3.1.2. Khảo sát phổ khối của MA-TFA và AM-d5-TFA 22
3.2. Thẩm định phương pháp 25
3.2.1. Tính phù hợp hệ thống 25
3.2.2. Tính chọn lọc - độ đặc hiệu 26
3.2.3. Độ tuyến tính 28
3.2.4. Độ đúng và độ chính xác 29
3.2.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 31
3.2.6. Hiệu suất chiết 31
3.3. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu tóc thực 32
Bàn luận 36
Kết luận và kiến nghị 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AM
Amphetamin
AM-d5
Amphetamin-D5
ATS
Các chất kích thích thần kinh dạng amphetamin (Amphetamine Type
Stimulants)
CTPT
Công thức phân tử
DMA

2,5-Dimethoxyamphetamin
ELISA
Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)
GC-FID
Sắc ký khí với detector ion hóa ngọn lửa (Gas Chromatography – Flame
Ionization Detector)
GC-MS
Sắc ký khí khối phổ (Gas Chromatography–Mass Spectrometry)
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
KLPT
Khối lượng phân tử
LC-MS
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography–Mass Spectrometry)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit Of Detection)
LOQ
Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation)
MA
Methamphetamin
MDA
3,4-Methylendioxyamphetamin
MDMA
3,4-Methylendioxymethamphetamin
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
TFAA
Trifluoroacetic anhydrid

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Công thức một số ATS điển hình
4
3.1
Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp
25
3.2
Kết quả khảo sát độ tuyến tính
29
3.3
Kết quả khảo sát độ đúng và độ chính xác
30
3.4
Kết quả khảo sát hiệu suất chiết
32
3.5
Kết quả định lượng một số mẫu thực
32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
Tên hình
Trang
1.1
Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trường ma túy Việt Nam
4
1.2
Cơ chế tác dụng lên thần kinh trung ương của MA
7
1.3
Sơ đồ chuyển hóa của MA
8
1.4

Giả thuyết cơ chế MA đi vào trong tóc
8
1.5
Cấu trúc của tóc
9
1.6
Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ
11
1.7
Sơ đồ khối của máy khối phổ
14
2.1
Máy sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N
16
3.1
Sắc ký đồ TIC của chất chuẩn (MA+AM-d5) 100ng tạo dẫn xuất với
TFAA
23
3.2
Sắc ký đồ sau xử lý tách ion của AM-d5-TFA với SIM mảnh 144
(trên) và MA-TFA với mảnh SIM 154 (dưới).
23
3.3
Phổ khối của MA-TFA
24
3.4
Phổ khối của AM-d5-TFA
24
3.5
Sắc ký đồ TIC mẫu tóc trắng

26
3.6
Sắc ký đồ mẫu tóc trắng sau xử lý tách ion với mảnh 144 (trên) và
mảnh 154 (dưới)
27
3.7
Sắc ký đồ TIC mẫu tóc trắng + chuẩn
27
3.8
Sắc ký đồ mẫu tóc trắng + chất chuẩn sau xử lý tách ion với mảnh
144 (trên) và mảnh 154 (dưới)
28
3.9
Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đáp ứng (tỷ số
diện tích pic MA/AM-d5) với hàm lượng mẫu nhiễm
29
3.10
Sắc ký đồ TIC mẫu Quách Trường S
33
3.11
Sắc ký đồ của mẫu Quách Trường S sau xử lý tách ion với mảnh 144
(trên) và 154 (dưới)
33
3.12
Sắc ký đồ TIC của mẫu Nguyễn Văn M
34
3.13
Sắc ký đồ của mẫu Nguyễn Văn M sau xử lý tách ion với mảnh 144
(trên) và mảnh 154 (dưới).
34

1

Đặt vấn đề
Từ rất lâu, ma túy đã trở thành một vấn đề nóng và nhạy cảm trong cộng
đồng. Sử dụng ma túy không chỉ gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cá nhân
mà còn kéo theo nhiều tệ nạn và hệ lụy xã hội. Vì thế việc phát hiện, phòng chống
hoạt động tàng trữ, buôn bán, sử dụng loại hàng cấm này luôn được chú trọng đặt
lên hàng đầu. Tuy nhiên theo thời gian, hình thức của ma túy cũng thay đổi muôn
hình vạn trạng với rất nhiều dạng hoạt chất mới để đáp ứng nhu cầu đa dạng của
con nghiện cũng như để dễ dàng luồn lách qua mạng lưới hệ thống pháp lý, đã
mang đến nhiều khó khăn cho công việc này. Cụ thể hiện nay, có một nhóm ma túy
mới đã có sự “bùng nổ” ở nhiều quốc gia và khu vực, đó là các chất kích thích dạng
Amphetamine (ATS). Theo một những báo cáo của cơ quan Phòng chống ma túy và
tội phạm của Liên hợp quốc, trong những năm gần đây thì methamphetamine (MA)
là loại ATS có sự gia tăng mạnh và ngày càng tăng trên thị trường ma túy [1][31].
Để thực hiên tốt công tác phòng chống các hành vi bất hợp pháp liên quan tới loại
ma túy trên, công việc kiểm nghiệm phát hiện ra MA cũng đóng một vai trò không
nhỏ. Trên thế giới hiện nay đã sử dụng nhiều phương pháp để phân tích MA trong
máu, nước tiểu, tóc như các kit phát hiện nhanh bằng ELISA, các phương pháp xác
định bằng LC-MS, HPLC, GC-MS, GC-FID,….Còn ở Việt Nam chỉ mới phổ biến ở
dùng các test thử nhanh, sắc lỏng hay sắc kí khí; một số cơ quan giám định đã bắt
đầu nghiên cứu dùng sắc kí khí khối phổ GC-MS, sắc kí lỏng khối phổ LC-MS để
phân tích trên mẫu vật máu, nước tiểu, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào sử dụng
GC-MS phân tích trên mẫu tóc trong khi mẫu tóc là mẫu vật tiện lợi hơn cả để xác
định nhanh chóng methamphetamin. Với lý do đó, chúng tôi đã đặt vấn đề xác định
methamphetamin trong tóc bằng phương pháp GC-MS nhằm đưa ra quy trình chuẩn
giám định methamphetamin trong tóc để ứng dụng trong các phòng xét nghiệm hình
sự trong cả nước với hy vọng sẽ góp phần phục vụ tốt hơn cho công tác phòng
chống tội phạm ma túy.
Để thực hiện mục tiêu trên, nội dung luận văn sẽ có 2 phần sau:

2

1. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng MA trong tóc bằng kỹ thuật
GC-MS.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy
để xác định MA trong tóc và áp dụng vào mẫu tóc thực tế.


















3

Chƣơng 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về nhóm ATS
ATS là từ viết tắt của amphetamine type stimulants – các chất kích thích thần
kinh dạng amphetamin – bao gồm nhiều chất có cấu trúc tương tự nhau, trong đó

amphetamin là chất được phát hiện và tổng hợp đầu tiên năm 1887 tại Đức. Sau sự
ra đời của amphetamin, methamphetamin được tổng hợp năm1989 tại Nhật. Ngoài
hai chất chính trên, còn có một số chất khác trong nhóm như MDMA, MDA,
DMA,,…vv [4][6][33].
Việc sử dụng amphetamin trong y tế bắt đầu vào cuối những năm 1920 với
vai trò một thuốc thông mũi và giãn phế quản để thay thế cho ephedrin. Sau đó vào
những năm 1930, thuốc được mở rộng trên lâm sàng với tác dụng kích thích thần
kinh trung ương, chống trầm cảm, ũ rũ. Amphetamin và methamphetamin được
dùng rộng rãi trong quân đội ở thế chiến thứ II để tăng cường sức chịu đựng, sự tỉnh
táo, tránh mệt mỏi… Đồng thời với việc sử dụng, các thuốc ATS bị lạm dụng nhiều
hơn, nhất là ở người trẻ tuổi. Càng ngày, tác hại của các thuốc này càng thể hiện
nghiêm trọng: dễ gây nghiện, dùng liều cao gây loạn thần, hoang tưởng, dễ kích
động, bạo lực vì thế chúng còn được gọi là “các chất loạn thần”, “ma túy điên”, “ma
túy bạo lực” [5][26][31].
Hiện nay các chất nhóm ATS được tổng hợp và buôn bán trái phép với số
lượng ngày càng nhiều. Đây là loại ma túy tổng hợp xuất hiện phổ biến hiện nay với
nhiều hình thức đa dạng: ma túy đá, hồng phiến, thuốc lắc,… và nhiều nhất là
methamphetamin dạng tinh thể (ma túy đá) [7][31].
Công thức chung của nhóm ATS:
R
1
R
2
R
3
R
4
CH
2
CH

CH
NH
R
5
R
6

4


Hình 1.1. Một số dạng ma túy tổng hợp ATS trên thị trƣờng ma túy Việt Nam
Bảng 1.1. Công thức một số ATS điển hình
Dẫn chất amphetamin
R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
R
6
Amphetamin
H
H
H
H

CH
3
H
Methamphetamin
H
H
H
H
CH
3
CH
3
3,4-methylendioxyamphetamin
(MDA)
H
*
*
H
CH
3
H
3,4-methylendioxymethamphetamin
(MDMA)
H
*
*
H
CH
3
CH

3
3,4-methylendioxy-N-
ethylamphetamin
H
*
*
H
CH
3
C
2
H
5
4-methoxyamphetamin
H
H
OCH
3
H
CH
3
H
2,5-dimethoxyamphetamin (DMA)
OCH
3
H
H
OCH
3
CH

3
H
3,4,5-trimethoxyamphetamin
H
OCH
3
OCH
3
OCH
3
CH
3
H
4-methyl-2,5-dimethoxyamphetamin
OCH
3
H
CH
3
OCH
3
CH
3
H
4-ethyl-2,5-dimethoxyamphetamin
OCH
3
H
C
2

H
5
OCH
3
CH
3
H
4-Bromo-2,5-dimethoxyamphetamin
OCH
3
H
Br
OCH
3
CH
3
H
Ghi chú: kí hiệu * là giữa C3và C4 của nhân thơm có liên kết –OCH
2
-O-
5

1.2. Tổng quan về methamphetamin
1.2.1. Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa [5][6][13]
MA thường gặp dưới 2 dạng là base và muối hydroclorid
 Methamphetamin base:
CH
2
CH
N

CH
3
H
CH
3

- Tên khoa học: (+)-N,α-dimethylphenethylamine
- CTPT: C
10
H
15
N
- KLPT: 149,2
- pK
a
: 9,9
- Tính chất lý hóa: chất lỏng không màu, trong, ít tan trong nước, tan trong
ethanol, cloroform và ether.
 Methamphetamin hydroclorid:
- CTPT: C
10
H
15
N.HCl
- KLPT: 185,5
- pK
a
: 10,1
- Tính chất lý hóa: bột kết tinh trắng hoặc tinh thể không màu, tan 1/2 trong
nước, 1/4 trong ethanol, 1/5 trong cloroform, không tan trong ether.

1.2.2. Tác dụng dược lý
Tác dụng kích thích thần kinh của MA là rất nhanh, thậm chí có ngay trong
khi tiêm. Thời gian tác dụng có thể kéo dài 4-8 giờ ở người chưa nghiện và 2-3 giờ
ở người nghiện. Sự khác biệt về hiệu quả giữa nam và nữ, giữa các lứa tuổi là
không đáng kể. Tác dụng kích thích thần kinh của MA tăng lên khi kết hợp với một
số thuốc khác như ephedrin, cocain, các chất giảm đau nhóm opiat, các thuốc ngủ
[4][6][17]. Sau đây là một số tác dụng dược lý và cơ chế của MA:
 Tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương:
MA tác dụng chủ yếu lên não, vỏ não, ngoài ra còn tác dụng lên hệ thống
lưới hoạt hóa của hệ thần kinh trung ương. Các tác dụng này gây ra những thay đổi
6

trạng thái tinh thần như cảm giác sảng khoái, tỉnh táo, phấn chấn, tinh thần nhanh
nhẹn, tăng tính năng động, tự tin, tăng vận động, nói năng, giảm mệt mỏi, dịu đau.
Các trạng thái này có thể giúp cho con người cải thiện được những công việc đơn
giản, thậm chí làm được nhiều việc hơn, nhất là những vận động thể chất như điền
kinh, nhảy múa,…tuy nhiên với các công việc phức tạp thì hiệu quả giảm và khả
năng sai sót trong công việc tăng do thiếu năng lực tập trung. Do các tác động lên
thần kinh như trên, người sử dụng MA có xu hướng tiếp tục sử dụng hết lần này đến
lần khác để thỏa mãn kích thích bản thân và dần lệ thuộc vào nó, đó là sự nghiện
MA. Việc dùng MA kéo dài hoặc liều cao thường gây chán chường, mệt mỏi, ảo
giác, hoang tưởng, hoảng loạn, đau đầu, chóng mặt, rối loạn vận mạch, lẫn lộn, suy
nhược tinh thần, suy giảm khả năng tình dục [4][6][17].
 Tác dụng kích thích hệ thần kinh giao cảm [6][9][17]:
MA có tác dụng kiểu α và β như các chất cường giao cảm:
- Tác dụng lên tim mạch: kích thích trực tiếp làm tăng nhịp tim, gây co mạch,
làm tăng huyết áp cả tâm thu lẫn tâm trương. Dùng liều lớn có thể gây loạn
nhịp tim, co thắt mạch vành gây đau thắt ngực.
- Tác dụng lên các cơ trơn khác: làm giảm co thắt cơ trơn dạ dày, ruột, giảm
chuyển dịch thức ăn.

- Tác dụng giảm đau: tác dụng giảm đau nhẹ, tuy nhiên chưa đủ để điều trị hiệu
quả. Mặc dù vậy theo một số báo cáo, nó có thể tăng hiệu quả giảm đau của
các opiat.
- Kích thích trung tâm hô hấp: đối với tình trạng bình thường, tác dụng này là
không đáng kể nhưng khi đã bị ức chế hô hấp bởi các chất tác dụng trên hệ
thần kinh trung ương thì MA có tác dụng kích thích hô hấp rõ rệt.
- Gây chán ăn: MA tác dụng vào vị trí trung tâm no ở dưới đồi bên.
 Độc tính:
Khi dùng quá liều thì gây ra các triệu chứng ngộ độc dẫn đến tử vong như
hôn mê, co giật, chảy máu não. Liều độc tối thiểu gây chết người ở người bình
thường là 1g [6][17].
7

 Cơ chế tác dụng:
Tác dụng lên thần kinh trung ương của MA là do làm tăng giải phóng các
chất trung gian thần kinh là dopamin, serotonin và noradrenalin. Sự thay đổi trong
vận động và hành vi cư xử liên quan nhiều nhất bởi dopamin [6][9][17].

Hình 1.2. Cơ chế tác dụng lên thần kinh trung ƣơng của MA
1.2.3. Dược động học và phân bố trong tóc
MA dễ dàng hấp thu qua đường uống và đường trực tràng, phân bố nhanh
chóng vào máu, dễ dàng qua hàng rào máu não để gây ra tác dụng. MA đạt nồng độ
đỉnh khoảng 3-6 giờ sau khi uống. Nó cũng được hấp thu tốt sau khi hít bằng mũi
hoặc tiêm. MA vào cơ thể sẽ đượcchuyển hóa và thải trừ phần lớn qua nước tiểu,
một phần nhỏ MA phân bố vào tóc [4][17][19][30].
8


Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa của MA
Trong 24 giờ đầu, MA được đào thải qua đường nước tiểu khoảng 43% ở

dạng không biến đổi, khoảng 15% ở dạng 4-hydroxymethamphetamin, khoảng 5%
ở dạng amphetamin và một số chất chuyển hóa khác ở dạng biến đổi hoặc kết hợp
[5][12].
Về sự phân bố trong tóc, cơ chế của nó rất phức tạp và hiện nay vẫn chưa rõ
ràng, nhiều giả thuyết cho rằng MA đã khuếch tán (thụ động hay chủ động) từ các
mạch máu nuôi dưỡng nang tóc vào nang tóc, nằm chủ yếu ở tủy tóc. MA tồn tại
trong tóc trong vài tháng đến thậm chí hàng năm [17][19][30].

Hình 1.4. Giả thuyết
cơ chế MA đi vào
trong tóc
9

1.3. Tổng quan về chiết methamphetamin trong tóc
1.3.1. Cấu trúc của tóc
Sợi tóc gồm 2 phần là nang tóc và thân tóc.
Nang tóc còn gọi là chân tóc, nằm phía dưới bề mặt da sâu từ 3-5mm. Nó
được bao quanh bởi hệ thống mao mạch máu nuôi dưỡng tóc. Nang tóc là phần
“sống” duy nhất của tóc, giúp tóc mọc dài ra. Thân tóc là những “sợi tóc” mà ta
nhìn thấy hằng ngày, là phần tóc đã “chết” [18][25].
Thân tóc gồm 3 lớp: lớp biểu bì (cuticle), lớp giữa (cortex) và lớp tủy
(medulla). Lớp biểu bì là phần ngoài cùng, gồm các lớp keratin trong suốt xếp
chồng lên nhau như vảy cá, có tác dụng bảo vệ sợi tóc khỏi hóa chất và những ảnh
hưởng bên ngoài. Lớp biểu bì còn được phủ một màng lipid mỏng để tóc không
thấm nước. Lớp giữa bao gồm nhiều bó sợi nhỏ hợp thành và chứa các sắc tố của
tóc. Lớp tủy là phần trong cùng của sợi tóc, chứa các hạt chất béo và không khí
[11][18][25].

Hình 1.5. Cấu trúc của tóc
1.3.2. Các phương pháp chiết methamphetamin trong tóc [11][18][21][25][29]

[30]
Có thể chiết MA bằng phương pháp chiết lỏng- lỏng hoặc chiết pha rắn. Cần
rửa mẫu tóc qua nước cất và methanol để loại tạp ở lớp biểu bì và lớp giữa, sau đó
10

thủy phân để giải phóng MA mới chiết được. Hiện nay có một số phương pháp thủy
phân tóc thường được sử dụng:
- Thủy phân trong môi trường kiềm: thường sử dụng dung dịch NaOH 0,1-
2,5M
- Thủy phân trong môi trường acid: thường dùng một số acid như HCl,
H
2
SO
4
,…
- Thủy phân trongmethanol: dùng methanol ở nhiệt độ thấp hơn so với các
phương pháp trên.
- Thủy phân trong dung dịch đệm: dùng một số đệm như đệm acetat, đệm
phosphate,…
- Thủy phân bằng enzym: một số enzym được sử dụng như β-
glucoronidase/arylsulfatase (glusulase), proteinase K, protease E, protease
VIII, biopurase,…
1.4. Tổng quan về sắc ký khí khối phổ (GC-MS)
1.4.1. Khái niệm
Sắc ký khí (GC) là một phương pháp tách các chất từ một hỗn hợp ở thể khí
bay hơi với pha động là một chất khí thường là khí trơ. Mẫu phân tích được đưa vào
đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký, tuy
nhiên pha động không tương tác với chất phân tích mà chỉ làm chức năng vận
chuyển chất phân tích qua cột. Pha tĩnh của GC có thể là chất lỏng trong sắc ký khí-
lỏng (GLC) còn gọi là sắc ký khí phân bố hay chất rắn trong sắc ký khí- rắn (GSC)

còn gọi là sắc ký khí hấp phụ, nhưng vì quá trình hấp phụ có nhiều hạn chế nên
GSC ít được ứng dụng ngoại trừ phân tích một số chất khí [2][35].
Khối phổ (MS) là một kỹ thuật dựa trên việc đo tỷ số khối lượng và điện tích
của ion (m/z) để cung cấp thông tin định tính xác định cấu trúc và định lượng các
chất. Kỹ thuật này là một kỹ thuật phân tích mạnh được sử dụng trong nhiều lĩnh
vực khác nhau để xác định các chất vô cơ và hữu cơ [2][28].
Sự kết hợp hai kỹ thuật trên, GC và MS, đã cho ra đời kỹ thuật sắc ký khí
khối phổ GC-MS. Phương pháp GC-MS sử dụng kĩ thuật GC để tách các chất và
11

phát hiện chúng với detector MS nhờ đó phát huy được ưu điểm của cả hai phương
pháp, phát triển và mở rộng ứng dụng của hai kĩ thuật này
1.4.2. Hệ thống GC-MS

Hình 1.6. Sơ đồ máy sắc ký khí khối phổ
 Khí mang
Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển
chất phân tích qua cột. Khí mang thường là khí có phân tử lượng nhỏ, phải đảm bảo
yêu cầu trơ về mặt hóa học, đảm bảo tinh khiết và phù hợp với từng loại detector.
Một số loại khí mang thường dùng là heli, nitơ, hydro, argon,…
Đi kèm với bình cấp khí mang còn có van giảm áp, đồng hồ kiểm tra lưu lượng
khí [2][28][35].
 Buồng tiêm mẫu
Mẫu phân tích lỏng hoặc khíđược tiêm nhanh vào dòng pha động với một
lượng vừa đủ bằng bơm tiêm nhỏ hoặc van tiêm mẫu. Cỡ mẫu thường thay đổi từ
vài µl đến 20µl. Mẫu được tiêm qua đệm silicon chịu nhiệt vào buồng hóa hơi,
buồng này được đốt nóng tới nhiệt độ thích hợp và nối với cột tách [2][28][35].
Có nhiều kỹ thuật tiêm mẫu khác nhau.
 Với cột mao quản thường dùng 3 kỹ thuật tiêm mẫu sau:
- Kỹ thuật tiêm chia dòng (split): chia dòng khí mang 1:100 đến 1:1000 để

giảm lượng mẫu vào cột (giảm 90% hoặc hơn). Độ nhạy của mẫu giảm vì
chỉ một phần nhỏ vào cột.
12

- Kỹ thuật không chia dòng (splitless): toàn bộ mẫu ngưng tụ ở đầu cột đã
làm lạnh, sau đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu. Độ nhạy tăng nhưng có
nguy cơ giãn rộng pic.
- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on-column): mẫu được ngưng tụ ở đầu cột sau
đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ. Tăng độ nhạy, giảm phân hủy
mẫu do nhiệt [2].
 Với cột nhồi, thường dùng 2 kỹ thuật tiêm mẫu sau:
- Kỹ thuật bay hơi nhanh (flash vaporization): mẫu tiêm vào vùng có nhiệt độ
cao hơn 20-25
0
C so với nhiệt độ cột. Mẫu bay hơi nhanh, có thể xảy ra phân
hủy mẫu do nhiệt độ cao.
- Kỹ thuật tiêm thẳng vào cột (on- column): mẫu được tiêm thẳng vào đầu cột
nhồi. Tăng độ nhạy, giảm phân hủy mẫu do nhiệt [2].
 Cột và lò cột
Chương trình nhiệt độ cột của sắc ký khí là thông số rất quan trọng cần kiểm
soát chính xác và lò cột đảm nhiệm nhiệm vụ điều nhiệt này. Trong sắc ký khí có 2
loại cột: cột nhồi (packed column) và cột mao quản (capillary column). Ngày nay
do nhiều ưu điểm nên người ta sử dụng phổ biến cột mao quản.Sau đây là các đặc
điểm của 2 loại cột trên:
 Cột mao quản:
- Nguyên liệu: silica nung chảy rất tinh khiết (tạp kim loại <1ppm).
- Kích thước: dài 10-100m (cuộn tròn). Đường kính trong 0,1-0,7mm, có áo
bảo vệ bằng polymid hoặc nhôm.
- Pha tĩnh: lớp chất lỏng dày 0,1-5µm bao mặt trong của cột hoặc chất mang
bao pha tĩnh.

- Khí mang: heli hoặc hydro.
- Độ phân giải: phân tích nhiều thành phần: 100 chất hoặc hơn, nhất là với
cột đường kính trong <0,2mm. Chất tan được rửa giải ở nhiệt độ thấp hơn
so với cột nhồi.
 Cột nhồi:
13

- Nguyên liệu: thủy tinh, thép không gỉ.
- Kích thước: dài 1-3m (cuộn tròn). Đường kính trong 2-3mm.
- Pha tĩnh: kích thước hạt 150-250µm, được bao lớp mỏng (0,05-1µm).
- Khí mang: nitơ, heli.
- Độ phân giải: thấp, tốt nhất chỉ có thể tách được 20 thành phần.
 Pha tĩnh: pha tĩnh sử dụng chủ yếu là chất lỏng và được cố định trong cột cần
đảm bảo yêu cầu sau:
- Áp suất hơi thấp, tức là điểm sôi cao, ít nhất là cao hơn 100
0
C so với nhiệt
độ vận hành cực đại của cột.
- Bền với nhiệt độ.
- Trơ về mặt hóa học.
- Đặc tính dung môi đảm bảo hệ số k’ và α của chất phân tích nằm trong
khoảng thích hợp
Một số pha tĩnh lỏng dùng cho sắc ký khí- lỏng như: polydimethyl siloxan
(100% methyl), poly (phenyl methyl) siloxan (50% phenyl), poly (trifluoropropyl
dimethyl) siloxan, polyethylen glycol,… [2][35]
 Detector khối phổ
Detector khối phổ là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện khối phổ
còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng
của chúng.
Nguyên tắc hoạt động: Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia

tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến được detector. Tất cả quá trình
này diễn ra trong hệ chân không: áp suất hệ dao động từ 10
-6
Pa đến 10
-3
Pa. Tín hiệu
tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác
nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối. Nó cung cấp thông tin định
tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các
chất [2][5][28].
14


Hình 1.7 . Sơ đồ khối của máy khối phổ
Detector khối phổ gồm có 5 bộ phận:
- Bộ nạp mẫu: là đầu ra của máy GC kết nối với máy khối phổ.
- Bộ nguồn ion: ion hóa các nguyên tử, phân tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc
hơi.
- Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc tách
riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector.
- Detector: có nhiệm vụ chuyển các ion đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ
điện tử của máy.
- Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu từ detector được khuếch đại trước khi chuyển
thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ
khối, định lượng,…[2][28]
1.4.3. Một số kỹ thuật MS
 Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN)
Với một hỗn hợp nhiều chất sau khi được tách ra qua cột sắc ký khí và đưa
vào detector khối phổ, detector sẽ ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi
chất. Ta có một sắc ký đồ toàn bộ ion TIC (Total Ion Chromatogram) và phổ khối

được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN). FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất
phân tích hơn, tuy nhiên độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn [2][4][5].
 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, SelectedIon Monitoring)
15

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc ký đò theo
thời gian. Kỹ thuật SIM có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng
độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu (S) trên nhiễu đường nền (N) [2][4][5].
1.5. Các phương pháp xác định methamphetamin trong tóc
1.5.1. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp sắc ký khí khối phổ ngày càng được sử dụng rộng rãi trong
phân tích MA. Máy sắc ký khí tách MA và đưa vào detector khối phổ, có khả năng
định tính, định lượng MA với độ nhạy và độ chính xác cao. Để sử dụng phương
pháp này, MA cần được tạo dẫn xuất để tăng khả năng bay hơi và bền với điều kiện
sắc ký [16][18][20][27][30][34].
1.5.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ cũng là một phương pháp đã được sử
dụng nhiều để phát hiện MA. Với mẫu tóc, chiết MA bằng phương pháp thích hợp
rồi đưa vào hệ thống LC-MS mà không cần tạo dẫn xuất như với GC-MS. Bộ phận
LC có chức năng chia tách MA trong dung dịch, đưa vào bộ phận khối phổ với vai
trò detector để định tính , định lượng [18][22][23][30].
1.5.3. Phương pháp miễn dịch
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng kháng thể đặc hiệu với chất cần
phân tích (kháng nguyên) và dạng đánh dấu của chất phân tích. Dạng đánh dấu của
chất phân tích sẽ tranh chấp với chất phân tích để kết hợp với kháng thể theo cơ chế
phản ứng giữa kháng nguyên với kháng thể. Kết quả là số lượng các phân tử bị đánh
dấu sẽ tỷ lệ nghịch với lượng chất cần phân tích trong mẫu. Tùy thuộc vào bản chất
của chất đánh dấu mà các phương pháp phân tích sẽ được áp dụng. Phương pháp
này thường ứng dụng để tạo các kit xác định nhanh MA. Mẫu tóc sau khi được xử
lý và chiết sẽ được đem xác định bằng phương pháp miễn dịch để phát hiện MA

[5][10][14][30].


16

Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu, thiết bị
 Hóa chất, thuốc thử
- Chất chuẩn methamphetamin 1,0mg/ml trong methanol, số lô FE082712-03,
USDEA Exempt/ TK#61-82
- Nội chuẩn amphetamin-d5 1,0mg/ml trong methanol, số lô FE080612-01,
USDEA Exempt/ TK#61-34
- Methanol, ethyl acetat, trifluoroacetic anhydrid (TFAA), nước cất,
NaOH,…
- Mẫu tóc trắng ( không nhiễm methamphetamin) của Khoa Hóa pháp, Viện
Pháp y quốc gia.
- Mẫu tóc được gửi tới viện Pháp y Quốc gia để giám định.

Hình 2.1. Máy sắc ký khí khối phổ Agligent Technologies 6980N
 Thiết bị dụng cụ:
- Máy sắc kí khí khối phổ
- Máy lắc siêu âm
- Máy ly tâm
- Tủ sấy
- Hệ thống làm khô bằng Nitơ
17

- Bình định mức, bình nón, ống nghiệm, và các dụng cụ khác
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc

 Xây dựng phương pháp định lượng MA trong tóc bằng GC-MS: bao gồm các
nội dung
- Xử lý mẫu: đưa ra quy trình xử lý mẫu chiết lỏng lỏng sau khi thủy phân
trong môi trường kiềm.
- Lựa chọn điều kiện sắc ký, lựa chọn chuẩn nội: đưa ra chương trình sắc ký
khối phổ để định lượng, chất chuẩn nội phù hợp.
 Thẩm định phương pháp: bao gồm các nội dung
- Tính phù hợp hệ thống sắc ký
- Tính chọn lọc – độ đặc hiệu
- Độ tuyến tính
- Độ đúng
- Độ chính xác
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
2.2.2. Ứng dụng phân tích MA trong mẫu thực
Sử dụng phương pháp đã xây dựng để phân tích MA trong mẫu tóc của
người nghi ngờ sử dụng ma túy gửi đến giám định tại Khoa Pháp y – Viện Pháp y
quốc gia.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Lấy mẫu,chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Mẫu tóc được gửi đến hoặc lấy trực tiếp ở Khoa Hóa pháp - Viện Pháp y
quốc gia, đựng trong túi polyme sạch, bảo quản trong tủ lạnh nhiệt độ 0-4
o
C.
2.3.2. Pha các dung dịch chuẩn
 Dung dịch chuẩn MA trong methanol 1µg/ml: lấy chính xác 100µl dung dịch
chuẩn MA 1mg/ml vào bình định mức 100ml, thêm lượng methanol vừa đủ
vào, lắc đều.