Phát hiện corticoid pha trộn trong các chế phẩm đông dược bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Nghiên cứu Y học

PHÁT HIỆN CORTICOID PHA TRỘN TRONG CÁC CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỚP MỎNG
Lê Đào Khánh Long*, Vũ Văn Hiếu*, Trương Ngọc Huyền*, Trần Hùng*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp phân tích phát hiện dexamethason, betamethason prednison,
prednisolon và hydrocortison trong các chế phẩm Đông Dược đơn giản bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Đối tượng: dexamethason, betamethason prednison, prednisolon và hydrocortison trong công thức giả lập
và các chế phẩm Đông dược lưu hành trên thị trường.
Phương pháp: Khảo sát các công thức của y học cổ truyền và các chế phẩm đang sử dụng trên thị trường
để xây dựng công thức giả lập cho việc khảo sát việc chiết xuất, tinh chế và phân tích các corticoid trong các chế
phẩm. Phương pháp chiết, dung môi chiết các corticoid ra khỏi chế phẩm và điều kiện loại tạp được khảo sát. Các
điều kiện sắc ký lớp mỏng được xác định cho việc định tính các corticoid và ứng dụng chúng trên các chế phẩm
thu thập trên thị trường.
Kết quả: đã xây dựng được công thức giả lập gồm các dược liệu thường dùng trong các công thức y học cổ
truyền và các chế phẩm thường gặp trên thị trường để khảo sát các điều kiện chiết xuất và sắc ký các corticoid.
Phương pháp chiết xuất siêu âm kết hợp với chiết phân bố lỏng-lỏng được chọn là phương pháp chiết corticoid ra
khỏi chế phẩm. Các hệ dung môi để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp đã được xác định. Để phát hiện các
corticoid trên lớp mỏng, thuốc thử xanh tetrazolium cho kết quả nhanh, tuy nhiên, thuốc thử H2SO4/cồn có
formaldehyd lại có giới hạn phát hiện thấp nhất. Giới hạn phát hiện của các corticoid trong hỗn hợp mẫu thay đổi
từ 0,3 μg đến 0,08 μg, tuỳ thuộc vào từng chất và thuốc thử sử dụng. Trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị
trường, 7 mẫu (22%) cho thấy có dexamethason hoặc betamethason. Chưa phát hiện có prednison, prednisolon
hay hydrocortison.
Kết luận: Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có thể thực hiện ở
nhiều phòng thí nghiệm. Tuy giới hạn phát hiện cao, nhưng phương pháp cũng có thể phát hiện nhiều trường
hợp pha trộn corticoid trái phép trong các chế phẩm.

ABSTRACT
DETERMINATION OF CORTICOID ADULTERANTS IN HERBAL MEDICINES
BY THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY
Le Dao Khanh Long, Vu Van Hieu, Truong Ngoc Huyen, Tran Hung
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 617 - 621
Objective: the aims of this research were to find out conditions for extraction and analysis procedures to
detect common corticoid adulterants in herbal medicines by using TLC.
Subjects: Authentic standards of dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone
acetate, dexamethasone acetate and oriental medicines obtained from market.
Method: Establishing a simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional
formulas and medicines in order to investigate the extraction-purification procedure of corticoids. Finding TLC
conditions for analysis of these corticoids and applying this procedure to analyze herbal preparations.
*Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TpHCM
Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096
Email:

Chuyên Đề Dược Khoa

617


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Results: A simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional formulas and
medicines were established for investigation of extraction-purification and analysis procedure of corticoids.
Ultrasonic solvent extraction, liquid-liquid distribution was proved a suitable sample extract and clean-up; TLC
conditions for analysis of these corticoids were studied and applied to analyze herbal preparations. Blue
tetrazolium was a fast develop and good reagent for visualization. However, sulfuric acid-formalin solution in

ethanol had a lowest detection limit. Detection limits of corticoid in simulation formulas ranged from 0.3 μg to
0.08 μg per spot depending on individual corticoids. Of the 27 oriental medicines from the market, cortisone and
betamethasone were detected in 7 samples (22%). Prednisone, prednisolone and hydrocortisone were found in
none of them.
Conclusion: Procedures of TLC analyses of corticoids adulterant in herbal preparations by TLC were
established. Although the LODs were not as high as other methods, it is a simple, easy to use and reliability
enough for quality control of herbal medicines in common cases.
Key words: corticoids, herbal medicines, TLC, dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone,
hydrocortisone acetate
chế phẩm, phương pháp định tính phát hiện
ĐẶT VẤN ĐỀ
corticoid pha trộn trong các chế phẩm Đông
Ngày nay, bên cạnh các phương pháp trị liệu
dược bằng sắc ký lớp mỏng được nghiên cứu
y học hiện đại, các phương pháp chữa bệnh theo
nhằm xây dựng một số phương pháp chiết xuất
y học cổ truyền và các thuốc có nguồn gốc tự
và sắc ký lớp mỏng phát hiện dexamethason,
nhiên ngày càng được người dân quan tâm sử
betamethason prednison, prednisolon và
dụng bởi xu hướng quay về với thiên nhiên của
hydrocortison trong chế phẩm đông dược.
người sử dụng và mức độ an toàn khi dùng lâu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
dài của thuốc. Tuy vậy, nhiều cơ sở sản xuất
NGHIÊN CỨU
thuốc thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã pha trộn
trái phép các chất tổng hợp nhằm đánh lừa
Đối tượng nghiên cứu
người sử dụng bằng hiệu quả nhanh của chúng.

Các dược liệu sử dụng cho bài thuốc giả lập
Hậu quả của việc dùng các thuốc này có thể sẽ
gồm Cam thảo, Độc hoạt, Đỗ trọng, Đương quy,
rất trầm trọng và khó lường trước được.
Ngưu tất, Phòng phong và Thổ phục linh.
Corticoid là một trong những hoá chất thường
Các chất chuẩn corticoid bao gồm:
được pha trộn nhằm gia tăng tác dụng kháng
dexamethason
(DXM), dexamethason acetat
viêm, giảm đau, chống dị ứng của các chế phẩm.
(DA), betamethason (BTM), prednison (P),
Sử dụng corticoid trong thời gian dài có thể gây
prednisolon (PL), hydrocortison acetat (HA)
hội chứng cushing, loét dạ dày tá tràng, tình
được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ
trạng loãng xương, suy giảm chức năng tuyến
Chí Minh.
thượng thận… Việc phát hiện sự hiện diện các
Các sản phẩm đông dược được mua từ các
corticoid trong các chế phẩm đông dược gặp
nhà
thuốc, chủ yếu tại khu vực Tp HCM
nhiều khó khăn do hàm lượng thấp của chất cần
phát hiện, sự phức tạp của mẫu thử. Hầu hết
Phương pháp nghiên cứu
việc định tính và định lượng corticoid trong các
Khảo sát tần suất sử dụng của các dược liệu
chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng
thường dùng trong các chế phẩm trị phong thấp,

đều dựa trên các hệ thống phân tích hiện đại
kiện tỳ trên thị trường để xây dựng một công
như LC-UV, LC-MS, GC-MS mà không phải
thức thuốc giả lập để khảo sát việc phát hiện các
phòng thí nghiệm nào cũng có được. Để tìm một
corticoid. Các dược liệu được xác định chất lượng
phương pháp đơn giản hơn mà vẫn có thể phát
trước khi sử dụng theo dược điển Việt nam.
hiện các corticoid pha trộn trái phép trong các

618

Chuyên Đề Dược Khoa


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Xây dựng quy trình chiết – loại tạp cho các

Nghiên cứu Y học

điều kiện sắc ký và khả năng phát hiện các

corticoid trên công thức giả lập dựa trên các kết

corticoid trong các chế phẩm đông dược.

quả khảo sát phương pháp và dung môi chiết,

KẾT QUẢ

loại tạp.

Công thức giả lập

Khảo sát các điều kiện sắc ký lớp mỏng bao
gồm hệ dung môi, thuốc thử (TT) phát hiện, giới
hạn phát hiện các corticoid riêng lẻ hay hỗn hợp
trong mẫu giả lập.
Áp dụng các điều kiện phân tích vào các sản
phẩm thu nhập từ thị trường có tác dụng trị
phong thấp, kiện tỳ bao gồm các dạng thuốc
hoàn, viên nang, viên nén, và dung dịch thuốc
nước. Đánh giá quy trình chiết xuất và loại tạp

Từ các tài liệu về thuốc YHCT, các bài thuốc
dân gian cũng như các sản phẩm có trên thị
trường dùng làm thuốc bổ tỳ vị, trừ phong thấp,
tiến hành thực hiện khảo sát tần suất xuất hiện
của các vị thuốc để lựa chọn vị thuốc có tần suất
sử dụng cao nhất. Kết quả 7 vị thuốc có tần suất
sử dụng cao nhất được sử dụng trong bài thuốc
giả lập (Bảng 1). Các dược liệu sử dụng đều phải
đạt tiêu chuẩn của Dược điển Việt nam III trước
khi sử dụng.

Bảng 1. Bài thuốc giả lập
Dược liệu
Cam thảo
Độc hoạt
Đỗ trọng

Đương quy
Ngưu tất
Phòng phong
Thổ phục linh

Tên khoa học
Glycyrrhiza uralensis Fisch., G. inflata Bat. hoặc G. glabra L.
Angelica pubescens Maxim.
Eucommia ulmoides Oliv.
Angelica sinensis (Oliv.) Diels.
Achyranthes bidentata Blume
Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.
Smilax glabra Roxb.

Khảo sát quy trình chiết xuất – loại tạp
Qua khảo sát, đánh giá các dung môi chiết,
khả năng loại tạp, khả năng hoà tan chất cần
chiết, mức độ hao hụt chất cần chiết và các yếu
tố ảnh hưởng… quy trình chiết xuất được chọn
như sau: dược liệu được chiết loại tạp bằng nhexan (chiết trong bể siêu âm 3 lần, tỉ lệ
mẫu:dung môi = 1/20; 1/20 và 1/10) sau đó bằng
MeOH-H2O (3:7) ở pH 5 với số lần và lượng
dung môi tương tự như trên để chiết các
corticoid. Dịch methanol-nước được loại tạp
bằng cách phân bố với ether dầu rồi dùng ethyl
acetat để chiết lấy corticoid.

Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng
Khảo sát hệ dung môi tách các corticoid trên
sắc ký lớp mỏng

Kết quả khảo sát khả năng tách của các
corticoid trên sắc ký lớp mỏng (SKLM) đã thu
được một số dung môi tách tốt như sau:

Chuyên Đề Dược Khoa

Hoạt chất chính
Liều lượng
Flavonoid, saponin
1g
Acid béo, sterol, angelicol
2g
Alkaloid, glycosid, chất nhựa
3g
Tinh dầu
3g
Saponin, sterol
3g
Glycosid đắng, tinh dầu
2g
Saponin, chất nhựa, tanin
3g

Hệ 1: Benzen
(120:60:18:1)

-

Et2O-acid

acetic-H2O

Hệ 2: Toluen - EtOAc-H2O (7:3:5)
Hệ 3: CHCl3 - EtOAc (9:1)
Hệ 4: CHCl3 – Aceton - H2O (8:2:5)
Hệ 5: CHCl3 - MeOH (9:1)
Các hệ dung môi trên tách tốt các corticoid
ra khỏi nhau và khỏi các thành phần trong chế
phẩm giả lập. Tuy nhiên, với hai đồng phân lập
thể là DXM và BTM thì chưa được tốt. hai vết
còn chồng lên nhau trên sắc đồ. Kết quả khảo sát
các hệ dung môi nhằm tách được hai corticoid
này đã thu được các hệ dung môi:
Toluen - EtOAc - H2O (7:3:5)
CHCl3 - EtOH (9:1)
Et2O - EtOAc (1:4)
Et2O - EtOAc - H2O (2:8:5)
BuOAc - EtOAc (8:2)

619


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011

Khảo điều kiện phát hiện các corticoid trên
SKLM
Từ kết quả khảo sát trên 30 phương pháp
phát hiện corticoid trên SKLM, đã chọn được các

điều kiện phát hiện là: soi dưới đèn UV 254 nm,
thuốc thử xanh tetrazolium, dung dịch
H2SO4/cồn có formaldehyd. Phương pháp phát
hiện và thuốc thử này đơn giản, dễ sử dụng và
dễ phát hiện các corticoid.
Trên sắc đồ sắc ký lớp mỏng, thuốc thử xanh
tetrazolium cho màu tím với corticoid nhưng
cũng cho màu tím với một vài chất khác trong
dịch chiết; tuy vậy màu tím của các corticoid
xuất hiện ngay sau khi phun thuốc thử, trong
khi các vết trong dịch chiết nếu có màu thì để
lâu sau mới xuất hiện. Dung dịch H2SO4 có
formaldehyd sau khi sấy được quan sát dưới UV
365 nm cho màu cam với các corticoid có thể
phân biệt với các chất khác trong dịch chiết. Tuy
nhiên, các vết cần được tách riêng. Một số thuốc
thử như acid phosphomolybdic cho màu xanh

dương tất cả các chất kể cả chất có trong dịch
chiết, không phân biệt được với các corticoid.
Một số thuốc thử như anisaldehyd - sulfuric,
vanillin - sulfuric cho các vết màu khác biệt
nhưng khó phân biệt. Thuốc thử vanillin sulfuric cho màu chàm với BTM, xám đậm với
DA và DXM và xanh dương với prednison và
prednisolon. Thuốc thử anisaldehyd - sulfuric
cho màu vàng chanh với DA, DXM, prednison,
prednisolon; cho màu cam nhạt với BTM và HA.
Lượng thuốc thử, nhiệt độ sấy, thời gian sấy
cũng ảnh hưởng đến việc lên màu của các thuốc
thử. Qua các kết quả thử nghiệm, tetrazolium

được chọn là thuốc thử chính vì khá đặc hiệu
với các corticoid.

Giới hạn phát hiện các corticoid trên SKLM
Kết quả xác định giới hạn phát hiện của các
corticoid trên các vết trên sắc ký đồ các của mẫu
chuẩn pha trong dung môi và mẫu chuẩn trong
chế phẩm giả lập được trình bày ở Bảng 2 và 3.

Bảng 2. Giới hạn phát hiện trên chất chuẩn
Lượng chất
chuẩn có thể
phát hiện được

UV 254 nm
TT Xanh tetrazolium
TT H2SO4/cồn có formaldehyd

DXM
0,07 µg
0,3 µg
0,03 µg

DA
0,08 µg
0,3 µg
0,03 µg

BTM
0,04 µg

0,08 µg
0,02 µg

HA
Prednison Prednisolon
0,04 µg
0,04 µg
0,04 µg
0,2 µg
0,1 µg
0,1 µg
0,016 µg
0,02 µg
0,02 µg

Bảng 3. Giới hạn phát hiện chất chuẩn trong dịch chiết chế phẩm giả lập
Lượng chất
chuẩn có thể
phát hiện được

UV 254 nm
TT Xanh tetrazolium
TT H2SO4/cồn có formaldehyd

DXM
0,1 µg
0,3 µg
0,08 µg

Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của

corticoid trên sắc ký lớp mỏng cho thấy BTM có
thể phát hiện ở lượng thấp hơn so với DXM và
DA ở trên chất chuẩn cũng như trong chế phẩm
giả lập với tất cả các phương pháp phát hiện.
Giới hạn phát hiện của prednison và prenisolon
là gần như nhau. Nhìn chung, các corticoid có
giới hạn phát hiện có thể coi là tương đương
nhau. Tuy nhiên, việc giới hạn phát hiện của các
corticoid phụ thuộc vào cảm quan nên mức độ
chính xác khi ở gần giới hạn này sẽ thấp.

620

DA
0,1 µg
0,3 µg
0,1 µg

BTM
0,1 µg
0,1 µg
0,05 µg

HA
Prednison Prednisolon
0,04 µg
0,2 µg
0,2 µg
0,2 µg
0,3 µg

0,3 µg
0,016 µg
0,1 µg
0,2 µg

Ứng dụng phương pháp phát hiện
corticoid trên sản phẩm thị trường
Áp dụng các kết quả khảo sát trên với 26
mẫu chế phẩm đông dược thu mua trên thị
trường, đã phát hiện được 7 mẫu có sự pha trộn
cortioid (Bảng 4). Việc xác định sơ bộ hàm lượng
các chất trong chế phẩm được dựa trên so sánh
diện tích và cường độ các vết trên sắc dồ so với
giai mẫu của chất chuẩn.
Bảng 4. Kết quả phân tích khối phổ một số sản phẩm
Mã số sản phẩm

Corticoid phát hiện

H2L03HC

BTM (0,010% đến 0,030%)

H2L05NA

BTM (0,010% đến 0,030%)

Chuyên Đề Dược Khoa

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Mã số sản phẩm

Corticoid phát hiện

H2L06TN

BTM (0,010% đến 0,030%)

H2L22NA

DXM (0,03% đến 0,05%)

H2L23NA

DXM (0,03% đến 0,05%)

H2L16NA

DXM (> 0,050%)

H2L17NA

DXM (> 0,050%)

KẾT LUẬN
Để phát hiện các corticoid pha trộn trái phép
trong các chế phẩm đông dược, đề tài đã xây
dựng công thức giả lập gồm 7 dược liệu có tần
suất xuất hiện cao trong các chế phẩm trên thị

trường cũng như các phương thuốc của y học cổ
truyền. Công thức giả lập này được sử dụng
trong nghiên cứu việc phát hiện các chất trên sắc
ký lớp mỏng cũng như có thể sử dụng cho các
nghiên cứu tiếp theo. Từ đó đã xây dựng được
quy trình chiết xuất – loai tạp tối ưu cho việc
phát hiện corticoid trên sắc ký lớp mỏng. Các
điều kiện phân tích sắc ký như hệ dung môi,
thuốc thử phát hiện và giới hạn phát hiện các
chất cũng đã được xác định. Kiểm tra phương
pháp và thử phân tích các chế phẩm có trên thị

Chuyên Đề Dược Khoa

Nghiên cứu Y học

trường cũng đã phát hiện gần 1/3 trong 26 sản
phẩm có pha trộn corticoid như dexamathason,
betamethason, dexamethason dạng acetat.
Phương pháp có thể dể dàng được áp dụng ở
mọi cơ sở phân tích ở các địa phương chưa có
điều kiện có các thiết bị phân tích hiện đại.
Các kết quả cho thấy, dù là phương pháp
đơn giản, độ nhạy còn thấp nhưng cũng đủ để
phát hiện các mẫu có corticoid trong nhiều
trường hợp. Các nghiên cứu phát hiện các
corticoid bằng các phương tiện hiện đại hơn như
HPLC-UV, HPLC-MS, HPLC-MS/MS đã và
đang được thực hiện và sẽ được báo cáo trong
các bài báo tiếp theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.

3.

Huetos Olga (1999),“Determination of Dexamethason in feed
by TLC and HPLC”, Analyst, 124, 1583-1587
Nguyễn Văn Thị, Nguyễn Thị Kim Danh (2002). Xây dựng quy
trình chiết xuất Dexamethason acetat và cyproheptadin hydroclorid
trộn trái phép trong chế phẩm Đông dược, Y học TP Hồ Chí
Minh.
Vũ Thị Mỹ Hương (2008). Phát hiện corticoid được pha trộn
trong chế phẩm Đông dược, Khóa luận dược sĩ Đại học, Khoa
dược, ĐHYD TpHCM

621