Phân tích thành phần các saponin chính trong sâm việt nam nuôi cấy mô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC SAPONIN CHÍNH
TRONG SÂM VIỆT NAM NUÔI CẤY MÔ
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Hoàng Hải Anh*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Phân tích thành phần các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô bằng phương pháp
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Phương pháp: Sử dụng phương pháp HPLC với cột Supelcosil RP-18 và hỗn hợp acetonitril – nước làm
pha động, phân tách và định lượng các saponin chính có trong mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, so sánh với Sâm
Việt Nam tự nhiên.
Kết quả: Qua phân tích, mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô có chứa các saponin chính trong thành phần
saponin tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên nhưng với hàm lượng thấp hơn.
Kết luận: Mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô khảo sát chứa các saponin chủ yếu có trong Sâm Việt Nam, có
triển vọng nghiên cứu hoàn chỉnh để cung cấp nguồn sâm bổ sung.
Từ khóa: Sâm Việt Nam, Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, saponin, sắc ký lỏng hiệu năng cao.

ABSTRACT
HPLC ANALYSIS OF MAJOR SAPONINS IN BIO-CULTURED VIETNAMESE GINSENG
Hoang Hai Anh, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 579 - 584
Objectives: to separate and quantitatively determine major saponins in bio-cultured products of Panax
vietnamensis by HPLC.
Methods: A reverse phase HPLC method using a Supelcosil RP-18 column and acetonitril–water mixture
as mobile phase was used to separate and quantitatively determine major saponins in cultured Vietnamese
Ginseng in comparison with the natural one.
Results: The major saponins in Panax vietnamensis are also present in bio-cultured products, but in lower

contents.
Conclusion: The bio-cultured Vietnamese Ginseng contains most of the major saponins found in the natural
one. It should therefore be a potential source of Vietnamese Ginseng in future.
Keywords: Panax vietnamensis, bio-cultured Vietnamese Ginseng, saponin, HPLC.
trong những dược liệu độc đáo, quý giá của
ĐẶT VẤN ĐỀ
nước ta với nhiều đặc tính dược lý và tác động
Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et
trị liệu có thể so sánh với sâm Triều Tiên(3,4).
Grushv. - Araliaceae) được phát hiện vào năm
Những năm gần đây nguồn Sâm Việt Nam
1973 và được nghiên cứu một cách sâu rộng về
tự nhiên đang bị khai thác trái phép, nuôi trồng
nhiều phương diện như thực vật học, trồng trọt,
chưa phát triển, khiến Sâm Việt Nam đang đối
hóa thực vật và dược lý học từ năm 1977. Các
mặt với nguy cơ cạn kiệt. Việc phát triển
nghiên cứu cho thấy rằng Sâm Việt Nam là một
*Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức

Chuyên Đề Dược Khoa

ĐT: 0908989865

Email:

579

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

phương pháp nuôi cấy Sâm Việt Nam bằng
công nghệ sinh học sẽ đóng góp nguồn Sâm Việt
Nam cho trồng trọt và sử dụng làm thuốc. Tuy
nhiên, chất lượng của sâm nuôi cấy mô còn là
một dấu hỏi.
Mục tiêu của đề tài này là áp dụng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(1,2) để phân tích
thành phần các saponin chính có trong Sâm Việt
Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam
thiên nhiên.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Mẫu

Bộ phận dùng

Sâm Việt
Rễ củ
Nam (SVN)
Sâm Việt Căn hành: 60%
Nam nuôi Tiền cây con: 20%
cấy mô Plbs : 20%
1
(SVN NCM)

Độ ẩm

Nguồn cung
cấp
6,56% Sở Y tế Kontum

10,88% Công ty TNHH
Quốc tế Hoàng
Gia (*)

(*): 30/70/9, đường D2, phường 25, quận Bình Thạnh, Tp.
HCM.

Phương pháp nghiên cứu
Hóa chất và dụng cụ máy móc
Chất chuẩn: các saponin chuẩn, gồm: G-Rb1,
G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 do Ban Nghiên
Cứu Khoa Học – Khoa Dược cung cấp, có độ
tinh khiết > 97%.

580

Resin pha đảo Diaion HP-20 (styren divinyl
copolymer resin) của Mitsubishi Chemicals Co.
(Nhật Bản).
Máy HPLC LC-10 AD – Shimadzu, Nhật
Bản, cột Supelcosil RP-C18 (150 x 4,6 mm, 5,0
µm), kèm theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6
mm), detector photodiode array (SPD-M10A VP
– Shimadzu, Nhật Bản) đặt ở bước sóng 203 nm

hoặc detector RI, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

Định tính sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch
thử: hòa tan các chất chuẩn hoặc cắn saponin
vào methanol.
Điều kiện sắc ký
Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck).
Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65: 35:10,
lớp dưới).
Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%,
sấy ở 105oC đến khi hiện màu.

Xây dựng đường chuẩn từ các saponin chuẩn
Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương
quan nồng độ chất chuẩn với diện tích đỉnh
bằng cách bơm vào máy HPLC các lượng ước
phân của từng dung dịch chuẩn với nồng độ
thích hợp [saponin (mg/ml)]: G-Rb1 (1,85), G-Rg1
(1,65), G-Rd (1,0), G-Re (0,7), N-R1 (1,5), M-R2
(3,1).

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

Quy trình phân tích bằng HPLC

Mẫu dược liệu
- Sấy ở nhiệt độ 60 ± 5oC trong 2-3 giờ
- Nghiền thành bột khá mịn (cân chính xác khoảng 3 g)
- Chiết bằng MeOH
- Chiết Soxhlet

Kiểm tra bằng SKLM
(đảm bảo chiết hết saponin)

Dịch MeOH
- Lọc và cô chân không đến cắn (toC ≤ 50oC)
- Cân cắn thu được, cho một lượng thích hợp
vào cột diaion HP-20 (2,5 x 30 cm)
- Chiết xuất lần lượt bằng nước, MeOH, CHCl3
MeOH

H2O
Dịch H2O
(hợp chất đường)

Dịch MeOH
(hợp chất saponin)

CHCL3
Dịch CHCL3
(hợp chất béo)

Cô chân không (toC ≤ 50oC)
Cắn saponin

- Cân chính xác 5 mg cắn
- Hòa tan trong 1 ml MeOH
- Lọc qua lọc 0,45 μm
- Bơm vào máy HPLC (20 μl)
Sắc ký đồ

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả phân tích bằng SKLM
Phân tích sơ bộ bằng SKLM cho thấy, sắc đồ
SKLM của SVN NCM xuất hiện các vết tương tự
như SVN, các vết saponin tương ứng với các vết
của saponin chuẩn.

Chuyên Đề Dược Khoa

581


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Bảng 1. Kết quả SKLM so sánh SVN và SVN NCM
Rf

SVN NCM

SVN

G-Rb1

0,22

x

x

G-Re

0,30

x

x

N-R1

0,32

x

x

G-Rd

0,35

x

x

G-Rg1

0,44

x

x

M-R2

4,48

x

x

x: có xuất hiện vết.

Nhận xét: Trên sắc đồ SKLM, SVN NCM cho
các vết tương ứng với các saponin chủ yếu có
trong SVN gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1
và M-R2.

Hình 1. Sắc đồ SKLM của SVN và SVN NCM
SVN: Sâm Việt Nam; SVN NCM: Sâm Việt Nam

Kết quả xây dựng đường chuẩn

582

Hình 2. Đường chuẩn G-Rb1

Hình 3. Đường chuẩn G-Rg1

Hình 4. Đường chuẩn G-Rd

Hình 5. Đường chuẩn G-Re

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Hình 6. Đường chuẩn N-R1

Nghiên cứu Y học

Hình 7. Đường chuẩn M-R2
(phút) theo thứ tự là 30,1 và 33,1. Cũng ở điều
kiện này thời gian lưu tương đối của N-R1 là
22,1.

Kết quả phân tích bằng HPLC
Kết quả định tính
Hệ dung môi 1: CH3CN-H2O (30: 70)
Trong điều kiện HPLC đã mô tả, có thể tách
được các saponin G-Rb1 và G-Rd với thời gian
lưu tương đối (phút) theo thứ tự là 20,1 và 48,2.
Tuy nhiên, hai đỉnh của G-Rg1 và G-Re trùng
nhau, rất gần với đỉnh của N-R1.

Hệ dung môi 2: CH3CN-H2O (20: 80)

Hệ dung môi 3: CH3CN-H2O (24: 76)
Phát hiện MR2: Pha động: acetonitril – nước
(24:76). Detector: Refractive Index (nhiệt độ:
30oC, độ nhạy: 9, P: 133).
Với điều kiện như trên, MR2 có thể được
tách ra khỏi G-Rg1 và G-Re với thời gian lưu
tương đối (phút) là 15,1.

Với hệ dung môi này, có thể tách được GRg1 ra khỏi G-Re với thời gian lưu tương đối

Kết quả định lượng
Bảng 6. Kết quả định lượng các saponin chính trong SVN và SVN NCM
Mẫu
SVN
SVN NCM

GRb1
2,51
x

GRg1
2,57
0,013

Hàm lượng saponin chính (%)
GRd
GRe
NR1

1,22
0,16
0,53
x
0,15
0,015

MR2
5,97
0,12

Tổng cộng
12,96
0,30

x: hàm lượng quá ít, trị số đáp ứng đỉnh quá nhỏ.

Kết quả định lượng cho thấy, mẫu SVN
NCM có chứa các saponin chính tương tự như
SVN nhưng hàm lượng các saponin này chưa
cao, có thể do ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
và thời gian nuôi cấy.

KẾT LUẬN
Bằng phương pháp SKLM và HPLC pha
đảo, chúng tôi đã phân tích được các thành phần
saponin chính trong mẫu nguyên liệu Sâm Việt
Nam nuôi cấy mô. Kết quả cho thấy, Sâm Việt
Nam nuôi cấy mô cũng có các saponin chính
tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm GRb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm

lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm
Việt Nam nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với

Chuyên Đề Dược Khoa

12,96% trong Sâm Việt Nam thiên nhiên), kết
quả ban đầu là hết sức khích lệ vì sản phẩm nuôi
cấy mô không dừng ở dạng sinh khối (callus)
mà đã phát triển thành căn hành và tiền cây.
Việc nghiên cứu hoàn chỉnh Sâm Việt Nam nuôi
cấy mô có thể đưa đến việc cung cấp nguồn cây
sâm cho trồng trọt và sử dụng như nguyên liệu
để thay thế sâm thiên nhiên.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

2.

Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một
số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược
liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Chi nhánh Tp. HCM,
tr.49-126, tr.218-232.
Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu
Trang (2001), “Quantitative determination of major saponin
contents of cultivated vietnamese ginseng – Panax
vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC”, Proceedings

583

Nghiên cứu Y học

3.

584

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

of Pharma indochina II, 20-23 Nov 2001, Hanoi, Vietnam, 247251.
Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu
Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân Sâm,

4.

NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.15-22, tr.41, tr.99-105,
tr.110-119, tr.126-130.
Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt
Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.446-455,
tr.704-710, tr.775-779.

Chuyên Đề Dược Khoa