Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết từ hoàng liên giải độc thang

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013

Nghiên cứu Y học

SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT
TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG
Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung*

TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hoàng liên giải độc thang (HLGĐ) là bài thuốc thanh nhiệt giải độc có
xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường). Bài
thuốc được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết
lỵ…. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm
đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư…. trên thực nghiệm. Để tiện lợi trong việc sử dụng bài
thuốc trong nghiên cứu và điều trị, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết HLGĐ bằng phương pháp
phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng
Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.
Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu được khoa Dược- Cơ sở 3 Bệnh viện Đại
học Y Dược TP. HCM cung cấp. Áp dụng các phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật bằng các phản
ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật quang phổ.
Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46%. Xác định sự
hiện diện alkaloid và flavonoid trong cao HLGĐ. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định được cao HLGĐ có đủ 4
dược liệu cấu thành bài thuốc. Hàm lượng Berberin trong cao là 0,852%.
Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin đã
góp phần xây dụng tiêu chuẩn cơ sở cao HLGĐ.
Từ khóa: Hoàng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hoá, sắc ký lớp mỏng

ABSTRACT
PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR
“HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT
Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung

* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 203 - 208
Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China,
that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao. It is used widely to treat some infectious diseases such as
pneumonia, furuncles, dysentery…Many studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes,
enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation. In order to make HLJDT more convenient in
research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction
method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination. As well,
berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined.
Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical
Center HoChiMinh City. Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the
chemical components. Berberin was determined by means of the spectral methods.

∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh
Địa chỉ liên hệ: Bs. Trần Thu Nga
ĐT: 0989231241

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

Email:

203


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013

Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46%. There
are alkaloid and flavonoid in the product. TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs. Berberin
concentration in the product is 0.852%.

Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method
and berberin determination to standardize the HLJDT extract.
Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography.
định về kiểm tra chất lượng thuốc của Dược
ĐẶT VẤN ĐỀ
điển Việt Nam 4.
Hoàng liên giải độc thang (gồm 4 vị thuốc:
Phương pháp
Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix
Điều chế cao chiết bài thuốc.
Scutellariae), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và
Chi tử (Fructus Gardeniae)) là bài thuốc cổ
Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp sắc
phương có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Bài
trong dung môi nước. Sau khi thu được dịch
thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong
chiết, tiến hành lọc và cô cách thủy để thu được
tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương
cao HLGĐ.
(1)
Đảo (Nhà Đường) . Công dụng bài thuốc được
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài
ghi trên một số tài liệu ứng dụng điều trị một số
thuốc(2).
bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết
Độ ẩm
lỵ…(1, 7). Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một
minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái
chén

cân, đem sấy ở 1050C trong tủ sấy dưới
tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer,
áp suất thường đến khối lượng không đổi.
xơ vữa động mạch…trên thực nghiệm (3,5,8,9). Một
Tính độ ẩm:
nghiên cứu gần đây kết luận tác dụng bài thuốc
gây ra sự chết theo chương trình và sự ngừng
chu kỳ tế bào ở dòng tế bào ung thư gan in vitro
và in vivo (4).. Ngoài ra, trên mô hình gây độc
bằng cyclophosphamid, cao chiết Hoàng liên giải
độc thang đã cho thấy có tác dụng bảo vệ gan,
chống oxy hóa, giải độc (6). Để thuận lợi cho việc
nghiên cứu và sử dụng bài thuốc trong điều trị,
chúng tôi áp dụng phương pháp phân tích hóa
học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và
định lượng hoạt chất berberin chính trong cao
HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết
bài thuốc.

ĐỐI TƯỢNG– PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Nguyên liệu
Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma
Coptidis), Hoàng cầm (Radix Scutellariae),
Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử
(Fructus Gardeniae) được cung cấp bởi khoa
Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP.
HCM. Mỗi dược liệu được chuẩn hoá theo quy

204

H% =

a−b
× 100
a

a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g); b: khối lượng
bột dược liệu sau khi sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl)

Độ tro toàn phần
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén
nung. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn
thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy
hoàn toàn và chén không còn bốc khói.
Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở
500- 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro
không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén
nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút
ẩm. Cân và ghi lại lượng cân.
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp
tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa. Lấy
chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình
hút ẩm. Cân.
Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần
cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013

lệch không quá 0,5 mg. Tro toàn phần tính trên
dược liệu khô kiệt theo công thức:

A=

(a − b )× 100 %
c − (c × h )

A%: tro toàn phần (%) của dược liệu; a: khối lượng chén có
tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng;
h: độ ẩm (%) của dược liệu

Định tính
Phương pháp hóa học:
Hợp chất alkaloid:
Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với
H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc
H2SO4 5% chia vào 3 ống nghiệm để làm phản
ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat và
quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng.
Hợp chất flavonoid:
Lấy 1 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml
MeOH, lọc. Dịch lọc được cô đến cắn. Hoà cắn
với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc.
Dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm làm phản ứng
với NaOH 10%, FeCl3 3% trong cồn và thuốc thử
chì acetat. Quan sát màu của ống nghiệm sau
phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng
với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản
ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm

và với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu
trắng đục.
Phương pháp sắc kí lớp mỏng:
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck). Lấy
khoảng 0,1 g mỗi dược liệu, cho vào cốc có mỏ
50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút,
lọc. Tập trung lọc cô còn 1ml làm dung dịch
chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu
làm đối chiếu trên sắc ký lớp mỏng với các hệ
dung môi tương thích được tham khảo trong
các dược điển.

Định lượng
Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ được
xác định dựa vào đường cong chuẩn độ của
berberin chuẩn trong methanol trên máy quang

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

Nghiên cứu Y học

phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic
HEλIOS.
Xác định đỉnh hấp thu cực đại:
Đỉnh hấp thu cực đại của berberin chuẩn
trong methanol là λmax = 266 nm.
Xây đựng đường chuẩn berberin.
Thiết lập giai mẫu
Cân chính xác 2 mg berberin chuẩn, hòa tan

trong 10 ml methanol và cho vào bình định mức
10 ml (dung dịch chuẩn A). Dùng micro pipette
lấy chính xác dung dịch chuẩn A có thể tích lần
lượt là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400
µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol
tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy
quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic
HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.
Mẫu thử
Cân chính xác khoảng 100 mg cao, cho vào
bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm
nhiều lần bằng methanol cho đến khi dịch chiết
methanol không còn phản ứng của chất berberin.
Dịch chiết cô còn khoảng 10 ml và cho vào bình
định mức 10 ml, lắc đều. Dùng micro pipet hút
chính xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định
mức 10 ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều,
tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử
ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại
đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm.
Bảng 1. Mật độ quang của giai mẫu berberin chuẩn.
Bình định mức
1
2
3
4
5
6

Hàm lượng

berberin (µg/ml)
3 µg
4 µg
5 µg
6 µg
7 µg
8 µg

Mật độ quang
(OD)
0,262
0,340
0,421
0,491
0,566
0,636

Công thức tính hàm lượng berberin trong
mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x +
0,0413.

C(%) =

At − 0,0413 100 b
×
× ×10−6
0,0748
0,5 p

205

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013

Nghiên cứu Y học

A t: Độ hấp thu của mẫu thử. b: Khối lượng 100 g
cao HLGĐT khô kiệt (g). p: Khối lượng cao

HLGĐT đem thử đã trừ ẩm (g).

y = 0,0748x + 0,0413

Đường chuẩn BERBERIN

R 2= 0,9994

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

2

4

6

8

10

HÀM LƯỢNG (µg/ ml)
Biểu đồ 1. Đường chuẩn của dung dịch chuẩn berberin.

KẾT QUẢ
Bào chế cao HLGĐ.
80 0C -1000C
10 lít nước
60 phút

Dược liệu
2440 g

Dịch chiết 1
2500 ml nước

Bã dược liệu
800C-1000C
5000 ml nước
30 phút
Dịch chiết 2
1200 ml

Dịch chiết 1+2

Lọc
Cô cách thủy
Cao HLGĐ (650g)
Sơ đồ 1. Qui trình bào chế cao HLGĐ
Hiệu suất chiết cao: 18,13%

206

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013
Độ ẩm cao HLGĐ

Cao
Khối lượng Cao HLGĐT (g)
Tro toàn phần (%)
Trung bình (%)

Bảng 2. Độ ẩm của cao HLGĐ.
Cao
Khối lượng Cao HLGĐT(g)
Độ ẩm (%)
Trung bình (%)

Lần 1
0,5183
32,22

Lần 2 Lần 3

0,4998 0,5078
31,63 31,88
31,91

Tro toàn phần cao HLGĐ

Nghiên cứu Y học
Lần 1 Lần 2 Lần 3
0,5254 0,5512 0,5390
8,36 8,31 8,72
8,46

Định tính
- Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid
và alkaloid: dương tính.
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng:

Bảng 3. Độ tro toàn phần của cao HLGĐ.
Bảng 4. Sắc ký đồ của cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu.
Nguyên liệu
Hoàng liên

Hoàng bá

Hoàng cầm

Chi tử

Hệ dung môi khai triển

Số vết của nguyên Số vết Số vết trùng giữa
liệu đối chiếu của cao nguyên liệu với cao

Phát hiện

n-butanol:acid
Phun TT Dragendorff và quan
sát dưới ánh sáng thường và
acetic:nước
đèn UV λ= 366 nm
(7 : 1 : 2)
n-butanol:acid
Phun TT Dragendorff và quan
sát dưới ánh sáng thường và
acetic:nước
đèn UV λ= 366 nm
(7 : 1 : 2)
Toluen : ethyl
Phun FeCl3 và quan sát dưới
ánh sáng thường và đèn UV
acetat : acid formic
λ= 366 nm
(2 : 3 : 2.2)
Ethyl acetat : aceton :
Phun H2SO4 quan sát dưới
ánh sang thường và đèn UV
acid formic : nước
λ=366nm
(5 : 5 : 1 : 1)

3

4

3

3

4

3

8

6

6

6

5

6

Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã
chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có
sự hiện diện của các dược liệu: Hoàng liên,
Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử. Chứng tỏ phương
pháp chiết xuất giữ được các thành phần chủ
yếu của công thức cổ truyền.

Kết quả nghiên cứu hàm lượng berberin
trong cao HLGĐ thu được là 0,852 % chiếm tỷ lệ
62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự
đoán. Như vậy, kết quả định lượng cao HLGĐ
cho thấy phương pháp chiết xuất thu được gần
hết thành phần alkaloid có trong dược liệu.

Định lượng

Cao HLGĐ đã được xây dựng tiêu chuẩn
chất lượng về độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần
(Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép
đánh giá tính ổn định của chế phẩm, bảo đảm
tính chính xác của các kết quả mà nghiên cứu
thu được. Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1)
đơn giản, có hiệu quả, dễ thực hiện và dễ ứng
dụng trong sản xuất sau này.

Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.
Bảng 5. Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ.
Khối lượng Khối lượng
Hàm lượng
Mật độ
STT Mẫu chưa Mẫu thử đã
berberin trong cao
quang
trừ ẩm (g) trừ ẩm (g)
HLGĐT khô kiệt (%)
1

0,1178
0,0802
0,282
0,802
2
0,1073
0.0730
0,276
0,858
3
0,1187
0.0808
0,312
0,895
Trung bình
0,852

BÀN LUẬN
Kết quả định tính bằng phương pháp hóa
học cho thấy cao HLGĐ có hiện diện hợp chất
flavonoid, alkaloid và kết quả sắc ký lớp mỏng
(Bảng 4) có sự hiện diện của cả 4 dược liệu cấu
thành bài thuốc giúp khẳng định phương pháp
chiết xuất có hiệu quả.

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền

KẾT LUẬN
Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và
độ tro toàn phần trung bình là 8,46%.

Định tính bằng phương pháp hóa học cho
thấy cao HLGĐ có sự hiện diện của hợp chất
flavonoid và alkaloid. Trên sắc kí đồ của cao
HLGĐ xác định sự hiện diện của 4 dược liệu:
Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử.

207


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013

Hàm lượng Berberin trong cao HLGĐ trung
bình là 0,852%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.

4.

5.

6.

Bộ Y Tế (2008). Y lý y học cổ truyền. Nhà xuất bản Y Học, tr. 91,
148, 149.
Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất bản Y Học, tr.

733, 778, 779, 783.
Fang Q, Zhan XP, Mo JL, Sun M (2004). “The effect of Huanglian
jiedu tang on Alzheimer's disease and its influence on
cytokines”. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol. 29(6), pp. 575-578.
Hsu YL, Kuo PL, Tzeng TF, Sung SC, Yen MH, Lin LT, Lin CC
(2008). “Huang-lian-jie-du-tang, a traditional Chinese medicine
prescription, induces cell-cycle arrest and apoptosis in human
liver cancer cells in vitro and in vivo”. J Gastroenterol Hepatol, vol.
23, pp. 290-299.
Mizukawa H, Yoshida K, Honmura A, Uchiyama Y, Kaku H,
Nakajima S, Haruki E (1993). “The effect of orengedokuto on
experimentally-inflamed rats”. Am J Chin Med, vol. 21(1), pp. 71-78.
Trần Thu Nga, Nguyễn Phương Dung (2012). Nghiên cứu tác
dụng chống oxy hóa của cao chiết Hoàng liên giải độc trên

208

7.
8.

9.

chuột nhắt tổn thương gan bởi cyclophosphamid. Y học TP. Hồ
Chí Minh, tập 16, phụ bản của số 1, tr. 157-161.
Trần Văn Kỳ (2008). 250 bài thuốc đông y cổ truyền chọn lọc. Nhà
xuất bản Thanh Niên, tr. 49.
Watanabe-Fukuda Y, Yamamoto M, Miura N, Fukutake M,
Ishige A, Yamaguchi R, Nagasaki M, Saito A, Imoto S, Miyano S,
Takeda J, Watanabe K (2009). “Orengedokuto and berberine
improve indomethacin-induced small intestinal injury via

adenosine”. J Gastroenterol, vol. 44(5), pp. 380-389.
Yu YL, Lu SS, Yu S, Liu YC, Wang P, Xie L, Wang GJ, Liu XD
(2009). “Huang-lian-jie-du-decoction modulates glucagon-like
peptide-1 secretion in diabetic rats, Ethnopharmacol, vol. 124(3),
pp. 444- 449.

Ngày nhận bài báo:

28/09/2013

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

15/10/2013,
17/10/2013

Ngày bài báo được đăng:

02/01/2013

Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền