Phân tích định lượng và phân tích tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá chất lượng Đại hoàng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

PHÂN TÍCH ĐỊNH LƢỢNG VÀ
PHÂN TÍCH TỔNG THỂ SẮC ĐỒ NHẰM ĐÁNH GIÁ
CHẤT LƢỢNG ĐẠI HOÀNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chử Văn Mến*; Nguyễn Văn Long*; Vũ Tuấn Anh*
TÓM TẮT
Phƣơng pháp phân tích định lƣợng kết hợp với phân tích tổng thể sắc đồ đƣợc phát triển
nhằm đánh giá chất lƣợng Đại hoàng dựa trên sắc đồ đặc trƣng. 5 hoạt chất gồm:
chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin và sennoside A đƣợc định lƣợng.
Thực hiện phân tách trên cột pha đảo C18 với chƣơng trình gradient sử dụng dung môi A
(dung dịch 0,05 M axit phosphoric trong nƣớc) và dung môi B (acetonitrile), bƣớc sóng
280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút. Chƣơng trình rửa giải gồm: 0 - 5 phút (20% B), 18 phút
(28% B), 25 phút (42% B), 30 phút (100% B) cho kết quả tách tốt. Phƣơng pháp trên đƣợc
áp dụng cho 31 mẫu Đại hoàng gồm các loài khác nhau. Kết quả: hàm lƣợng hoạt chất biến
động nhiều trong các mẫu Đại hoàng và không khác biệt giữa các loài Đại hoàng. Ở phân
tích tổng thể sắc đồ, 17 pic chính đƣợc chọn. Phân tích phân biệt tuyến tính LDA cho thấy
các mẫu đƣợc phân loại thành 4 nhóm với độ chính xác 100%. Nghiên cứu này cho thấy:
việc kết hợp định lƣợng các hoạt chất cùng với phân tích tổng thể sắc đồ giúp tiếp cận toàn
diện trong đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung và Đại hoàng nói riêng.
* Từ khóa: Đại hoàng; Sắc ký lỏng hiệu năng cao; Đánh giá chất lƣợng.

QUANTITATIVE AND PATTERN ANALYSIS FOR THE QUALITY
EVALUATION OF RHEI RHIZOMA BY HPLC
SUMMARY
A quantitative and pattern analysis for the quality evaluation of Rhei rhizoma by HPLC
based on chromatographic fingerprints in 40 minutes was developed. Five marker compounds,
namely, chrysophanol, emodin, emodin-glucoside, rhaponticin and sennoside A were quantitated.
The chromatographic separation was performed on a C18 column by gradient elution with
0.05 M phosphoric acid in water and acetonitrile, the wavelength was set at 280 nm, the flow
rate was set at 1 ml/min, gradient condition as followed: 0 - 5 min (20% B);

* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Chử Văn Mến ()
Ngày nhận bài: 16/8/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/10/2013
Ngày bài báo được đăng: 5/11/2013

31


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

18 min (28% B); 25 min (42% B); 30 min (100% B) gave the satisfied separation. The developed
method was applied to the quantitation of 31 samples of different Rhei Rhizoma species.
The results showed that the contents of bioactive compounds were fluctuated among samples
and there were no difference among Rhubarb species. For pattern analysis, seventeen
common peaks were selected. LDA (Linear Discriminant Analysis) showed that the samples
were clustered into 4 different groups of species with the accuracy of 100%. This study
showed that quantitative determination of marker compounds combined with patternrecognition method can provide a comprehensive approach for the quality assessment of
herbal medicines.
* Key words: Rhei Rhizoma; HPLC; Quality evaluation.
ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại hoàng (Rhei Rhizoma) là một
nhóm loài trong chi Rheum thuộc họ
Rau răm (Polygonaceae). Có ba loài của
chi Rheum có trong Dƣợc điển Việt Nam,
Hàn Quốc và Trung Quốc bao gồm:
R. tanguticum, R. palmatum và R. officinale
[1, 2, 3]. Trong dƣợc điển Nhật Bản,
ngoài ba loài trên còn có thêm Rheum
coreanum và những loài lai giữa các loài

trên là dƣợc liệu Đại hoàng [4]. Ngoài
ra, các loài không chính thức nhƣ Rheum
undulatum, Rheum rhaponticum, Rumex
crispus, Rumex aquatica và Reynoutria
elliptica thƣờng bị nhầm là Đại hoàng.
Trong một số trƣờng hợp, việc xác định
loài dựa trên phân tích mô học giữa các
loài của mẫu Đại hoàng trên thị trƣờng
cực kỳ khó khăn. Nhiều nhà nghiên cứu
và thầy thuốc đông y thƣờng bị nhầm
lẫn bởi sự không rõ ràng của nhiều loài
trong việc sử dụng dƣợc liệu Đại hoàng.
Do vậy, đánh giá chất lƣợng Đại hoàng
dựa trên thành phần hoạt chất đóng vai
trò
rất quan trọng trong kiểm soát chất
lƣợng của Đại hoàng.
Đại hoàng đƣợc biết đến với nhiều
hoạt tính sinh học nhƣ nhuận tràng ,

lợi mật, bảo vệ gan, kháng virut, kháng
viêm... [5, 6, 7]. Các hoạt chất chính
của Đại hoàng gồm: các anthraquinone
nhƣ chrysophanol, emodin [8], dianthrone
nhƣ sennoside A [9] hay stilbene nhƣ
rhaponticin [10]. Phân tích định lƣợng
đơn thuần một số chất đánh dấu không
thể phân biệt Đại hoàng thật và giả.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi kết hợp
giữa phân tích định lƣợng và phân tích

tổng thể sắc đồ nhằm đánh giá toàn diện
chất lƣợng Đại hoàng từ các loài khác
nhau.

Hình 1: Cấu trúc hóa học của các hoạt chất
chính trong Đại hoàng: 1. Sennoside A,
2. Rhaponticin, 3. Emodin-glucoside,
4. Emodin, 5. Chrysophanol.

32


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Hóa chất và thiết bị.
Hóa chất: các chất chuẩn chrysophanol,
emodin, emodin-glucoside, rhaponticin
và sennoside A đƣợc chiết xuất, phân
tách, tinh chế và xác định cấu trúc, chuẩn
nội (eugenol), acetonitrile, methanol, nƣớc
cất, axit phosphoric đạt tiêu chuẩn cho sắc
ký lỏng hiệu năng cao, các hóa chất khác
đạt tiêu chuẩn phân tích.
Mẫu Đại hoàng đƣợc thu hái từ nhiều
vùng khác nhau của Trung Quốc và Hàn
Quốc, đƣợc GS. Jae Hyun Lee, Khoa
Y học Cổ Truyền, Đại học Dong Guk
thẩm định và lƣu trữ tại Khoa Dƣợc,

Đại học Quốc gia Chung Nam, Hàn Quốc.
Thiết bị: máy sắc ký lỏng hiệu năng
cao Shimadzu gồm bơm LC-20AD, detector
SPD-20A UV/Vis, hệ thống tiêm mẫu tự
động SIL-20A, bộ phận ổn nhiệt CTO20A (Shimadzu, Japan). Thực hiện phân
tách trên cột C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm,
Optimapak, RStech Corp, Hàn Quốc).
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Điều kiện sắc ký:
Cột: cột phân tích pha đảo Optimapak
C18 (250 x 4,6; 5μm) của Công ty RS
tech (Hàn Quốc); bƣớc sóng phát hiện:
280 nm; pha động: dung môi A (dung
dịch axit phosphoric 0,05 M trong nƣớc);
dung môi B (acetonitrile); tốc độ dòng:
1 ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl.

Chƣơng trình rửa giải nhƣ sau:
THỜI GIAN
(phút)

%A

%B

80

20

0

5

5

18

80

72

20

28

18

25

72

58

28

42

25

30

58

0

42

100

30

35

0

80

100

20

35

40

80

20

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử:

- Nội chuẩn (IS): dung dịch eugenol
nồng độ 1.000 µg/ml trong methanol.
- Mẫu chuẩn: dãy các dung dịch chuẩn
có nồng độ chính xác chrysophanol (từ
2 - 200 µg/ml), emodin (1 - 100 µg/ml),
emodin-glucoside (0,5 - 50 µg/ml),
rhaponticin (2 - 200 µg/ml) và sennoside A
(0,5 - 50 µg/ml) trong dung dịch chuẩn
nội eugenol 200 (µg/ml) trong methanol.
- Mẫu thử: cân chính xác 100 mg bột
dƣợc liệu Đại hoàng, cho vào bình định
mức 10 ml. Thêm 9 ml ethanol 70% và
200μl dung dịch chuẩn nội, bổ sung
ethanol 70% vừa đủ, cân, lắc siêu âm
60 phút, cân lại, bổ sung khối lƣợng mất
bằng ethanol 70%. Ly tâm, gạn lấy lớp
trên và lọc qua màng lọc 0,45 μm.
34


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

Hình 2: Sắc ký đồ và so sánh phổ của mẫu chuẩn (a) và mẫu thử (b, c); (1): sennoside A;
(2): rhaponticin; (3): emodin-glucoside (4): emodin; (5): chrysophanol.
Với điều kiện sắc ký và phƣơng pháp
xử lý mẫu đã lựa chọn, sắc ký đồ thu
đƣợc cho các pic tách rõ ràng, nhiễu nền
thấp, thể hiện qua sắc ký đồ của mẫu thử

Đại hoàng và hỗn hợp chuẩn. Trên sắc
ký đồ, mẫu thử có thời gian lƣu trùng
với thời gian lƣu của pic sennoside A,
rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol của mẫu chuẩn lần lƣợt là
12,25; 13,35; 17,56; 34,42; 36,06 phút.
Tại thời gian lƣu của sennoside A,
rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol trên các sắc đồ mẫu thử và
mẫu chuẩn, chúng tôi đã so sánh phổ
hấp thụ UV thu đƣợc của pic. Kết quả
cho thấy phổ mẫu thử và mẫu chuẩn

trùng khít lên nhau với hệ số phù hợp lần
lƣợt là 0,9997; 0,9996; 0,9998; 0,9992 và
0,9994. Điều này chứng tỏ: pic thu đƣợc
trên sắc ký đồ của mẫu thử tinh khiết và
các thành phần khác có trong mẫu thử
không ảnh hƣởng đến quá trình phân
tích năm chất đối chiếu sennoside A,
rhaponticin, emodin-glucoside, emodin,
chrysophanol, qua đó cho phép tiến hành
định tính và định lƣợng.
1. Khoảng tuyến tính, giới hạn phát
hiện và giới hạn định lƣợng.
Pha một gồm 6 dung dịch mẫu chuẩn
có nồng độ từ 0,5 - 200 μg/ml. Tiến
hành sắc ký nhƣ điều kiện đã mô tả.

35

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

Bảng 1: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng.
NỒNG ĐỘ
(g/ml)

PHƢƠNG TRÌNH
HỒI QUY

r

LOD
(g/ml)

LOQ
((g/ml)

Sennoside A

0,9 - 50

Y = 0,0023 X - 0,0066

1,0000

0,28

0,94

Rhaponticin

2,0 - 200

Y = 0,0066 X - 0,0039

0,9998

0,15

0,50

Emodin- glucoside

0,5 - 50

Y = 0,0211 X - 0,0045

0,9997

0,05

0,15

Emodin

1,0 - 100

Y = 0,0155 X - 0,0069

0,9997

0,06

0,20

Chrysophanol

2,0 - 200

Y = 0,0061 X - 0,0055

0,9996

0,16

0,50

CHẤT
CHUẨN

Kết quả khảo sát cho thấy: với khoảng
nồng độ của sennoside A từ 0,9 - 50 μg/ml,
rhaponticin từ 2,0 - 200 μg/ml, emodinglucoside từ 0,5 - 50 μg/ml, emodin từ
1,0 - 100 μg/ml, chrysophanol từ 2,0 200 μg/ml, có sự tƣơng quan tuyến tính
giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích pic
chuẩn/chuẩn nội.
Phƣơng trình tuyến tính của các chất
sennoside A, rhaponticin, emodin-glucoside,

emodin, chrysophanol cho phép xác định
giới hạn phát hiện lần lƣợt 0,28, 0,15,
0,05, 0,06 và 0,16 µg/ml giới hạn định

lƣợng của từng chất lần lƣợt 0,94, 0,50,
0,15, 0,20 và 0,50 µg/ml.
2. Độ đúng, độ lặp lại của phƣơng
pháp.
Độ đúng và độ lặp lại của phƣơng
pháp đƣợc xác định trên các mẫu chuẩn
đã biết trƣớc nồng độ. Tính độ đúng và
độ lặp lại trong ngày bằng cách phân
tích mẫu chuẩn 5 lần/ngày; độ đúng và
độ lặp lại giữa các ngày đƣợc tiến hành
bằng cách phân tích mẫu chuẩn trong
5 ngày liên tiếp.

Bảng 2: Kết quả xác định độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp.
CHẤT
CHUẨN

NỒNG
ĐỘ

TRONG NG

(n

5)

Độ lặp lại (%)

Độ đúng (%)

GI A C C NG

(n

5)

Độ lặp lại (%) Độ đúng (%)

Sennoside A

12,5

0,73

100,2

0,93

99,2

Rhaponticin

50,0

0,83

100,9

0,83

101,1

Emodin- glucoside

12,5

1,13

99,6

1,32

99,5

Emodin

25,0

0,39

100,9

0,62

102,0

Chrysophanol

50,0

0,90

101,4

1,29

101,6

37


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

Độ đúng trong khoảng từ 99,2 - 102,0
đối với độ đúng trong ngày và giữa các
ngày. Độ lặp lại của phƣơng pháp thể
hiện ở độ lệch tƣơng đối (RSD). Kết quả
cho thấy: RSD của phƣơng pháp thấp
hơn 1,32% đối với độ lặp lại trong ngày
và giữa các ngày. Chứng tỏ phƣơng pháp
định lƣợng đồng thời các hoạt chất sinh
học có độ chính xác và lặp lại cao.
3. Kết quả phân tích định lƣợng các
hoạt chất trong mẫu dƣợc liệu Đại hoàng.
Kết quả khảo sát hàm lƣợng các hoạt
chất sennoside A, rhaponticin, emodinglucoside, emodin, chrysophanol có trong

31 mẫu Đại hoàng cho thấy: hàm lƣợng
cao nhất của sennoside A, rhaponticin,
emodin-glucoside, emodin, chrysophanol
là 16,31; 94,41; 1,81; 3,11 và 12,64 mg/g
trong dƣợc liệu khô. Hàm lƣợng hoạt chất
chính trong các mẫu Đại hoàng biến động
nhiều trong tất cả các mẫu. Không thấy sự
khác biệt giữa các loài Đại hoàng.

Hình 3: Kết quả phân tích hàm lƣợng hoạt
chất trong các mẫu Đại hoàng (mg/g):
(a) Sennoside A, (b) Rhaponticin, (c) Emodinglucoside, (d) Emodin, (e) Chrysophanol.

4. Kết quả phân tích tổng thể sắc đồ.
Tiến hành phân tích tổng thể sắc đồ
dựa trên 17 pic chung bằng LDA (phân
tích phân biệt tuyến tính) cho thấy: các
mẫu Đại hoàng từ các nguồn gốc khác
nhau đƣợc phân biệt với độ chính xác 100%.

38


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

Hình 4: Kết quả phân tích LDA các
mẫu Đại hoàng: (1) Rheum officinale,
(2) Rheum palmatum, (3) Rheum tanguticum,
(4) Rheum undulatum.
KẾT LUẬN

Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao đơn giản, hiệu quả. Đã đƣợc phát
triển và thẩm định phƣơng pháp để định
lƣợng đồng thời 5 hoạt chất trong dƣợc
liệu Đại hoàng. Hàm lƣợng của hoạt
chất biến đổi nhiều trong các mẫu,
không có sự khác biêt giữa các loài Đại
hoàng. Đại hoàng đƣợc phân biệt thành
4 nhóm khác nhau tƣơng ứng với 4 loài
với độ chính xác 100%. Phân tích định
lƣợng đồng thời các hoạt chất kết hợp
với phân tích tổng thể sắc đồ là cơ sở để
đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu nói chung
và Đại hoàng nói riêng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Dược điển Việt Nam, tập IV. 2010.
2. Pharmacopoeia of the People's Republic
of China. 2005.

virus activity from Rheum palmatum L.
ethanol extract. Chemotherapy. 2007, 53 (5),
pp.320-326.
7. Chang CH, Lin CC, Yang JJ, Namba T,
Hattori M. Anti-inflammatory effects of emodin
from ventilago leiocarpa. Am J Chin Med.
1996, 24, pp.139-142.
8. Yoshiki Kashiwada, Gen-ichiro Nonaka,
Itsuo Nishioka. Studies on Rhubarb (Rhei
Rhizoma). XV. Simultaneous determination of
phenolic constituents by high-performance

liquid chromatography. Chem Pharm Bull.
1989, 37 (4), pp.999-1004.
9. Komatsu K, Nagayama Y, Tanaka K,
Ling Y, Cai SQ, Omote T, Meselhy MR.
Comparative study of chemical constituents
of rhubarb from different origins. Chem
Pharm Bull. 2006, 54 (11), pp.1491-1499.
10. Hu Cunhua, Ye Shaojian, Zhao Libo,
Wang Jialing. Effects of five stilbene
compounds on NO mediated vasodilation
and their structure - activity relationship.
Zhongguo Yiyuan Yaoxue Zazhi. 2006,
26 (7), pp.826-829.

3. Korean Pharmacopoeia. 2007.
4. The Japanese Pharmacopoeia. 2001.
5. Okamura Nobuyuki, Abo Naomi, Aono
Mio, Eguchi Tomoyori, Yoshii Hisano, Ono
Yukio, Yagi Akira. Variation of sennoside A
content and purgative activity during preparation
of rhubarb decoction. Wakan Iyakugaku Zasshi.
2002, 19 (3), pp.114-118.
6. Li Z, Li LJ, Sun Y, Li J. Identification
of natural compounds with anti-hepatitis B
39


TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013

40