Phương pháp định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô học

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017

PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỨC ĐỘ PHẢN ỨNG
MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG TRÊN TIÊU BẢN MÔ HỌC
Tưởng Phi Vương*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh
quang tiêu bản mô da người trên cơ sở kỹ thuật số phân tích ảnh chụp tiêu bản. Phương pháp:
tính tỷ lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang và tính cường độ sáng của từng ảnh thu
bằng phần mềm ImageJ. Sử dụng test Spearson để tính tỷ số tương quan r các cặp số liệu.
Kết quả: cả hai phương pháp đánh giá định lượng mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang
đều thể hiện tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng, dễ phổ biến và thống nhất cao, sử dụng
công cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí, cũng như cho phép xử lý số liệu nghiên cứu bằng các
thuật toán thống kê.
* Từ khóa: Mô da; Miễn dịch huỳnh quang; Desmoglein-1.

Quantitative-Analyzing Results of Immunofluoresence Stain on
Histological Slide
Summary
Objectives: To create and estimate effectiveness of quantitative methods for estimating
immunofluorescence reactions based on digital analysis of skin tissue slide photo from
confocal laser scanning microscopy. Methods: Immunofluorescence reactions on cryostat
sectioned and paraffin-slide of human skin were carried out with anti- desmoglein-1 antibody.
The total of all immunofluorescence positive areas and mean of grey level in the digital photo
were calculated automatically by using ImageJ PC software. Spearson test was used to analyze the
correlation of this result. Results: Both quantitative methods in evaluation of immunofluorescence
results are simple and easy to use with high level of validation and free image processing
software. Beside, the immunofluorescence evaluation method based on photo grey level could help
investigators more choices when statistically analyzing results of immunofluorescence reactions.
* Keywords: Immunofluorescence quantitative methods; Skin tissue; Desmoglein-1.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với những thành tựu của khoa
học kỹ thuật trong lĩnh vực y tế, sự ra đời
của kính hiển vi đồng tiêu quét laser nhận
được sự quan tâm của các nhà nghiên

cứu, là công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên
cứu mô bệnh học bằng phương pháp miễn
dịch huỳnh quang. Kết quả phản ứng miễn
dịch huỳnh quang được biểu hiện trên ảnh
chụp tiêu bản bằng kính hiển vi đồng tiêu
quét laser với độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

* Viện 69, Bộ Tư Lệnh Bảo vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh
Người phản hồi (Corresponding): Tưởng Phi Vương ()
Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 26/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 30/08/2017

80


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Tuy nhiên, việc đánh giá mức độ phản ứng
miễn dịch huỳnh quang trên những ảnh này
mới chỉ mang tính định tính (có - không,
yếu - mạnh) và chưa thực sự khách quan.
Điều này cho thấy cần phải xây dựng
phương pháp đánh giá định lượng mức
độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang để
làm tăng tính chính xác và khách quan,

tin cậy của kết quả nghiên cứu. Phần mềm
phân tích ảnh kỹ thuật số miễn phí chuyên
dụng cho nghiên cứu y sinh ImageJ của
Viện Y học Quốc gia Mỹ cho phép chúng
tôi thực hiện ý tưởng nghiên cứu này.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1. Đối tƣợng nghiên cứu.
Mẫu mô da người bình thường kích
thước 1 x 1 cm, cố định bằng dung dịch
formaldehyd 4% trong 24 giờ ở nhiệt độ
phòng.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.
* Chuẩn bị mẫu mô da:
- Pha mẫu mô da thành hai phần, một
phần để cắt lạnh và phần còn lại đúc
paraphin.
- Tiến hành cắt tiêu bản (cắt lạnh và
cắt từ block paraphin) dày 4 µm (12 tiêu
bản mỗi loại), gắn lên lam kính bằng dung
dịch dán albumin pha glycerin.
- Tiêu bản cắt từ block paraphin được
tẩy paraphin, sau đó bộc lộ kháng nguyên
bằng lò vi sóng (trong đệm citrate 10 mM,
pH = 6, điện áp lò vi sóng 600 W, thời gian
30 phút).

* Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cả
hai loại tiêu bản theo quy trình sau:
- Rửa tiêu bản nhanh bằng đệm PBS.

- Khử huỳnh quang không đặc hiệu bằng
NaBH 4 0,01% trong đệm PBS, 3 lần,
5 phút/lần.
- Rửa tiêu bản bằng đệm PBS, 3 lần,
2 phút/lần.
- Bão hòa với huyết thanh dê 10% trong
PBS (30 phút, nhiệt độ phòng).
- Ủ với kháng thể trực tiếp (kháng
Desmoglein) đ pha lo ng 50 lần (60 phút,
nhiệt độ phòng).
- Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,
2 phút/lần.
- Ủ với kháng thể gián tiếp gắn huỳnh
quang (AF488) nồng độ 1:200 trong hộp
kín, đậy bằng giấy bạc (60 phút, nhiệt độ
phòng).
- Rửa nhanh bằng BSA/PBS 0,1%, 3 lần,
2 phút/lần.
- Rửa nhanh bằng PBS, 2 lần, 2 phút/lần.
- Gắn glyxerol (glycerin: PBS = 9:1 theo
tỷ lệ thể tích).
- Để khô 10 phút ở nhiệt độ phòng trong
hộp kín tránh ánh áng.
- Soi tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh
quang bằng kính LSM 700 (Carl Zeiss,
Đức) với nguồn lade Ex.488 nm, cường
độ 5%, master gain 600, độ phóng đại
630 lần, pihole 56 µm. Chụp ảnh ở cùng
một chế độ: ảnh 8 bít, độ phân giải 512 x
512 pixels tại vị trí vi trường có phản ứng

miễn dịch huỳnh quang rộng nhất. Lưu ảnh
thu được dưới dạng *jpg.
81


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
* Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch
huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ
dựa trên tính toán diện tích vùng có tín
hiệu huỳnh quang (hình 1):

Hình 2: Tính cường độ sáng trung bình
của ảnh tiêu bản bằng phần mềm ImageJ.
Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh.

Hình 1: Tính diện tích vùng có tín hiệu
huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ.
Bước 1: Nhấn open để mở từng ảnh.
Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn
RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green.
Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn
brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40,
xong nhấn apply.
Bước 4: Nhấn image: chọn adjust, chọn
threshold, chọn dark background, red nhấn
set: chọn lower threshold level: 40.
Bước 5: Nhấn analyze: chọn set
measurements, chọn area, chọn area
fraction, chọn limit to threshold.
Bước 6: Nhấn analyze: chọn measure.

Trên màn hình sẽ hiển thị bảng kết quả
* Đánh giá kết quả phản ứng miễn dịch
huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ
dựa trên tính toán cường độ sáng của ảnh
tiêu bản (hình 2):
82

Bước 2: Nhấn image: chọn type, chọn
RGB stack, trên ảnh mở chọn ảnh green.
Bước 3: Nhấn image: chọn adjust, chọn
brightness/contrast, lọc bỏ grey level < 40,
xong nhấn apply.
Bước 4: Nhấn analyze: chọn histogram,
trên màn hình sẽ hiện ra đồ thị histogram
với thông số mean phía dưới.
Sau khi thu được kết quả tính diện tích
và cường độ sáng trung bình của ảnh,
tiến hành lập bảng 2 x 2 cho mỗi nhóm
(nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu bản
paraphin) như sau:
Mẫu

Tỷ lệ
diện tích

Cƣờng độ sáng
của ảnh

1
…

* Xử lý thống kê:
Sử dụng test Spearson để tính tỷ số
tương quan r kết quả tính diện tích và tính
cường độ sáng của ảnh.


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

b

c

d

Hình 3: Kết quả bộc lộ kháng nguyên desmoglein trên tiêu bản cắt lạnh (a, c) và
tiêu bản paraphin (b, d). Nhuộm miễn dịch huỳnh quang gian tiếp với kháng thể
gắn huỳnh quang AF488.
(Hình a, b: x100; Hình c, d: x630).
Dấu ấn kháng nguyên desmoglein của
liên kết desmosom trên tiêu bản cắt lạnh
và tiêu bản paraphin đều cho kết quả
dương tính. Hình ảnh dấu ấn kháng
nguyên phát hiện thấy ở ranh giới giữa
các tế bào (vùng liên kết giữa hai tế bào
cạnh nhau bằng liên kết desmosome).
Tập hợp các dấu ấn kháng nguyên này
tạo thành dạng mạng lưới đặc trưng.

Dấu ấn kháng nguyên được bộc lộ ở
tất cả các lớp trên thượng bì nhưng với
cường độ mạnh nhất tại vị trí giữa các
tế bào lớp gai. Trên màng đáy không
thấy xuất hiện dấu ấn kháng nguyên
desmoglein-1. Trong khi giữa các lá vảy
sừng vẫn xuất hiện những dấu ấn kháng
nguyên này.
83


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Sử dụng phần mềm ImageJ để tính tỷ
lệ diện tích vùng có tín hiệu huỳnh quang
và cường độ sáng đối với mỗi ảnh chụp
của nhóm tiêu bản cắt lạnh và nhóm tiêu
bản paraphin rồi lập đồ thị tương quan
giữa kết quả như sau:

Có mối tương quan tuyến tính (r ≈ 1)
giữa kết quả tính tỷ lệ diện tích huỳnh
quang và cường độ sáng tương ứng
của ảnh tiêu bản cắt lạnh cũng như tiêu
bản đúc paraphin với độ tin cậy cao
(p < 0,00001). Nói cách khác, kết quả thu
được từ hai phương pháp đánh giá mức
độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang này
tương đồng nhau.
BÀN LUẬN

Đồ thị 1: Mối tương quan giữa kết quả tính
tỷ lệ diện tích huỳnh quang và cường độ
sáng của ảnh tiêu bản cắt lạnh.
3.5
y = 1.0527x - 0.34

Tỉ lệ diện tích

3

R2 = 0.9909

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0

1

2

3

4

Cường độ sáng trung bình

Đồ thị 2: Mối tương quan giữa kết quả
tính tỷ lệ diện tích huỳnh quang và
cường độ sáng trung bình của ảnh
tiêu bản đúc paraphin.
84

Phương pháp đánh giá phản ứng miễn
dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô dựa
trên tính toán diện tích vùng có tín hiệu
huỳnh quang bằng phần mềm ImageJ đ
được nhiều nghiên cứu sử dụng như:
trong đánh giá diện tích vùng cơ tim bị tổn
thương ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim [3]
hay nghiên cứu đánh giá mức độ xơ hóa
gan bằng cách tính diện tích vùng xơ sau
khi sử dụng các thuốc nhuộm collagen [1].
Cũng trên cơ sở nguyên tắc tính diện tích
của các nghiên cứu này, chúng tôi vận
dụng để tính diện tích vùng nhuộm miễn
dịch huỳnh quang trên tiêu bản mô, từ đó
gián tiếp đánh giá mức độ phản ứng miễn
dịch huỳnh quang. Phương pháp này được
chọn để đối chứng cho đánh giá phản
ứng miễn dịch huỳnh quang mà chúng tôi
nghiên cứu xây dựng.
Phương pháp đánh giá phản ứng miễn
dịch huỳnh quang thông qua chỉ số cường
độ sáng ảnh, cho đến nay chưa thấy
nghiên cứu nào sử dụng. Ý tưởng sử
dụng cường độ sáng của ảnh kỹ thuật số

xuất phát từ đặc điểm của ảnh tiêu bản
nhuộm huỳnh quang chỉ hiển thị vùng tín
hiệu huỳnh quang trên nền tối của tiêu bản.
Do đó, cường độ sáng của ảnh thu được
phản ánh trực tiếp cường độ huỳnh quang


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
trên vùng vi trường của tiêu bản đó. Giá trị
trung bình của cường độ sáng ảnh khác
nhau (số lượng ảnh cần phải tính toán đối
với từng nghiên cứu cụ thể để có tính đại
diện cao) của cùng một tiêu bản sẽ “đại diện”
cho cường độ huỳnh quang của tiêu bản
đó. Như vậy, phương pháp này cho phép
định lượng mức độ phản ứng miễn dịch
huỳnh quang của tiêu bản mô học. Từ đó
tạo thuận lợi để xử lý thống kê kết quả
thu được bằng thuật toán thống kê với
biến liên tục và cho nhiều thông tin hơn
các phương pháp thống kê với biến không
liên tục (biến thứ hạng, danh mục).
Bên cạnh đó, một vấn đề đặt ra đối với
nghiên cứu mô học nói chung đều có số
lượng mẫu rất hạn chế. Do vậy, chỉ có thể
sử dụng được phương pháp thống kê cho
biến thứ hạng (test U Mann - Whitney) hoặc
biến danh mục (test Fisher). Trong trường

hợp này, kết quả định lượng mức độ

phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoàn
toàn có thể chuyển đổi thành bán định
lượng (thứ hạng) hoặc định tính (danh mục)
dựa trên đặc điểm của ảnh kỹ thuật số.
Chuyển đổi thành kết quả bán định lượng
có thể dễ dàng thực hiện khi áp dụng test
U Mann - Whitney. Dưới đây miêu tả cách
thức chuyển đổi kết quả nhuộm miễn dịch
huỳnh quang từ định lượng cường độ sáng
của ảnh sang định tính cường độ sáng
của ảnh.
Do ảnh thu được dưới dạng 8 bit nên
cường độ sáng trung bình cũng dao động
trong khoảng 0 (đen) đến 255 đơn vị (trắng)
trong histogram của ảnh. Mặt khác, mắt
người chỉ có khả năng cảm nhận được 24
khác biệt (tương đương 255/24 ≈ 10 đơn
vị cường độ sáng) trên histogram của ảnh
(hình 4).

Hình 4: 24 mức độ sáng mà mắt người có thể cảm nhận được sự khác nhau.
Trên cơ sở những suy luận logic này, có thể quy ước định tính mức độ phản ứng
miễn dịch huỳnh quang.
Bảng 1: Quy ước định tính mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên cơ sở
cường độ sáng của ảnh chụp tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang.
Cƣờng độ sáng của ảnh tiêu bản nhuộm miễn dịch
huỳnh quang

Định tính mức độ phản ứng miễn
dịch huỳnh quang

Từ 0 - < 10 đơn vị cường độ sáng

Âm tính

Từ 10 - < 20 đơn vị cường độ sáng

Yếu

Từ 20 - < 30 đơn vị cường độ sáng

Trung bình

Từ 30 - < 40 đơn vị cường độ sáng

Mạnh

≥ 40

Rất mạnh

85


TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017
Hoặc có thể lập bảng 2 x 2 định tính
phản ứng miễn dịch huỳnh quang.
Bảng 2: Quy ước xác định dương-âm
tính của phản ứng miễn dịch huỳnh quang
trên cơ sở cường độ sáng của ảnh chụp

tiêu bản nhuộm miễn dịch huỳnh quang.
Số mẫu dƣơng
tính (> 10 đơn vị
cƣờng độ sáng)

Số mẫu âm tính
Tổng
(< 10 đơn vị
số
cƣờng độ sáng)

Nhóm 1
Nhóm 2
Tổng số

Sau đó sử dụng test Fisher để kiểm
chứng, so sánh sự khác nhau trong kết
quả phản ứng miễn dịch huỳnh quang thu
được giữa hai nhóm nghiên cứu.
Như vậy, hai phương pháp đánh giá
mức độ phản ứng miễn dịch huỳnh quang
đều cho kết quả tương đồng, có thể lựa
chọn áp dụng một trong hai phương pháp
này để đánh giá mức độ phản ứng miễn
dịch huỳnh quang. Ưu điểm của chúng đều
mang tính định lượng, đơn giản, dễ áp
dụng, phổ biến với tính thống nhất cao,
sử dụng công cụ phần mềm hoàn toàn
miễn phí. Phương pháp tính cường độ
sáng không những giúp các nhà nghiên

cứu có thêm lựa chọn thuật toán thống kê
(có thể dùng cả test với biến liên tục, biến
thứ hạng và biến danh mục), bảo đảm sự
linh hoạt và tính tin cậy trong xử lý kết
quả nghiên cứu.

86

KẾT LUẬN
Hai phương pháp đánh giá định lượng
phản ứng miễn dịch huỳnh quang trên cơ
sở phân tích kỹ thuật số ảnh tiêu bản
(tính tỷ lệ diện tích vùng xảy ra phản ứng
miễn dịch huỳnh quang và tính cường độ
sáng của ảnh) bằng phần mềm ImageJ
chúng tôi nghiên cứu xây dựng thể hiện
tính chính xác, đơn giản, dễ áp dụng,
phổ biến với tính thống nhất cao, sử dụng
công cụ phần mềm hoàn toàn miễn phí.
Bên cạnh đó, còn giúp các nhà nghiên
cứu có thêm nhiều lựa chọn thuật toán
thống kê (có thể dùng cả test với biến liên
tục, biến thứ hạng và biến danh mục),
bảo đảm linh hoạt và tin cậy trong xử lý
kết quả nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Amin Ali H, Mohamed A.El-Missiry,
Fatna M. Elhusseini, Thuraya M.Mutawi.
Assessment of hepatic fibrosis by image
analysis software in relation to physiological

markers. International Journal of Advanced
Reseach. 2016, 4 (4), pp.1676-1688.
2. Carey J. Light and Photography:
Exposure and Tonal Range Considerations,
/>3. Olivera L.F.L, Mejia J, Carvalho E.E.V
et al. Myocardial infarction area quantification
using high-resolution SPECT images in rats.
Arq Bras Cardiol. 2013, 101 (1), pp.59-67.