Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT QUANG PHỔ HẤP THU NGUYÊN TỬ
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHÌ TRONG MÁU
Đinh Văn Thoại*, Lê Thị Kim Thơ*, Phan Bích Hà*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Hiện nay ở Việt Nam, nhiễm độc chì là một trong 28 bệnh nghề nghiệp được bảo hiểm. Rất
nhiều người lao động hàng ngày trực tiếp làm việc trong môi trường có chì, vì vậy tình trạng nhiễm độc chì của
công nhân tiếp xúc với chì cần phải được kiểm soát chặt chẽ. Ngày 10 tháng 5 năm 2012, Bộ trưởng Bộ Y tế ký
quyết định số 1548/QĐ – BYT về việc ban hành Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ngộ độc chì, trong đó quy định
xét nghiệm chì máu là chỉ tiêu bắt buộc để chẩn đoán xác định.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình xác định hàm lượng chì trong máu bằng phương pháp quang
phổ hấp thu nguyên tử.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát xử lý mẫu máu bằng kỹ thuật vô cơ hóa ướt – xử lý ướt. Sau đó, định
lượng chì bằng phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử kỹ thuật lò graphite (GF‐AAS).
Kết quả nghiên cứu: Chúng tôi đã hoàn thành quy trình xét nghiệm hàm lượng chì trong máu bằng
phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử ‐ kỹ thuật lò graphite (GF‐AAS) với giới hạn phát hiện (LOD) là
5,13 g/dL, giới hạn định lượng (LOQ) là 9,54 g/dL, hiệu suất thu hồi đạt từ 94%, độ lặp lại có hệ số biến thiên
CV<1%, độ tái lập nội bộ có hệ số biến thiên CV<5% và giá trị độ không đảm bảo đo là 14,6%.
Kết luận: Phương pháp quang phổ hấp thu nguyên tử kỹ thuật lò graphite có độ nhạy, độ chính xác cao, xác
định được hàm lượng chì trong máu.
Từ khóa: Chì, quang phổ hấp thu nguyên tử, máu.
ABSTRACT
APPLICATION OF ATOMIC ABSORPTION SPECTROSCOPY (AAS)
TO QUANTITATE LEAD IN BLOOD
Dinh Van Thoai, Le Thi Kim Tho, Phan Bich Ha
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 193 – 196
Background: Currently in Vietnam, lead poisoning is one of 28 occupational diseases are covered. Many
people working in environments that contain lead, so lead poisoning of workers exposed to lead must be tightly
controlled. May 10th, 2012, Health Minister signed Decision No. 1548/QD ‐ BYT promulgating Guidelines for
the diagnosis and treatment of lead poisoning, in which, blood lead test is required to confirm the diagnosis.
Objectives: Establish a procedure for quantification of lead in blood by atomic absorption spectroscopy.
Methods: Sample preparation using wet chemical digestions technique. Using atomic absorption
spectroscopy techniques graphite furnace (GF‐AAS) to quantify lead in blood.
Result: We completed the process of testing the lead content in the blood by means of atomic absorption
spectrum ‐ graphite furnace technique (GF‐AAS) with detection limits (LOD) 5.13 g/dL, the limit quantification
(LOQ) 9.54g/dL, the recovery reached 94%, repeatability with a coefficient of variation CV<1%, internal
reproducibility with a coefficient of variation CV<5% and the value of measurement uncertainty is 14.6%.
Conclusion: Atomic absorption spectroscopy techniques graphite furnace is suitable to quantify lead in blood.
*
Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: Cn. Đinh Văn Thoại
192
ĐT: 0909080637 Email: * Thanh tra Bộ
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
Nghiên cứu Y học
Keywords: Lead, AAS, blood.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chì là một trong những kim loại nặng có ảnh
hưởng lớn tới ô nhiễm môi trường, có khả năng
tích lũy lâu dài trong cơ thể, gây nhiễm độc cho
người, động vật thủy sinh qua chuỗi thực phẩm.
Chì trong tự nhiên thường tồn tại trong các loại
quặng: PbS, PbCO3, PbSO4. Trong sản xuất, chì
thường được sử dụng ở dạng vô cơ, dùng trong
chế tạo ắc quy, sản xuất các hợp chất của chì,
làm chất màu pha sơn, men sứ, keo gắn.(4, 5)
Ngoài ra, một số ngành còn sử dụng chì hữu cơ,
chì tetraetyl dùng làm chất chống kích nổ trong
xăng, chì stearat dùng trong công nghiệp chất
dẻo. Chì phát tán vào khí quyển chủ yếu do hoạt
động của con người (ngành sản suất năng lượng,
luyện kim, giao thông), nồng độ trung bình của
chì trong khí quyển hiện nay lên tới 3,7 ng/m3,
trong khí quyển các đô thị nồng độ chì còn cao
hơn, từ 0,5 – 10 μg/m3. Chì có thể xâm nhập cơ
thể qua đường hô hấp (do hơi, khói, bụi chì); qua
đường miệng (từ thực phẩm, nước uống, thuốc
lá); ngoài ra chì hữu cơ có thể hấp thụ qua da.(4)
Do đó khả năng nhiễm độc chì là rất lớn, đặc
biệt là trong các nhà máy sản xuất có sử dụng
nguyên liệu chì. Ngày 10 tháng 5 năm 2012, Bộ
trưởng Bộ Y tế ký quyết định số 1548/QĐ – BYT
về việc ban hành Hướng dẫn chẩn đoán và điều
trị ngộ độc chì, trong đó quy định xét nghiệm chì
máu là chỉ tiêu bắt buộc để chẩn đoán xác định.
Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định hàm
lượng chì có độ chính xác cao trong máu là rất
cần thiết để chẩn đoán, dự phòng và điều trị sự
nhiễm độc chì.(2)
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu thử
Mẫu máu toàn phần của nhân viên khoa Xét
nghiệm, Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh.
Hóa chất
Nitric acid 65% (Merck 1.00456.1000),
Perchloric acid 70% (Merck 1.00514.1000)
Hydrochloric acid 37% (Merck 1.00317.1000),
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
Hydrogen peroxide 30% (Merck 1.07209.1000),
dung dịch HNO3 1%, dung dịch HCl 0,1N.
Chất chuẩn
Chuẩn gốc Pb(NO3)2, 100000 g/dL (Merck
1.19776.0500)
Từ chuẩn gốc pha thành các chuẩn trung
gian và chuẩn làm việc bằng dung dịch HNO3
1%. Dựng đường chuẩn trong khoảng 0 ÷
2g/dL.
Dụng cụ
Bình định mức: 10 mL, 20 mL, 500 mL.
Micropipet: 0 – 50 μL, 0 – 200 μL, 100 – 1000
μL. Pipet 1 mL, 5 mL, 10 mL.
Erlen chịu nhiệt: 50 mL.
Bếp gia nhiệt (hotplate).
Thiết bị
Hệ thống máy quang phổ hấp thu nguyên tử
Perkin Elmer AA800. Hệ thống AA800 dùng loại
lò graphite gia nhiệt theo chiều ngang THGA
(Transversely Heated Graphite Atomizer), có
chế độ bổ chính nền tự động bằng hiệu ứng
Zeeman.
Xử lý mẫu
Sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ướt – xử lý
ướt(1, 7, 8, 10, 11).
Định lượng
Chúng tôi sử dụng phương pháp quang phổ
hấp thu nguyên tử kỹ thuật lò graphite (GF‐
AAS) để xác định hàm lượng chì. Phương pháp
này có độ nhạy, độ chính xác cao, xác định được
hàm lượng chì trong máu(1, 7).
Xác định các thông số của phương pháp
Tiến hành khảo sát các thông số tối ưu của
quá trình vô cơ hóa mẫu cũng như các thông số
của GF‐AAS. Tiến hành dựng đường chuẩn
trong khoảng 0÷2 g/dL để khảo sát độ tuyến
tính. Trong điều kiện nghiên cứu, chúng tôi khảo
sát độ đúng thông qua xác định hiệu suất thu
hồi, tiến hành phân tích mẫu máu có thêm chuẩn
193
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
tại các nồng độ 5 g/dL, 10 g/dL, 15 g/dL. Mỗi
nồng độ được phân tích 06 lần. Khảo sát độ lặp
lại, tiến hành phân tích 06 lần mẫu máu thêm
chuẩn trong cùng một ngày thực nghiệm. Để
tính độ tái lập nội bộ phòng thí nghiệm, tiến
hành phân tích 06 lần mẫu máu thêm chuẩn bởi
nhân viên thử nghiệm khác.
Giá trị giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lượng (LOQ) được khảo sát dựa trên mẫu
trắng. Phân tích 10 lần, tính độ lệch chuẩn. LOD
= 3SD + Xtb. LOQ = 10SD + Xtb.
Độ không đảm bảo đo của phương pháp
được tính dựa trên số liệu định trị phương
pháp(6, 9).
Chúng tôi tham khảo tài liệu của hội đồng
châu Âu 2002‐657‐EC làm tiêu chí đánh giá các
thông số định trị phương pháp.(3)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
giai đoạn từ thấp đến cao) sẽ gây sai số âm, thậm
chí hiệu suất thu hồi rất thấp do các hợp chất hữu
cơ bay hơi trước khi được vô cơ hóa nên mang
theo cả nguyên tố chì. Chế độ chạy máy ảnh
hưởng quan trọng đến kết quả, nếu bước gia
nhiệt nguyên tử hóa mẫu không đủ lớn hoặc thời
gian không đủ sẽ vô cơ hóa mẫu không hoàn toàn
do đó dẫn đến sai số âm. Chất lượng graphite
tube cũng giảm nhanh theo thời gian, gây nên sai
số cho kết quả đo. Do đó, cần tuân thủ quy trình
chạy máy cũng như chế độ xử lý mẫu, đặc biệt
cần đo chuẩn thường xuyên (05 đến 10 mẫu cần
đo chuẩn một lần) trong quá trình đo mẫu để
kiểm soát kết quả tốt hơn.
Bảng 1: Các thông số cơ bản của chương trình đo chì
trên máy Perkin Elmer AA800
Bước Nhiệt độ Thời gian Thể tích Chất bổ trợ
sóng (nm) (oC)
(giây)
tiêm mẫu nền (modifier)
110
30
Xử lý mẫu
130
30
Lấy chính xác 0,5 ml máu toàn phần (sử
dụng chất chống đông EDTA) cho vào erlen chịu
nhiệt 50 mL. Thêm 0,5 ml HNO3 đậm đặc, ngâm
qua đêm. Đun trên hotplate với chế độ gia nhiệt
04 bước như sau: 100oC trong 02 giờ, 150oC trong
02 giờ, 250oC trong 04 giờ, 300oC đến khô. Để
nguội nhiệt độ phòng (có thể mẫu có màu đen).
Thêm 0,25 ml HNO3 đậm đặc và 0,25 ml HClO4
đậm đặc đun tiếp đến cạn (250oC trong 02 giờ và
300oC đến khô), giai đoạn này mẫu thường có
màu trắng, nếu mẫu còn màu, thêm vài giọt
HNO3 đậm đặc (cặn sau vô cơ hóa có màu
trắng). Cho 0,1ml H2O2 lúc còn nóng để đuổi hết
NO2. Đun đến cạn khô và hết khói trắng. Hòa
tan cặn bằng dung dịch HCl 0,1 N ở nhiệt độ
khoảng 80oC trong 10 phút, định mức 10 mL
bằng HNO3 1%. Ta được mẫu đo trên máy
quang phổ hấp thu nguyên tử.
750
20
1500
5
24500
3
Điều kiện chạy máy
Trong quá trình khảo sát, chúng tôi nhận thấy
chế độ gia nhiệt trong quá trình vô cơ hóa mẫu có
ảnh hưởng rất lớn đến kết quả phân tích, cụ thể
nếu nhiệt xử lý ban đầu cao (không tuân theo các
194
283,3
20µL
NH4H2PO4
Các thông số định trị phương pháp (kết quả
chi tiết được trình bày trong bảng 2)
Khoảng tuyến tính
Đường chuẩn chì trong khoảng 0 ÷ 2 g/dL
cho hệ số tương quan R2 = 0,997.
Độ đúng
Khảo sát độ đúng thông qua xác định hiệu
suất thu hồi mẫu máu có thêm chuẩn tại các
nồng độ 5g/dL, 10g/dL, 15g/dL. Trên khoảng
nồng độ khảo sát, hiệu suất thu hồi trong
khoảng 80‐110%.
Độ lặp lại, độ tái lập nội bộ
Để khảo sát độ lặp lại, chúng tôi tiến hành
phân tích mẫu thêm chuẩn trong cùng một ngày
kết quả độ lặp lại của phương pháp <1%. Để tính
độ tái lập nội bộ, mẫu thêm chuẩn được phân
tích bởi hai kiểm nghiệm viên, kết quả độ tái lặp
của phương pháp <5%.
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014
Nghiên cứu Y học
Qua khảo sát thực nghiệm, chúng tôi thu
được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
của phương pháp lần lượt là 5,13 g/dL và 9,54
g/dL. Với giới hạn phát hiện này, phương pháp
trên đủ độ nhạy để định lượng chì trong máu.
Tiến hành đánh giá ở các nồng độ chuẩn
thêm vào mẫu cao hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Độ không đảm bảo đo
Dựa trên số liệu định trị, với hàm lượng chì
trong máu từ 5‐15 g/dL,chúng tôi tính được độ
không đảm bảo đo của phương pháp là 14,6%
Bảng 2: Các thông số định trị phương pháp
Kết
quả
đạt
được
Hiệu
Khoản
Độ Độ tái
suất
g tuyến
lặp lập
thu
tính
lại nội bộ
hồi
0÷2
g/dL
94% 0,6% 4%
2
R=
0,997
Giới
hạn
phát
hiện
5,13
g/dL
Tiêu
2
chí
80R≥
<1% <5%
đánh 0,995 110%
giá
Giới
Độ
hạn không
định đảm
lượng bảo đo
1.
AOAC (2006). Determination of Lead, Cadmium, Cuper, Ion,
and Zinc in Food. AOAC International. Pp. 1‐4.
2.
Bộ Y tế (2012). Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị ngộ độc chì.
Quyết định số 1548/QĐ‐BYT do Bộ trưởng Bộ Y tế ký ngày 10
tháng 5 năm 2012. Tr. 2‐4.
3.
European Communities (2002). The performance of
Analytical Methods and interpretation of results (2002‐657‐
EC). Official Journal of the European Communities. Pp. 14‐16.
4.
Hoàng Văn Bính (2002). Độc Chất Học Công Nghiệp. Nhà
xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. Hà Nội. Tr. 104‐121.
5.
Lê Trung (2002). Bệnh nhiễm độc nghề nghiệp. Nhà xuất bản
Y học. Hà Nội. Tr. 92‐96.
6.
Magnusson B (2007). Nordtest handbook for calculation of
measurement uncertainty based on quality control and
method validation. The first International Proficiency Testing
Conference. Pp. 26‐30.
7.
Pascal H (2011). Brief guide to analytical methods for
measuring lead in blood. World Health Organization.
Geneva. Pp. 2‐10.
8.
Phạm Luận (1999). Giáo trình hướng dẫn về Những Vấn Đề
Cơ Sở Của Các Kỹ Thuật Xử Lý Mẫu Phân Tích. Đại học
Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Tr. 5‐10.
9.
Trần Cao Sơn (2010). Thẩm định phương pháp trong phân
tích hóa học và vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ
thuật. Hà Nội. Tr. 25‐58.
10.
Từ Vọng Nghi (1995). Nghiên cứu xác định một số nguyên tố
vi lượng trong gạo. thực phẩm khô. rau và nước thải dùng
trong nông nghiệp. Đề tài NCKH cấp Bộ. Đại học Khoa học
Tự nhiên Hà Nội. Tr. 9‐11.
11.
Viện Y Học Lao Động và Vệ Sinh Môi Trường (2002). Thường
Quy Kỹ Thuật Y Học Lao Động Vệ Sinh Môi Trường Sức
Khỏe Trường Học.Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. Tr. 426‐423.
9,54
14,6%
g/dL
≤ 10
g/dL
Các thông số định trị đều đạt tiêu chí đánh giá.
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã hoàn thành quy trình xét
nghiệm hàm lượng chì trong máu bằng phương
pháp quang phổ hấp thu nguyên tử ‐ kỹ thuật lò
graphite (GF‐AAS) với giới hạn phát hiện (LOD)
là 5,13g/dL, giới hạn định lượng (LOQ) là
9,54g/dL, hiệu suất thu hồi đạt từ 94%, độ lặp
lại <1%, độ tái lập nội bộ <5% và giá trị độ không
đảm bảo đo là 14,6%.
KIẾN NGHỊ
Ngày nhận bài báo:
Tiếp tục tiến hành nghiên cứu hoàn thiện
phương pháp xử lý mẫu để giảm bớt thời gian
xử lý vì với phương pháp hiện tại cần ít nhất 24
giờ đun liên tục.
25/5/2014
Ngày phản biện nhận xét bài báo:
1/6/2014
Ngày bài báo được đăng:
14/11/2014
Chuyên Đề Y Tế Công Cộng
195