Phân lập và thiết lập chất đối chiếu isoquercitrin

Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ISOQUERCITRIN
Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Ngọc Trái*, Hoàng Anh Việt*, Nguyễn Thị Phương Trang*, Võ Thị Bạch Huệ*

TÓM TẮT
Mục tiêu: Phân lập và xây dựng chất chuẩn isoquercitrin từ lá Trinh nữ hoàng cung (TNHC) để làm chất
đối chiếu.
Phương pháp: Isoquercitrin được chiết xuất và phân lập từ lá TNHC bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với
dung môi là cồn 70%. Sử dụng kỹ thuật sắc ký cột với chất hấp phụ silicagel được tẩm đệm pH 3-4. Độ tinh
khiết, điểm chảy của chất phân lập được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và quét nhiệt vi sai.
Cấu trúc hợp chất tinh khiết được xác định bằng các kỹ thuật phổ UV, IR, MS và NMR.
Kết quả và bàn luận: Qui trình phân lập isoquercitrin từ lá TNHC được báo cáo và độ tinh khiết của
isoquercitrin là 98,14% (tính trên nguyên trạng) được xác định bằng HPLC. Qui trình thiết lập chất đối
chiếu được thực hiện theo hướng dẫn của WHOvà ASEAN(3,5). Giá trị ấn định, độ lệch chuẩn, độ không
đảm bảo đo chuẩn được tính toán theo hướng dẫn của ISO 13528(2).Isoquercitrin đạt yêu cầu của một chất
chuẩn sử dụng trong công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng nguyên liệu TNHC và sản phẩm có nguồn
gốc từ nguyên liệu này.
Từ khóa: trinh nữ hoàng cung, flavonoid, isoquercitrin, chất đối chiếu, thiết lập, phân lập.

ABSTRACT
ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF THE REFERENCE STANDARD
FOR ISOQUERCITRINE FROM THE LEAVES OF CRINUM LATIFOLIUM L.
Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Ngoc Trac, Hoang Anh Viet, Nguyen Thi Phương Trang, Vo Thi Bach Hue

* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 150 - 156
Objectives: Isolation and establishment of the reference standard (RS) for isoquercitrine from the leaves of
Crinum latifolium L. (Amaryllidaceae).
Methods: The total flavonoid from the leaves of Crinum latifolium L. was extracted by percolation extraction

with 70% ethanol. The total extracts were separated by CC on buffer-coated sillica gel at pH 3-4. The structure of
pure compound was identified by UV, IR, MS and NMR spectrometry. Thepurity,meltingpointof isolated
compound were determined by HPLC and DSC, respectively.
Results and Conclusions: A procedure for isolation of isoquercitrine from the leave of Crinum latifolium
was reported. The content of isolated compound was 98.14% by HPLC. Establishment of the reference standard
for isoquercitrine was carried out by general guidelines of WHO and ASEAN(3,5).The standard uncertainty,
assigned value, standard deviation were calculated by ISO 13528(2). Isoquercitrine can be accepted as a RS for
quality control of materials and products containing Crinum latifolium L.
Keywords:crinum latifolium L., flavonoid, isoquercitrin, reference standard, estabishment, isolation.
thuốc trung ương và Viện kiểm nghiệm thuốc
ĐẶT VẤN ĐỀ
TpHCM vẫn chưa cung cấp isoequercitrin như
Isoquercitrin là 1 flavonoid phổ biến trong
một chất đối chiếu. Trong khi đó thuốc có
dược liệu nhưng hiện tại hệ thống kiểm
nguồn gốc từ dược liệu ngày càng được các
nghiệm thuốc quốc gia như Viện kiểm nghiệm
∗

Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM
Tác giả liên hệ: DS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0903838274

150

Email:

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

công ty dược và cả người tiêu dùng quan tâm
do những tính năng đặc biệt. Các phương
pháp phân tích như phương pháp quang phổ,
sắc ký, điện di đều cần có chất chuẩn để so
sánh và đánh giá mẫu thử. Vì vậy, việc chiết
xuất - thiết lập chất chuẩn từ dược liệu đạt yêu
cầu chuẩn quốc gia là rất cần thiết để đẩy
mạnh việc tiêu chuẩn hóa, nâng cao chất
lượng dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu.

NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
Nguyên liệu – Trang thiết bị
Lá TNHC (Crinum latifolium L.,) họ Thủy
tiên (Amaryllidaceae) thu hái tại tỉnh Bình
Định vào tháng 4/2012năm 2012, được định
danh bởi PGS. Võ Thị Bạch Huệ - Khoa Dược,
Đại học Y Dược TpHCM. Lá được rửa sạch,
phơi khô, xay đạt yêu cầu chiết xuất và bảo
quản trong túi nhựa chống ẩm trước khi thử
nghiệm, độ ẩm khoảng 12%.
Các chất phân lập bằng bằng sắc ký cột dùng
chất hấp phụ sillicagel pha thường cỡ hạt 0,040,063 mm (Merck) có tẩm đệm pH 3-4.
Độ tinh khiết được xác định bằng hệ thống
HPLC Alliance 2695-2996 và thiết bị DSC
Q20.Các phổ khối được thực hiện trên máy LCMS hiệu Micro Quattro API ESCi Multi-mode
Ionization (Micromass). Máy cộng hưởng từ hạt
nhân Bruker AM500 FTNMR Spectrometer
(Viện hóa học và Công nghệ Việt nam).Tủ đóng
ống Labconco Protector Glove Box (Viện KN
thuốc TPHCM).

Phương pháp nghiên cứu
Chiếtxuất,phânlập,tinhchế
Isoquercitrin được phân lập từ cao
polyphenol toàn phần chiết từ lá TNHC.Các
kỹ thuật được sử dụng như sắc ký cột, thay
đổi dung môi, kết tinh lại để đạt độ tinh khiết
cao nhất.
Xác định độ tinh khiết, xây dựng bộ dữ liệu
chuẩn
Chất phân lập được kiểm tra độ tinh khiết
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,

Chuyên Đề Dược Học

Nghiên cứu Y học

quét nhiệt vi sai. Bộ dữ liệu chuẩn được xây
dựng gồm: điểm chảy, phổ UV, IR, MS, 13C-NMR
và 1H-NMR.

Thiết lập và phân tích đánh giá chất chuẩn
Đóng gói, đánh giá độ đồng nhất lô và
đánh giá liên phòng thí nghiệm.Các phòng thí
nghiệm được chọn đánh giá phải đạt GLP
hoặc ISO.
Đánh giáđồng nhất lô: các lọ được lấy ngẫu
nhiên, số lọ cần là N + 1 lọ, N là tổng số lọ
đóng được. Mẫu được xác định hàm lượng bằng
phương pháp HPLC, mỗi lọ kiểm tra 2 lần.

Đánh giáđộ đồng nhất liên phòng thí
nghiệm: thành phẩm sau khi đạt yêu cầu đánh
giá đồng nhất lô thì được tiếp tục đánh giá
đồng nhất liên phòng thí nghiệm độc lập. Mẫu
được đánh giá ở 3 phòng thí nghiệm độc lập
đạt ISO/IEC 17025 hoặc GLP. Mỗi phòng thí
nghiệm sẽ nhận được 6 lọ ngẫu nhiên và qui
trình đánh giá.
Kết quả đánh giá đồng nhất được tính bằng
phương pháp thống kê phân tích phương sai
một yếu tố ANOVA.

Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo
đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm
nghiệm
Xác định giá trị tái lập của phương pháp
phân tích giữa các PTN bằng phương pháp
thống kê phân tích phương sai một yếu tố
ANOVA. Khi giá trị tái lập đạt yêu cầu, tiến
hành xác định giá trị ấn định x*(n), độ lệch
chuẩn thực s*(n), độ không đảm bảo đo và giá
trị công bố trên chứng chỉ theo hướng dẫn của
ISO 13528(2).

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Chiết xuất cao toàn phần bằng phương
pháp ngấm kiệt
Dược liệu sau khi chiết SFE được làm ẩm và
chiết ngấm kiệt với dung môi cồn 70%. Dịch
chiết cồn được loại tạp và thu hồi dung môi đến

còn 1/3 thể tích. Dịch chiết sau đó được acid hóa

151


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

bằng acid hydrocloric 1% đến pH khoảng 3 - 4.
Dịch acid được chiết với ethylacetat đến khi dịch
chiết không còn phản ứng của polyphenol. Dịch
ethyl acetat được thu hồi dung môi đến cao (cao
polyphenol).

Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc:
Tách phân đoạn từ cao polyphenol toàn
phần bằng sắc ký cột với các điều kiện: cột thủy
tinh kích thước 9 x 30 (cm), silicagel có tẩm đệm
pH 3-4, mẫu phân tích: 50 g cao polyphenol toàn
phần, dung môi khai triển: n-hexan, ether dầu
hỏa, cloroform, ethyl acetat, aceton với độ phân
cực tăng dần. Thể tích mỗi phân đoạn: 500 ml.
Thu được 10 phân đoạn được đặt tên là P1 đến
P10. Phân đoạn PL-10 (1200 mg) có thành phần
giàu isoquercitrin được thể hiện trên sắc ký lớp
mỏng. Do vậy phân đoạn này được sử dụng để
phân lập, tinh chế isoquercitrin.
Kết tinh từ phân đoạn PL-10 được hoà tan
trong cloroform, để kết tinh lại ở nhiệt độ

khoảng 25 0C trong 24 giờ. Lọc kết tinh qua phễu
thủy tinh xốp. Sau đó rửa bằng ether ethylic và
kết tinh lại trong ethyl acetat, thu được 900 mg
chất kết tinh có màu vàng, đặt tên là PL-10.
Dữ liệu phổ NMR cho kết luận PL-10 là
isoquercitrin.

Kiểm tra độ tinh khiết và nhiệt độ nóng
chảy của PL-10
Phương pháp quét nhiệt vi sai
Độ tinh khiết và nhiệt độ nóng chảy của các
chất phân lập được kiểm tra bằng thiết bị DSC
Q20. Isoquercitrincó nhiệt độ nóng chảy là 2260C
và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết là 98,51%.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)
Qui trình đã được thẩm định theo hướng
dẫn của ICH (2005), các kết quả đều nằm trong
giới hạn cho phép.
Điều kiện triển khai HPLC: cột C8; (250 x 4,6)
mm; đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 256 nm;
nhiệt độ cột: 40 0C; pha động: acetonitril-acid
phosphoric pH 3 (25: 75).
Mẫu thử: pha kết tinh trong pha động có
nồng độ 100 µg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tính phù hợp hệ thống: với điều kiện sắc ký
đã lựa chọn
Kết quả được tính qua 6 lần tiêm liên tiếp.
Hệ thống sắc ký đạt yêu cầu với độ lệch chuẩn

không quá 2%, hệ số đối xứng không quá 1,5. Độ
phân giải so với các pic tạp lân cận lớn hơn 1,5.

Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng.

Hình 2: Sắc ký đồ của isoquercitrin.

152

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

Hình 3:Sắc ký đồ xác định tạp chất của isoquecitrin

Hình 4: Phổ UV của isoquercitrin.
Kết quả: độ tinh khiết sắc ký của isoquercitrin
là 98,14% tính trên tổng diện tích pic trên chế
phẩm nguyên trạng.

Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn
Tính chất
Quan sát bằng cảm quan, isoquercitrin là
chất kết tinh màu vàng.
Điểm chảy
Xác định bằng phương pháp quét nhiệt vi sai
227,94 ± 2 0C.

Phổ UV
Pha dung dịch isoquercitrin nồng độ 100
µg/ml trong methanol. Quét phổ UV vùng bước
sóng từ 200 đến 800 nm, mẫu thử có cực đại hấp
thụ ở 255 và 355 (nm).
Phổ IR
Các dao động của isoquercitrin gồm 3219,
1662,5 và 1060,8 (cm-1).
Phổ MS
Chất kết tinh isoquercitrin có đỉnh(M+Na)+ =
(M+23)+ = 487,33 => M= 464,33.

Chuyên Đề Dược Học

Phổ NMR
Kết quả phân tích cộng hưởng từ hạt nhân
cho dữ liệu phổ trình bày trong Bảng 1 đã khẳng
định cấu trúc của PL-10 là isoquercitrin, công
thức phân tử C21H20O12 (M = 464) khi so sánh với
dữ liệu phổ của tài liệu(1).
Bảng 1: Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13CNMR (125 MHz)/DMSO của PL-10 và
isoquercitrin1H-NMR và 13C NMR (DMSO-d6, 300
MHz).
(1)

Isoquercitrin

PL-10

C

DEPT

2
3
4
5
6
7

>C=
>C=
>C=
>C=
-CH=
>C=

8

-CH=

93,5

6,38; d

93,5

6,40; d

9

10
1’
2’
3’
4’
5’

>C=
>C=
>C=
-CH=
>C=
>C=
-CH=

156,1
103,9
121,0
116,1
144,6
148,3
115,1

7,56; br
6,83; d

156,2
103,9
121,1
116,2

144,8
148,4
115,2

7,58; d
6,84; d

δC (ppm)
156,0
133,2
177,2
161,0
98,6
164,0

δH (ppm;
δC (ppm) δH (ppm;m)
m)
156,3
133,3
177,4
161,2
6,18; d
98,6
6,20; d
164,1
-

153

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học
(1)

Isoquercitrin
C

DEPT

6’
1”
2”
3”
4”
5”

-CH=
>CH>CH>CH>CH>CH-

121,5
100,8
74,1
76,5
70,0
77,5

6”

-CH2-

61,0

δC (ppm)

PL-10

δH (ppm;
δC (ppm) δH (ppm;m)
m)
7,58; d
121,5
7,57; dd
5,45; d
100,9
5,46; d
74,1
3,16; m
76,5
3,24; m
69,9
3,08; m
77,5
3,08; m
3,56; d - 3,32;
62,0
m

Đánh giáđồng nhất liên phòng thí nghiệm

Các ống chuẩn được gởi đánh giá tại
Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu,
Khoa Vật lý đo lường thuộc Viện kiểm
nghiệm thuốc TpHCM và Phòng vật lý đo
lường, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc Vĩnh
Long.
Mỗi phòng thí nghiệm nhận 6 lọ chất đối
chiếu và qui trình đánh giá.
Kết quả đánh giá từ các phòng thí
nghiệm được đánh giá bằng phân tích
ANOVA một yếu tố:

Hình 5: Cấu trúc hóa học của isoquercitrin.

Đóng gói vàđánh giáđộ đồng nhất
Đóng gói: việc đóng gói được thực hiện
trong Glove-box (môi trường khí trơ N2 99,99%,
độ ẩm tương đối 10%). Chất phân lập được đóng
trong lọ thuỷ tinh nâu, nút có lớp đệm teflon và
được bảo quản trong điều kiện nhiệt độ ổn định
2-8 0C.
Khối lượng isoquercitrin đóng trong mỗi lọ
là 5 mg. Số lọ đóng được là 100 lọ.
Đánh giáđồng nhất lô:số lọ đánh giá là

N = 100 + 1 = 11 lọ.
Bảng 2: Kết quả đánh giá đồng nhất lô.
Số thứtự Độ tinh khiết sắc Mẫu thử Độ tinh khiết sắc
mẫu

ký isoquercitrin
ký isoquercitrin
(%)
(%)
Lần 1
Lần 2
Lần 1
Lần 2
1
98,01
98,03
7
98,13
98,17
2
98,06
98,08
8
98,14
98,08
3
98,07
98,15
9
98,17
98,12
4
98,09
98,16
10

98,13
98,15
5
98,10
98,07
11
98,13
98,15
6
98,11
98,08

Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm
Dixon: không có giá trị bất thường.Phân tích
phương sai một yếu tố ANOVA: Ftn = 1,659< Ftc =
3,020.Như vậy, điều kiện đóng gói ổn định, các
lọ đồng nhất trong quá trình đóng gói.

154

Ftn=2,445≤ Flt=3,682 độ tinh khiết sắc ký
không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham
gia đánh giá.
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí
nghiệm
Độ tinh khiết sắc ký (%)
PTN1
PTN2
PTN3
98,16

98,15
98,15
98,15
98,15
98,18
98,14
98,09
98,09
98,16
98,07
98,08
98,16
98,11
98,18
98,15
98,11
98,16

Số thứ tự mẫu
1
2
3
4
5
6

Bảng 4:Kết quả xác định giá trị ấn định độ tinh khiết
sắc ký của isoquercitrin.
Chu kỳ

0

1

2

3

δ

-

0,022

0,012

0,012

x*-δ

-

98,13

98,12

98,12

x*+δ

-

98,17

98,17

98,17

Trung bình

98,14

98,15

98,15

98,15

SD

0,034

0,016

0,016

0,016

x*

98,15

98,15

98,15

98,15

s*

0,015

0,018

0,018

0,018

Theo hướng dẫn của ISO 13528, từ 18 kết
quả trên, chất đối chiếu isoquercitrin được xác
định giá trị ấn định là 98,16% với độ lệch
chuẩn 0,018, độ không đảm bảo đo là 0,005 và
giá trị công bố của chất đối chiếu isoquercitrin
có độ tinh khiết sắc ký là 98,16% tính trên chế
phẩm nguyên trạng.

Chuyên Đề Dược Học


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Nghiên cứu Y học

Hình 6: Nhiệt đồ của mẫu isoquercitrin.

Hình 7: Phổ MS của isoquercitrin.

Hình 8:Phổ1H-NMR (500 MHz)

Chuyên Đề Dược Học

155


Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014

Hình 9: Phổ 13C-NMR (125 MHz)/DMSO của isoquercitrin.

KẾT LUẬN
Chúng tôi đã xây dựng được bộ dữ liệu
chuẩn của isoquercitrin và thiết lập được 100 lọ
chất đối chiếu. Mỗi lọ chứa 5 mg isoquercitrin có
độ tinh khiết sắc ký là 98,16% theo chế phẩm
nguyên trạng.
Chất đối chiếu đang được bảo quản và theo
dõi độ ổn định theo chu kỳ 6, 9, 12, 24, 36 tháng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.

2.

3.

156

Deepralard
K
et
al.
(2009),
“Flavonoidglycosidesfromtheleavesof
Uvaria
rufawithadvancedglycationend-productsinhibitoryactivity”,
Thai J.Pharm. Sci.,33, pp.84-90.
International Organisation for Standardization 13528 (2005)Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory
comparisons.
Committee on Asean reference substances (2005), Guidelines

4.

5.

for the establishment, handling, storage and use of Asean reference
substances, Thailand, pp.2-12.
Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Thi
Phuong Trang (2011),“Isolation and identification of
isoquercitrine from the leaves of Crinum latifolium L.,

Amaryllidaceae”, Proceedingof the 7th Indochina conference
on pharmaceutical sciences, pp. 604-606.
WHO (2006), General guidelines for the establishment,
maintenance and distribution of chemical reference substances, the
WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical
Preparations met in Geneva from 16 to 20 October 2006, fortyfirst report, (WHO Technical Report Series, No. 934, Annex 3),
pp.59-82.

Ngày nhận bài báo:

10.12.2012

Ngày phản biện nhận xét bài báo: 21.12.2013
Ngày bài báo được đăng:

10.03.2014

Chuyên Đề Dược Học