Xây dựng quy trình xác định (định tính, định lượng) bifidobacterium longum trong các chế phẩm probiotics

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI






TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG




XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM
LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTICS





LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2014




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI






TRỊNH THỊ PHƢƠNG DUNG




XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH (ĐỊNH
TÍNH, ĐỊNH LƢỢNG) BIFIDOBACTERIUM
LONGUM TRONG CÁC CHẾ PHẨM
PROBIOTICS


LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ 60 72 04 10



Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng






HÀ NỘI 2014




LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được hoàn thành tại khoa Vi Sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc
Trung Ương – Bộ Y tế. Để có được bản luận văn tốt nghiệp này tôi xin bày tỏ lòng
biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Việt Hùng, người thầy đã trực tiếp hướng
dẫn, dìu dắt tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.
Xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau
đại học, Bộ môn Kiểm Nghiệm Thuốc và Độc chất và các Bộ môn khác của trường
Đại Học Dược Hà Nội đã giúp tôi trang bị tri thức, tạo môi trường, điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình hoàn
thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Cao Sơn – Viện trưởng Viện kiểm

Nghiệm Thuốc Trung Ương, Ban Giám Đốc Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung
Ương, các đồng nghiệp trong khoa và Th s. Khổng Thị Minh Huệ đã hỗ trợ, giúp đỡ
để tôi hoàn thành tốt luận văn thạc sĩ và hoàn thành khóa học theo đúng thời hạn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên
tôi động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua


Hà Nội 27 tháng 8 năm 2014
Dược sỹ Trịnh Thị Phương Dung






MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS 3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dược 3
1.1.3. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics 4
1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lượng probiotics 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM 6
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33], 6
1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics. 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM 7

1.3.1. Đặc điểm hình thái 7
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31]. 8
1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24] 8
1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35]. 9
1.3.5. Phương pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics 10
1.3.6. Tình hình nghiên cứu định tính và định lượng B. longum trong các chế
phẩm probiotics trong những năm gần đây 17
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. PHƢƠNG TIỆN DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 20
2.1.1. Môi trường, hoá chất, dung môi, thiết bị 20
2.1.1.1. Môi trường 20
2.1.1.2. Hoá chất, dung môi 22
2.1.1.3. Thiết bị, dụng cụ 23
2.1.2. Phần mềm xử lý kết quả: Apiweb của hãng BioMérieux. 24
2.1.3. Chủng vi sinh vật chuẩn 24
2.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 25


2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.3.1. Phương pháp định lượng B. longum trong chế phẩm 26
2.3.2. Phương pháp định danh vi sinh vật bằng kit API 20A 27
2.3.2.1. Nguyên tắc chung 27
2.3.2.2. Tiến hành 28
2.3.3. Định danh đến loài bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31
2.3.3.1. Sơ đồ chung định tính B. longum trong các chế phẩm probiotics
bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 31
2.3.3.2. Tách DNA vi khuẩn bằng WizardR Genomic DNA Purification Kit
32
2.3.3.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử

ngoại ở bước sóng 260 nm (A
260
) 33
2.3.3.4. Nghiên cứu, thiết kế mồi đặc hiệu 33
2.3.3.5. Kiểm tra khả năng tách DNA 34
2.3.3.6. Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng nghiên cứu bằng kỹ
thuật PCR 35
2.3.3.7. Nhân dòng và giải trình tự 36
2.3.4. Thẩm định quy trình đã xây dựng 39
2.3.4.1. Thẩm định phương pháp định lượng B. longum 39
2.3.4.2. Thẩm định qui trình định danh bằng kit API 20A 41
2.3.4.3. Thẩm định qui trình định danh bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 41
2.3.5. Ứng dụng quy trình chuẩn để định lượng và định tính B. longum trong
các chế phẩm probiotics đang lưu hành trên thị trường 44
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45
3.1. XÁC ĐỊNH SỐ LƢỢNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM
PROBIOTICS 45
3.2. ĐỊNH DANH VI SINH VẬT BẰNG KIT API 20A 46
3.3. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH VI SINH VẬT TRONG CÁC MẪU BẰNG
KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ 51
3.3.1. Kết quả tách DNA 51
3.3.1.1 Tách DNA bằng Wizard
R
Genomic DNA Purification kit của hãng
Promega 51
3.3.1.2. Kiểm tra khả năng tách DNA 51
3.3.2. Nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các đối tượng vi sinh vật thuộc đối
tượng nghiên cứu 52

3.3.3. Nhân dòng và giải trình tự 55
3.3.3.1.Tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của các vi
sinh vật phân lập từ các mẫu nghiên cứu bằng bộ kit Fermentas 55
3.3.3.2. Nhân dòng các đoạn gen đặc hiệu vào vector nhân dòng và biến nạp
vào tế bào E. coli chủng DH5α 56
3.3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của các đoạn gen đặc hiệu trong plasmid tái tổ
hợp 57
3.3.3.4. Giải trình tự mẫu chứa phân đoạn 831 bp 60
3.4. ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP 62
3.4.1. Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường định lượng BSM agar . 62
3.4.2. Độ lặp lại của phép định lượng 63
3.4.3. Thẩm định độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kit API
20A 64
3.4.4. Đánh giá độ đặc hiệu của quy trình định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật
PCR 65
3.4.5. Xác định ngưỡng phát hiện của quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặp mồi đặc hiệu. 68
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO 74
PHỤ LỤC



CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AA: Acid acetic
AL: Acid lactic
ATCC: American Type Culture Collection
B. longum: Bifidobacterium longum
dATP: Deoxy adenosine Triphosphat

dCTP: Deoxy cytosineTriphosphat
dGTP: Deoxy guanine Triphosphat
DNA: Deoxyribo nucleic acid
dNTP: Deoxy nucleic Triphosphat
dTTP: Deoxy thymin Triphosphat
E. coli : Escherichia coli
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations
FISH: fluorescence in situ hydridization
JCM: Japan Colletion of Microorganisms
LAB: Lactic acid bacteria
LB Luria Bertani
PCR: Polymerase Chain Reaction
rRNA: Ribosome Ribonucleic acid
VSV: Vi sinh vật



DANH MỤC BẢNG


Trang
Bảng 2.1

Mồi đặc hiệu

22
Bảng 2.2

Hóa chất, dung môi

22
Bảng 2.3

Các vi sinh vật chuẩn được sử dụng

24
Bảng 2.4

Cách đọc kết quả kit Api 20A
30
Bảng 2.5
Trình tự các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR
34
Bảng 2.6
Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách
35
Bảng 2.7
Thành phần của phản ứng PCR đơn mồi
36
Bảng 2.8
Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
38
Bảng 2.9
Các chủng chuẩn kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM
agar
40
Bảng 2.10
Công thức tính độ đặc hiệu
42

Bảng 2.11
Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng của sản phẩm PCR
43
Bảng 3.1
Số lượng vi sinh vật trong chế phẩm
45
Bảng 3.2
Theo dõi phản ứng định danh vi sinh vật bằng kit API 20A
48
Bảng 3.3
Kết quả định danh vi sinh vật bằng phần mềm Apiweb
50
Bảng 3.4
Kết quả đo quang các dung dịch DNA mới tách
51
Bảng 3.5
Thành phần của phản ứng PCR
53
Bảng 3.6
Kết quả kiểm tra tính chọn lọc của môi trường BSM agar
62
Bảng 3.7
Kết quả đếm số lượng vi khuẩn trong mẫu A
64
Bảng 3.8
Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi BlonF/BlonR trên
20 chủng
66
Bảng 3.9
Kết quả đếm số lượng vi khuẩn B. longum

68
Bảng 3.10
Kết quả xác định ngưỡng phát hiện
69




DANH MỤC HÌNH


Trang
Hình 1.1

Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử
8
Hình 1.2

Hình ảnh genom B. longum

8
Hình 1.3

Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
14
Hình 1.4

Hình minh họa kỹ thuật PCR
14
Hình 2.1

Sơ đồ định tính B. longum bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự
31
Hình 3.1
Định danh vi sinh vật trong trong mẫu A bằng kit API 20A
46
Hình 3.2

Định danh vi sinh vật trong trong mẫu B bằng kit API 20A
46
Hình 3.3

Định danh vi sinh vật trong trong mẫu C bằng kit API 20A

47
Hình 3.4

Định danh vi sinh vật trong trong mẫu D bằng kit API 20A

47
Hình 3.5

Định danh vi sinh vật trong trong mẫu E bằng kit API 20A

47
Hình 3.6
Quan sát giếng ESC dưới đèn UV ở bước sóng 365nm
48
Hình 3.7
Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen 16S rDNA
bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R

52
Hình 3.8
Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu
của B. longum bằng cặp mồi BlonF/BlonR
54
Hình 3.9

Kết quả điện di mẫu tinh sạch sản phẩm PCR nhân bản các
đoạn gen đặc hiệu phân lập từ các mẫu nghiên cứu trên gel
agarose 1%
55
Hình 3.10
Sơ đồ vector nhân dòng pGEMT-eseay
56
Hình 3.11
Kết quả biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. Coli DH5α. và
cấy trải trên môi trường nuôi cấy có bổ sung ampicillin
100µg/ml
57
Hình 3.12
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp
mang các đoạn gen có kích thước 831bp
58
Hình 3.13
Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp mang
các phân đoạn 831 bp bằng enzym EcoRI
59


Hình 3.14

Hình thái khuẩn lạc B. longum trên môi trường BSM agar
63
Hình 3.15
Định danh B. longum JCM 1217 bằng kit Api 20A
65
Hình 3.16
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp
mồi nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum
67
Hình 3.17
Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định ngưỡng phát hiện của
quy trình nhân bản đoạn gen đặc hiệu của B. longum
70
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.
Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ
đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục
đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotics ngày càng được quan tâm và
phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotics đã không ngừng cung cấp
những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotics đối với sức
khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn
probiotics xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ… Năm 2008, doanh thu
từ các chế phẩm này là 15,9 tỉ USD trên toàn cầu [10].
Probiotics bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (for life).
Năm 2002 tổ chức Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới nêu rõ:
“probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với một lượng thích hợp, sẽ
tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể chủ” [32]. Các probiotics
thường có trong các chế phẩm là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) trong đó bao gồm

chi Lactobacillus và chi Bifidobacterium, vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, nấm
Saccharomyces cerevisiae…
Theo Robin Temmerman (2001) trong số 55 mẫu khảo sát chỉ có khoảng 20%
chế phẩm có chứa vi khuẩn đúng như trên nhãn, 16% chế phẩm không chứa một
trong các chủng probiotics được liệt kê trên nhãn [28]. Mặt khác số lượng vi sinh
vật trong các chế phẩm probiotics giảm nhiều trong thời gian bảo quản. Như vậy,
việc định tính, định lượng các loài vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm là rất
quan trọng, đảm bảo chất lượng của chế phẩm, mang lại hiệu quả cho người dùng.
Thị trường thuốc Việt Nam hiện có hàng trăm chế phẩm probiotics dưới dạng
thuốc và thực phẩm chức năng, trong đó có rất nhiều chế phẩm có chứa
Bifidobacterium longum (B. longum là một vi khuẩn thuộc nhóm LAB) dưới dạng
đơn hoặc đa thành phần. Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu
để định tính và định lượng B. longum trong các chế phẩm đa thành phần, tuy nhiên
ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩm probiotics còn đang bỏ
2

ngỏ. Cụ thể là Việt Nam chưa có một tài liệu chính thức nào hướng dẫn kiểm soát
chất lượng các chế phẩm probiotics bao gồm cả các chế phẩm chứa B. longum. Đa
số các tiêu chuẩn cơ sở của các thuốc và thực phẩm chức năng trong nước cũng như
nhập khẩu chưa định lượng riêng cũng như chưa định tính được B. longum trong
các chế phẩm có chứa hỗn hợp nhiều vi sinh vật.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế và tính cấp thiết về yêu cầu kiểm tra chất lượng
của các chế phẩm probiotics, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình xác
định (định tính, định lượng) Bifidobacterium longum trong các chế phẩm
probiotics” với các mục tiêu:
- Xây dựng quy trình chuẩn định tính, định lượng B. longum trong các chế
phẩm đa thành phần.
- Ứng dụng quy trình đã thiết lập để khảo sát chất lượng của một số chế
phẩm probiotics có chứa B. longum đang lưu hành trên thị trường.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTICS
1.1.1. Định nghĩa
Hàng ngàn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên
men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỷ 19 nhà
khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu về vấn đề này. Từ đó
đến nay, lĩnh vực nghiên cứu về probiotics ngày càng được quan tâm và phát triển.
Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về probiotics, tuy nhiên định nghĩa của tổ chức
Nông Lương Liên hiệp quốc và tổ chức Y tế thế giới năm 2002 là được sử dụng
rộng rãi phổ biến nhất: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi sử dụng với
một lượng thích hợp, sẽ tạo nên những hiệu quả tốt đối với sức khỏe của cơ thể
chủ” [32].
1.1.2. Ứng dụng của probiotics trong ngành Dƣợc
Probiotics có các tác dụng sau:
- Tiêu diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của các vi sinh vật có hại bằng cách

tiết ra các chất giống kháng sinh như acidolin, lactocidin và acidophilin.
- Sinh ra các vitamin bao gồm niacin, acid folic, biotin, vitamin B6
- Hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, điều chỉnh nồng độ enzym.
- Giảm pH bằng cách sinh ra acid lactic, hydrogen peroxyd do đó ức chế sự
phát triển của các vi sinh vật và nấm có hại.
- Giải độc và bảo vệ niêm mạc ruột: Lactobacillus có khả năng liên kết với
các chất độc như kim loại nặng, tế bào ung thư, các vi sinh vật này sẽ chết
cùng với chất độc và được loại trừ ra khỏi cơ thể cùng với chất độc dưới
dạng chất thải rắn.
- Giảm nồng độ cholesterol.
- Hỗ trợ hấp thu các khoáng chất, đặc biệt là calci do tác dụng làm giảm pH
ruột của chúng.
- Giảm nguy cơ bị ung thư, khối u [3], [6].
4

Với những tác dụng trên, Probiotics được sử dụng với mục đích chính là làm
cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột trong hoặc sau khi điều trị bằng kháng sinh do
kháng sinh đã làm thay đổi hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giảm số lượng vi
sinh vật có lợi và thường gây ỉa chảy, rối loạn tiêu hóa [34]. Ngoài ra, Probiotics
còn được sử dụng để điều trị viêm đường tiêu hóa thường gặp ở trẻ sơ sinh do bị
nhiễm Rota virus, điều trị tiêu chảy, ung thư ruột kết, đau dạ dày do nhiễm
Helicobacteria pylori, bệnh về dị ứng, ngăn cản nhiễm trùng âm đạo do Candida
albicans [3], [6].
1.1.3. Các vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng trong chế phẩm probiotics
Nếu trước kia sự lựa chọn vi sinh vật cho chế phẩm Probiotics dùng làm thuốc
chủ yếu dựa trên kinh nghiệm thì hiện nay, các nhà khoa học đã đưa ra những tiêu
chí rất rõ ràng, đó là:
- Có khả năng chịu được pH thấp ở dạ dày và acid mật ở ruột non
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa
- Không gây bệnh, không sinh độc tố

- Có khả năng sống và cư trú trong ruột.
Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotics là
Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Ngoài ra, còn một
số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng như Bacillus, Streptococcus… [3], [6], [29].
1.1.4. Tổng quan về tiêu chuẩn chất lƣợng probiotics
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hướng dẫn xây dựng tiêu chuẩn chất lượng
của probiotics. Theo khuyến cáo của FAO (2002), tiêu chuẩn chất lượng của các
probiotics bao gồm các chỉ tiêu [32]:
- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu
hình và kiểu gen
- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,
kháng dịch vị, kháng muối mật
- Các bằng chứng về sự an toàn
- Thử in vivo trên động vật và trên người
5

- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm
Năm 2009, Bộ y tế Canada cũng ban hành chuyên mục về probiotics, trong đó
cũng yêu cầu định danh vi sinh vật đến loài bao gồm cả kiểu hình và kiểu gen [10].
Đến năm 2011, Bộ sức khỏe và gia đình cùng với Bộ Công nghệ sinh học của
Ấn Độ đã ban hành hướng dẫn đánh giá chất lượng probiotics khá đầy đủ bao gồm
9 chỉ tiêu [16]:
- Định danh vi sinh vật: yêu cầu phải định danh đến loài bao gồm cả kiểu
hình và kiểu gen. Trong đó chỉ ra kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử
để định danh vi sinh vật.
- Các thử nghiệm in vitro về hoạt tính của probiotics: kháng kháng sinh,
kháng dịch vị, kháng muối mật
- Các bằng chứng về sự an toàn trên động vật
- Các thử nghiệm về tác dụng của probiotics trên động vật
- Các bằng chứng về sự an toàn trên người

- Thử tác dụng trên người
- Các yêu cầu về nhãn sản phẩm
- Các thử nghiệm xác định liều
- Yêu cầu ghi nhãn
- Yêu cầu trong sản xuất và thủ tục đăng ký
Hiện nay Việt Nam chưa có văn bản chính thức nào về việc đánh giá chất
lượng của các chế phẩm probiotics. Chỉ có duy nhất TCVN 7849:2008 đưa ra
phương pháp đếm L. acidophilus trong sữa và các chế phẩm sữa trên môi trường
đặc hiệu [5]. Việc kiểm soát chất lượng mới chỉ dừng lại ở xác định số lượng vi sinh
vật, định tính dựa trên kiểu hình, độ nhiễm khuẩn và các chỉ tiêu về dạng bào chế
theo tiêu chuẩn nhà sản xuất. Trong rất nhiều trường hợp, tiêu chuẩn chất lượng còn
rất sơ sài, đặc biệt chưa định danh được tất cả các vi sinh vật trong chế phẩm.
6

1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI BIFIDOBACTERIUM
1.2.1. Đặc điểm chung của chi Bifidobacterium [30], [33],
Các vi khuẩn thuộc chi Bifidobacterium trước đây thường được gọi là
Lactobacillus bifidus và được phân loại thành 29 loài khác nhau. Ngày nay, người
ta đã phát hiện ra hơn 33 loài thuộc chi Bifidobacterium, trong số đó có khoảng 12
loài có mặt ở đường tiêu hóa của người.
Bifidobacteria là các trực khuẩn gram dương, kị khí bắt buộc. Chúng thuộc
loại vi khuẩn lên men không đồng nhất, không di động và không hình thành bào tử.
Bifidobacteria cho phản ứng catalase âm tính, phản ứng indol âm tính và phản ứng
fructose–6-phosphate phosphoketolase dương tính. Chúng phát triển ở khoảng nhiệt
độ thích hợp từ 37-41
o
C, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20
o
C và trên 46
o

C, Tuy
nhiên, có một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ trên 46
o
C như B.
thermacidophilum. Khoảng pH tối ưu cho sự phát triển của Bifidobacteria là 6,5-
7,0. Bifidobacteria không phát triển được ở pH dưới 4,5 và trên 8,5 ngoại trừ B.
thermacidophilum có thể phát triển được ở pH 4,0.
Các vi khuẩn Bifidobacterium là những vi sinh vật quan trọng trong hệ đường
ruột của người và chiếm 3,5 đến 10% hệ sinh vật ở ruột kết. Chúng chiếm ưu thế ở
trong phân của trẻ bú mẹ, còn trong phân của trẻ bú bình chúng chiếm khoảng 40%
hệ vi sinh vật. Chúng là một trong năm loài chiếm ưu thế trong hệ thống đường tiêu
hóa của người, ngoài ra còn được tìm thấy ở âm đạo và khoang miệng. Ngoài ra
Bifidobacteria cũng được tìm thấy trong hệ thống đường tiêu hóa của nhiều động
vật như bò cái, cừu, lợn, gà, thỏ, chuột và ong mật.
1.2.2. Bifidobacteria với vai trò là probiotics.
Bifidobacteria là những probitics phổ biến và là một phần quan trọng của hệ vi
khuẩn trong đường tiêu hóa. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), có
khả năng tổng hợp amino acid (acid glutamic và acid aspartic), sản xuất một số
vitamin như riboflavin, thiamin, vitamin B
2,
vitamin B
6
và biotin.
7

Ngoài ra Bifidobacteria còn có khả năng sản xuất bacteriocin (hóa chất kháng
khuẩn) và các chất giống kháng sinh do đó chúng rất có lợi đối với hệ thống tiêu
hóa và miễn dịch [33].
Tuy nhiên, không giống như các vi khuẩn Lactobacillus, các vi khuẩn
Bifidobacterium còn sản sinh ra acid acetic, là acid béo chuỗi ngắn. Acid acetic hạn

chế nấm phát triển hiệu quả hơn acid lactic và nó cũng được xem là nguồn năng
lượng cho cơ thể. Do tạo ra đồng thời acid acetic và acid lactic cũng như một số
chất có ích khác nên các vi khuẩn Bifidobacterium rất cần thiết cho đường âm đạo
và đường niệu sinh dục, nơi mà nấm và các vi khuẩn cơ hội có thể gây bệnh, cũng
như trong hệ tiêu hóa [36].
Một số lợi khuẩn Bifidobacterium có tác dụng tốt đối với cơ thể người do
chúng có thể làm thay đổi hệ miễn dịch. Trong một số trường hợp chúng giúp tăng
cường hệ miễn dịch cũng như có tác động chống viêm.
Một số Bifidobacteria hay được dùng trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm
chức năng với vai trò là probiotics là Bifidobacterium longum, Bifidobacterium
infantis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium breve…
1.3. TỔNG QUAN VỀ B. LONGUM
1.3.1. Đặc điểm hình thái
B. longum thuộc nhóm vi sinh vật sinh acid lactic và thuộc chi
Bifidobacterium.
B. longum là vi khuẩn Gram dương, hình que phân nhánh, kỵ khí bắt buộc,
không di động, không sinh bào tử và cho phản ứng catalase âm tính. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở 38 - 39°C, tối thiểu ở 19-20°C, tối đa ở 44,5-45°C. B. longum tăng
trưởng tối ưu ở pH 7-8, không tăng trưởng ở pH 5,0 hoặc 9,5 [12].

8


Hình 1.1. Hình ảnh B. longum trên kính hiển vi điện tử
1.3.2. Khả năng chuyển hóa carbohydrat [31].
B. longum có khả năng lên men các đường: arabinose, xylose, glucose,
fructose, mannose, galactose, maltose, sucrose, lactose, melibiose, raffinose. Sản
phẩm cuối cùng của quá trình lên men đường là acid lactic (AL) và acid acetic
(AA), với tỷ lệ từ 1,0 (AL): 1,7 (AA) đến 1,0 (AL): 2.0 (AA).
B. longum không lên men các đường: rhamnose, melezitose, cellobiose,

trehalose, dextrin, tinh bột, inulin, sorbitol, manitol, glycerol, salicin, gluconate và
lactate.
1.3.3. Cấu trúc gen cuả B. longum [24]
Nhiễm sắc thể của B. longum có chiều dài khoảng 2,26 Mb, tỷ lệ Guanine -
Cytosine là 65%.


Hình 1.2. Hình ảnh genom B. longum
9


Trong đó:
A: Kích thước gen biểu diễn trên thang Mb
B: Chuỗi mã hóa: gồm 2 sợi bổ sung, các mũi tên chỉ phần chuyển tiếp GC
C: Thang G-C
D: Cấu tạo nguyên vẹn genom của B. longum.Vùng hình tròn biểu diễn các
rARN operon, hình vuông là vùng gen của prophage, tam giác biểu diễn vị
trí của 3 vùng gen giống nhau của B. longum, hình chữ nhật là vùng gen
plasmid tích hợp.
1.3.4. Vai trò của B. longum [9], [11], [24], [26] , [15], [33], [35].
B. longum là một loại vi khuẩn rất cần thiết với cơ thể con người, thường gặp
ở ruột và âm đạo do nó có vai trò quan trọng trong việc giữ cho hệ tiêu hóa và hệ
miễn dịch con người khỏe mạnh. B. longum đặc biệt quan trọng đối với trẻ sơ sinh
do nó giúp tăng cường hệ miễn dịch của trẻ sơ sinh. B. longum có nhiều ở trong hệ
tiêu hóa của trẻ sơ sinh và chiếm ưu thế hơn ở trẻ bú mẹ so với trẻ bú bình. Một
điều dễ thấy là trẻ bú mẹ ít bị tiêu chảy và dị ứng hơn so với trẻ bú bình. Ở người
lớn, B. longum giữ cho hệ thống miễn dịch khỏe mạnh, hỗ trợ cân bằng vi khuẩn
đường ruột và có thể ngăn ngừa ung thư như ung thư ruột kết. B. longum sản sinh
acid lactic, do vậy làm giảm nguy cơ viêm âm đạo.
Một nghiên cứu liên quan đến giảm cân, béo phì và táo bón chỉ ra rằng những

người sử dụng B. longum đạt được kết quả giảm cân và cải thiện táo bón tốt hơn so
với những người dùng thuốc nhuận tràng [11].
Một nghiên cứu khác hiện được thực hiện tại Nhật Bản nhằm xác định liệu B.
longum có thể được sử dụng như là vector chuyển gen để điều trị ung thư hay
không. Tiến hành thực nghiệm trên chuột cho thấy B. longum có thể xâm nhập vào
khối u và tích lũy trong khối u. Đây là một nghiên cứu rất tích cực và hy vọng nó sẽ
giúp cho các nhà nghiên cứu tìm ra cách mới để đưa thuốc trực tiếp vào khối u [15].
Do có vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe con người nên B. longum được
sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm thuốc, thực phẩm chức năng, sữa
10

1.3.5. Phƣơng pháp kiểm nghiệm B. longum trong chế phẩm probiotics
1.3.5.1. Phương pháp định lượng vi sinh vật trong chế phẩm [14], [19], [21].
a. Phương pháp đếm trên đĩa thạch
Phương pháp đếm trên đĩa thạch được sử dụng nhiều nhất để định lượng B.
longum trong chế phẩm Probiotics do có độ chính xác cao, đơn giản, dễ thực hiện ở
quy mô phòng thí nghiệm, đồng thời có thể định lượng riêng được B. longum trong
hỗn hợp. Vi sinh vật trong chế phẩm ban đầu được pha loãng đến nồng độ thích
hợp, sau đó được cấy trộn vào môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri và nuôi cấy ở
nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau thời gian nuôi cấy, đếm số khuẩn lạc và tính số
lượng vi sinh vật có trong chế phẩm ban đầu
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tốn thời gian nuôi cấy, khó
khăn trong việc lựa chọn môi trường đặc hiệu cho vi sinh vật cần định lượng trong
hỗn hợp gồm nhiều vi sinh vật khác nhau.
b. Định lượng bằng phương pháp real-time PCR
Real-time PCR là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác
nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng
khi quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng
số lượng DNA ngay cả khi phản ứng đang xảy ra. Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu
kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất

định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỉ lệ thuận với mỗi chu kỳ
khuếch đại thành công của phản ứng real-time PCR. Như vậy bằng cách ghi nhận
lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng
PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên
của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu
Trong phản ứng real-time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát
huỳnh quang bao gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR
Green, EvaGreen ) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX ).
Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA. Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của
các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với
DNA mạch đôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này
11

và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn (so với trạng thái tự do trong dung
dịch). Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích
nên chi phí sẽ thấp; nhưng độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ
thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân
tích đường cong nóng chảy (Melting curve analysis).
Tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, TAMRA,
Texas Red, Cy3, Cy5… được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau như mẫu dò
lai, mẫu dò thủy giải, mẫu dò dạng kẹp tóc.
Khi sử dụng với các mẫu dò khác nhau, cường độ tín hiệu huỳnh quang đều tỉ
lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng. Các tín
hiệu huỳnh quang phát ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt real-time PCR thu
nhận và xử lý. Khi cường độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu
huỳnh quang nền (base line) của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và
người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – Ct, Cycle
Threshhold) để so sánh với một đường cong chuẩn (standard curve) đã biết để suy
ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu. Đường cong chuẩn
được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết

trước nồng độ.
c. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-fluorescent insitu
hybridization).
FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của vi sinh vật cần định
lượng bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với các trình
tự đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần phá vỡ tế bào)
Quy trình thực hiện bao gồm các bước:
- Chuẩn bị mẫu và đầu đò
- Cố định mẫu
- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào
- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai
- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp)
12

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả bằng kính hiển vi quét laze đồng tiêu
hoặc kính hiển vi gắn thêm bộ lọc dải hẹp nhiều tần cùng với một máy ảnh
và phần mềm xử lí hình ảnh.
Các đầu dò thường được sử dụng là các oligonucleotide rRNA 16S để đảm
bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất trong quá trình lai.
Đầu dò thường được đánh dấu bằng cách gắn trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang lên
đầu dò hoặc kết hợp đầu dò với một số chất chỉ thị như Digoxygenin, sau đó chúng
sẽ được dò tìm thông qua một chất phản huỳnh quang
Ưu điểm của 2 phương pháp Realtime PCR và FISH là nhanh, cho độ chính
xác cao. Tuy nhiên nhược điểm là đòi hỏi đầu tư thiết bị đắt tiền, yêu cầu trình độ
kỹ thuật cao và không phân biệt được vi khuẩn sống hay vi khuẩn chết.
1.3.5.2. Định danh
a. Định danh kiểu hình
Dựa theo khóa phân loại được công nhận quốc tế: Dựa vào đặc điểm hình thái,
phản ứng sinh hóa. Để tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa thì phương pháp sử

dụng phổ biến hiện nay là sử dụng các kit sinh hóa có sẵn (Ví dụ Api kit của hãng
BioMerieux-Pháp). Để định danh vi sinh vật thuộc chi Bifidobacterium có thể sử
dụng kit API 20A hoặc Rapid ID 32A.
b. Định danh kiểu gen.
Để định danh đến loài, kỹ thuật phổ biến được sử dụng hiện nay là kỹ thuật
nhân gen và giải trình tự
Kỹ thuật này bao gồm các bước:
Tách chiết DNA của vi sinh vật nghiên cứu: Thành tế bào vi sinh vật được
phá vỡ nhờ lysozyme và các chất tẩy rửa mạnh như SDS-tris-hydroclorid
giúp giải phóng toàn bộ DNA của vi sinh vật. Protein và RNA được tách
khỏi DNA nhờ các enzym RNAse, protease và isopropanol. Cuối cùng DNA
được tủa bằng ethanol tuyệt đối.
Tiến hành phản ứng PCR: Với việc sử dụng DNA polymerase và các
oligonucleotid tổng hợp nhân tạo, một đoạn DNA dùng làm khuôn được
nhân lên nhanh chóng với số bản sao gấp hàng tỉ lần mà không cần đến
13

nhiều tế bào vi sinh vật. Nhờ phản ứng này, một đoạn gen bất kì sẽ được
khuếch đại khi biết trình tự của hai điểm từ đầu 5’ đến đầu 3’ của sợi bổ
sung và nhờ có enzym DNA polymerase mà DNA khuôn được tổng hợp khi
đã có sẵn dNTP.
Kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose. Phân tích trình tự 16S
rDNA theo phương pháp Sanger. Cuối cùng, chuỗi trình tự này được so
sánh với tất cả các chuỗi nucleotid 16S rDNA đã được công bố trên ngân
hàng gen quốc tế và từ đó đưa ra kết luận chính xác tên của vi sinh vật.
Phương pháp này có độ chính xác rất cao. Cho đến nay, các chuyên gia phân
loại vi sinh vật trên thế giới đều cho rằng phương pháp tốt nhất để định danh vi sinh
vật và thành lập cây phát sinh chủng là dựa trên trình tự rDNA kết hợp với phương
pháp phân loại kinh điển. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị
rất lớn mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị được.

- Kỹ thuật nhân gen PCR (Polymerase Chain Reaction) [8].
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại
và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử.
PCR dựa trên cơ sở phản ứng kéo dài primer nhờ enzym Taq DNA
polymerase để khuếch đại in vitro các acid nucleic đặc hiệu trong thiết bị điều nhiệt
tuần hoàn (thermocycler) hay còn gọi là máy PCR. PCR cho phép khuếch đại theo
hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn DNA có chiều dài từ 200- 3000 bp. Đoạn
DNA được khuếch đại (DNA đích) được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu
(oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Taq DNA polymerase là một loại enzym DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi
khuẩn chịu nhiệt cao Thermus aquaticus), được dùng để tổng hợp các đoạn DNA
mới trong môi trường có bốn loại deoxyribonucleotid (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết
hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn DNA mới hình thành lại được sử dụng làm khuôn
mẫu. Sau nhiều chu kì, số lượng đoạn DNA nói trên được nhân lên gấp nhiều lần,
nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng
14

Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen được trình bày tổng quát trong Hình
1.3 và Hình 1.4

Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase
Hình 1.4.

15

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong Hình 1.3 và Hình 1.4. Theo đó, từ
chu kỳ thứ hai, Taq polymerase (Taq pol) bắt đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài
xác định. Các primer thường là một oligonucleotid tổng hợp, có khoảng 10 - 20
nucleotid hoặc hơn. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng

hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ
thuật điện di. Trong kỹ thuật PCR người ta thường tiến hành khoảng 25 - 35 chu kỳ.
Mỗi chu kỳ PCR bao gồm ba bước có nhiệt độ khác nhau (xem hình vẽ minh hoạ):
Bước 1 là biến tính DNA (ở 90- 95
o
C), có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn
xoắn kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn (ở 40-65
o
C). Bước 3
là kéo dài chuỗi theo mồi, (ở nhiệt độ 70-72
o
C)

chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp
gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ
sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp
theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản
sợi khuôn trong vài giờ.
- Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên lý điện di: các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường
trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực
dương. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ
yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng. Phân tử có kích thước nhỏ
sẽ di chuyển nhanh còn phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm. Sử dụng
thang chuẩn DNA với kích thước đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước
tương đối của DNA mẫu.
Tiến hành: chuẩn bị gel agarose X%, tiến hành tra mẫu gồm 10 l mẫu DNA
được trộn với 2 l đệm mầu (có chứa: glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol
xanh, xylene cyanol) và tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế ổn
định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2

cm thì dừng lại. Nhuộm bản gel trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ
50 g/ l trong 15-30 phút. Sau đó, gel được lấy ra và soi dưới ánh sáng tử ngoại
của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu
sáng trên nền gel màu đen.