Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch kháng thể kháng nọc rắn hổ mang Naja atra

ứng chéo giữa HTKNR
với các nọc rắn khác:
Phản ứng chéo giữa huyết thanh (thỏ,
gà, ngựa) kháng nọc rắn N. atra với nọc
rắn khác loài (rắn Hổ đất, Hổ chúa, Chàm
quạp và Lục xanh) được khảo sát bằng
kỹ thuật ELISA gián tiếp. Kết quả ELISA
dương tính thể hiện sự có mặt của kháng
thể phản ứng chéo.
* Tinh sạch kháng thể:
- Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu
được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký
ái lực (sử dụng cột protein A cho huyết
thanh thỏ, cột protein G cho huyết thanh
ngựa), sau đó thẩm tích qua đêm ở 40C.
80

Hình 1: Biến động hiệu giá kháng thể đặc
hiệu trên thỏ và gà được gây miễn dịch.
Kháng thể đặc hiệu bắt đầu xuất hiện
sau mũi đầu tiên và tăng dần trong quá
trình gây miễn dịch, đạt cao nhất sau 4 - 5
lần tiêm kháng nguyên.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016

2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong HTKNR.

Hình 2: Hiệu giá kháng thể đặc hiệu của 3 HTKNR.
Hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh thỏ (T2, T3) và gà (G3) sau 5 lần gây miễn dịch

đều đạt từ 128.000 - 256.000, hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh ngựa là 256.000.
3. Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với kháng nguyên nọc
rắn khác loài.

1

2

3

4

(1: nọc rắn Chàm quạp, 2: nọc rắn Lục xanh, 3: nọc rắn Hổ chúa, 4: nọc rắn Hổ đất)

Hình 3: Phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc rắn khác loài.
81


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016

Có phản ứng chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc rắn N. atra với nọc của các
loài rắn khác. Mức độ phản ứng chéo giữa kháng thể kháng nọc rắn N. atra với nọc
loài rắn cùng họ cao hơn so với nọc các loài rắn khác họ.
4. Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgG và IgY.

IgG thỏ

IgG ngựa

IgY gà

Hình 4: Sắc ký đồ tinh sạch kháng thể IgG và IgY.
Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy với các kỹ thuật sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion,
chúng tôi đã tách được các kháng thể IgG từ huyết thanh thỏ và ngựa, IgY từ trứng gà.
5. Kết quả điện di kháng thể IgG và IgY sau tách chiết và tinh sạch.

Hình 5: Các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch.
(M: thang protein chuẩn, 1: kháng thể IgG ngựa, 2: kháng thể IgY gà, 3: kháng thể IgG thỏ)
Hình ảnh điện di cho thấy, các kháng thể sau tách chiết và tinh sạch đều có độ tinh
sạch khá cao. Kích thước các băng tương ứng với kích thước chuỗi nặng và chuỗi nhẹ
của IgG và IgY.
82


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016

6. Hoạt tính kháng thể IgG và IgY
sau tách chiết và tinh sạch.

Hình 6: Hoạt tính kháng thể sau tinh sạch.
Có thể thấy, kháng thể IgY từ trứng
gà, IgG từ thỏ và ngựa sau khi tinh sạch
vẫn có hoạt tính đối với kháng nguyên
nọc rắn N. atra (ở độ pha loãng 128.000 256.000 lần).
BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu cho thấy các cá
thể động vật được gây miễn dịch với
kháng nguyên nọc rắn N. atra ở các liều
khác nhau đều tạo được kháng thể đặc
hiệu kháng nọc rắn. Trước khi gây miễn

dịch, không có động vật nào có kháng thể
tự nhiên kháng nọc rắn. Hiệu giá kháng
thể đặc hiệu trong huyết thanh sau 5 lần
gây miễn dịch dao động từ 128.000 256.000. Như vậy, quy trình gây miễn
dịch chế tạo HTKNR mà chúng tôi áp
dụng đạt hiệu quả tốt đối với nọc rắn hổ
mang N. atra. Kết quả này phù hợp với
nghiên cứu của Đỗ Khắc Đại và CS (với
4 loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam) [2].

Nọc rắn là một hỗn hợp nhiều thành
phần, trong đó có những thành phần giống
nhau giữa nọc các loài rắn khác nhau,
đặc biệt giữa các loài rắn cùng họ. Vì vậy,
HTKNR của một loài có thể phản ứng
chéo với kháng nguyên nọc của loài rắn
khác [7]. Phản ứng chéo tạo ra khả năng
trung hoà chéo HTKNR trong điều trị,
vì vậy trong một số trường hợp, có thể sử
dụng HTKNR đặc hiệu của một loài rắn
điều trị cho nạn nhân rắn cắn bởi một loài
rắn khác cùng họ có mức độ phản ứng
chéo mạnh [7]. Tuy nhiên, về phương diện
chẩn đoán xác định loài rắn thì phản ứng
chéo lại là nguyên nhân dẫn đến hiện
tượng dương tính giả và chẩn đoán nhầm
[6]. Kết quả nghiên cứu ở hình 3 cho thấy
có hiện tượng phản ứng chéo giữa kháng
thể kháng nọc rắn N. atra với nọc của một
số loài rắn khác. Mức độ phản ứng chéo

của kháng thể với kháng nguyên nọc của
loài rắn cùng họ mạnh hơn so với các loài
rắn thuộc họ khác. Cụ thể, phản ứng
chéo giữa kháng thể (IgG, IgY) kháng nọc
rắn N. atra với nọc rắn Hổ đất và Hổ chúa
mạnh hơn so với nọc rắn Chàm quạp và
Lục xanh. Kết quả này phù hợp với nghiên
cứu của Đỗ Khắc Đại và CS [2]. Điều này
cho thấy, để chế tạo bộ xét nghiệm miễn
dịch phát hiện nọc rắn Hổ mang N. atra
với độ đặc hiệu cao, cần tiếp tục tinh chế
kháng thể để loại bỏ kháng thể phản ứng
chéo.
Ngoài ra, với các phương pháp tách
chiết và tinh sạch kháng thể (IgG, IgY)
mà chúng tôi áp dụng, kháng thể thu
được có độ tinh sạch tương đối cao và
vẫn thể hiện hoạt tính kháng thể đặc hiệu
83


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2016

với kháng nguyên nọc rắn N. atra ở độ
pha loãng 128.000 - 256.000 lần, đáp ứng
được yêu cầu chế tạo bộ xét nghiệm miễn
dịch phát hiện nọc rắn.
KẾT LUẬN
- Đã tạo được kháng thể đặc hiệu nọc
rắn Hổ mang N. atra từ huyết thanh thỏ

và từ l ng đỏ trứng gà bằng quy trình gây
miễn dịch tiêm dưới da (thỏ), tiêm trong
cơ ngực (gà), nhắc lại nhiều lần cho hiệu
giá kháng thể cao sau 5 lần gây miễn dịch.
- Có phản ứng chéo giữa kháng thể
kháng nọc rắn Hổ mang N. atra với nọc của
rắn Hổ đất, Hổ chúa, Lục xanh và Chàm
quạp ở các mức độ khác nhau.
- Kết hợp các phương pháp thường
quy tách chiết và tinh sạch kháng thể, đã
thu được kháng thể (IgG, IgY) đặc hiệu
nọc rắn N. atra có độ tinh sạch và hoạt
tính cao.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bệnh viện Bạch Mai. Số liệu thống kê
trên phần mềm quản lý của Trung tâm Chống
độc năm 2009. Hà Nội. 2009.
2. Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Đặng Dũng,
Lê Văn Đông. Nghiên cứu chế tạo HTKNR
của bốn loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam
làm nguyên liệu chế tạo xét nghiệm miễn dịch
chẩn đoán rắn độc cắn. Tạp chí Y - Dược học
Quân sự. 2008, 2, tr.108-113.

84

3. Võ Văn Chi, Nguyễn Đức Minh. Các loài
rắn thông thường ở Việt Nam, rắn làm thuốc
và thuốc trị rắn cắn. Nhà xuất bản Khoa học
và Kỹ thuật, tái bản lần thứ hai. 2000, tr.43-100.

4. Trịnh Xuân Kiếm. Rắn cắn tại Việt Nam:
Kết quả nghiên cứu 10 năm tại Bệnh viện
Chợ Rẫy. Kỷ yếu các báo cáo khoa học tại
Hội nghị Quốc tế về rắn độc và chăm sóc BN
rắn độc cắn. TP. Hồ Chí Minh. 11 - 1998.
5. Hoàng Trung Kiên, Đỗ Khắc Đại và CS.
Nghiên cứu chế tạo kháng thể kháng Edwardsiella
ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá Tra bằng công
nghệ tạo kháng thể IgY gà. Tạp chí Thông tin
Y Dược. 2010, 3, tr.71-76.
6. Selvanayagam ZE, Gopalakrishnakone P.
Tests for detection of snake venoms, toxins
and venom antibodies: review on recent trends
(1987 - 1997). Toxicon. 1999, 37 (4), pp.565-586.
7. Selvanayagam ZE, Gnanavendhan SG,
Ganesh KA et al. ELISA for the detection of
venoms from four medically important snakes
of India. Toxicon. 1999, 37 (5), pp.757-770.
8. Warrell DA. WHO/SEARO Guidelines
for The Clinical Management of the Snakebite
in Southeast Asian Region. Southeast Asian
Journal of Tropical Medicine and Public Health.
1999, 30, pp.1-85.
9. World Health Organization. WHO Guidelines
for the production, control and regulation of
snake antivenom immunoglobulins. Expert
Committee on Biological Standardization. Gevena,
Switzerland. 2010.