luận văn thạc sĩ cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hóa luteinester

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Nha Trang - 2019



BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Mỹ Kim Vương

CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
PHA ĐẢO (RP – HPLC) XÁC ĐỊNH LUTEIN, ỨNG DỤNG
KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER
Chuyên ngành : Hoá phân tích
Mã số

: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
Người hướng dẫn 1

TS. Hoàng Thị Huệ An

Người hướng dẫn 2

TS. Trần Thị Phương Anh

Nha Trang - 2019


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Cải biến phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP – HPLC) xác định lutein, ứng dụng khảo sát
quá trình xà phòng hoá lutein ester” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi
và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho tới
thời điểm này.
Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương


Lời cảm ơn
Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa
học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè trong lớp.
Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hoàng Thị Huệ An
và TS. Trần Thị Phương Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Khoa Hoá học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ
tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô ở Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa
học, đồng thời giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các thầy cô tại Trung tâm
Thí nghiệm Thực hành Trường Đại học Nha Trang đã hỗ trợ trang thiết bị
thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn.
Đề tài này được thực hiện trong khuôn khổ dự án “Hoàn thiện quy trình
công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn
thọ”, mã số CNHD.DASXTN.026/17-18 thuộc Chương trình nghiên cứu
KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp hóa dược đến năm
2020. Xin trân trọng cảm ơn Bộ Công Thương và Phòng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ lọc, hóa dầu đã cấp kinh phí thực hiện dự án này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân
và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn.
Trân trọng!

Nha Trang, ngày 7 tháng 10 năm 2019
Tác giả luận văn

Lê Mỹ Kim Vương


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ANOVA

analysis of variance

Phân tích phương sai

AOAC

Assosiation of Official
Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa
phân tích chính thức.

ASTM

American Society for Testing

of Materials

Hiệp hội phép thử Mỹ.

DAD

Diod array detector

Detector mảng diod.

DMF

Dimethyle formamide

DNA

Acid Deoxyribonucleic

ADN

EU

Europe Union

Liên minh châu Âu

FDA

Food and Drug Administration

Cục quản lý thực phẩm
và dược phẩm

GC-MS

Gas chromatography mass
spectrometry

Sắc ký khí Khối phổ

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

chromatography

cao.

ICH

International Conference on
Harmonization

Hội đồng hòa hợp quốc
tế.

JECFA

The Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food)

Hội đồng các chuyên gia
FAO/WHO về phụ gia
thực phẩm

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện.


LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng.

MTBE

Methyle tert-butyle ether

R2

Correlation coefficient

Hệ số tương quan

RT

Retention Time

Thời gian lưu

SD

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

S/N

Signal to noise ratio

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu.

THF

Tetrahydrofurane

UV – Vis

Ultraviolet – Visible

Tử ngoại khả kiến.

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích.

v/w

Volume/weight

Thể tích/khối lượng.

w/w

Weight/weight

Khối lượng/khối lượng.

lmax

Wavelength of maximum
absorption

Bước sóng hấp thụ cực
đại.


Danh mục các bảng
Bảng 1.1.Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin………………. 12
Bảng 2.1.Các thành phần pha động thử nghiệm ở chế độ rửa giải isocratic...52
Bảng 3.1.Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thừa số lưu giữ lutein và
lutein ester………………………………………………………………….. 62

Bảng 3.2.Giá trị k’ của lutein và lutein ester khi thử nghiệm rửa giải theo
chương trình gradient dung môi đề nghị…………………………………….66
Bảng 3.3.Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến độ rộng chân peak và số đĩa lý
thuyết của cột tách đối với các cấu tử phân tích……………………………..67
Bảng 3.4.Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến độ rộng chân peak, số đĩa lý
thuyết và chiều cao của đĩa đối với các cấu tử phân tích……………………70
Bảng 3.5.Kết quả xác định hàm lượng carotenoid tổng số và lutein có trong
lutein đối chứng……………………………………………………………...74
Bảng 3.6.Kết quả dựng đường chuẩn lutein (lặp lại 3 lần song song)……... 75
Bảng 3.7.Khảo sát độ lặp lại khi tiêm cùng mẫu chuẩn trong ngày………... 78
Bảng 3.8.Khảo sát độ thu hồi khi thêm mẫu chuẩn ở các nồng độ 12; 15;
18ppm………………………………………………………………………..81
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oleoresin đến hiệu suất xà phòng
hoá…………………………………………………………………………...84
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa lutein
ester……………………………………………………………………. ……86
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa……...........88
Bảng 3.12.Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein
ester………………………………………………………………………….92
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá trên mẫu lớn.…......96
Bảng 3.14.Kết quả thử nghiệm quy trình xà phòng hoá mẫu thêm chuẩn
………………………………………………………………………...97


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15] ................. 10
Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15].................. 11
Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15] .. 11
Hình 1.4. Quá trình rửa giải và tách peak của chất A và chất B [16] ............. 17
Hình 1.5. Sơ đồ thiết bị HPLC [16] ................................................................ 18

Hình 1.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử A và B [16] .................................. 22
Hình 1.7. Ảnh hưởng của độ chọn lọc đến hiệu quả tách của hai chất .......... 23
Hình 3.1. Ảnh hưởng thành phần pha động đến thời gian lưu và rửa giải của
lutein và lutein ester ........................................................................................ 63
Hình 3.2. Sơ đồ sự thay đổi thành phần pha động trong quá trình rửa giải .... 65
Hình 3.3. Sắc ký đồ chế độ rửa giải gradient dung môi ................................. 65
Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến một số đại lượng sắc ký .............. 68
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi tốc độ dòng từ
0,8 đến 1,2 ml/phút ......................................................................................... 69
Hình 3.6. Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu đến quá trình sắc ký ................. 71
Hình 3.7. Sắc ký đồ hỗn hợp lutein và lutein ester khi thay đổi thể tích bơm
mẫu ................................................................................................................. 72
Hình 3.8. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 40 ppm ................. 75
Hình 3.9. Kết quả HPLC của các mẫu trắng, mẫu chứng thực, mẫu thực và
mẫu thêm ........................................................................................................ 76
Hình 3.10. Đường chuẩn lutein trong khoảng nồng độ 5 – 30 ppm ............... 79
Hình 3.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin không xà phòng hóa (lutein
ester) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ...................................................... 82
Hình 3.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu oleoresin sau khi xà phòng hóa (lutein
tự do) ứng với nồng độ oleoresin 0,2 g/ml ..................................................... 82


Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu lutein đối chứng cho thấy trans-lutein có RT ~ 0,89
phút ................................................................................................................. 83
Hình 3.14. Phổ hấp thụ UV-Vis ứng với: a) peak trans-lutein (RT ~ 8,9 min);
b) peak cis-lutein (RT ~ 10,3 min) .................................................................. 83
Hình 3.15. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ...................................... 85
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin
khi thay đổi nồng độ oleoresin từ 0,1 – 0,9 g/ml ............................................ 87
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của hiệu suất xà phòng hóa vào tỷ lệ KOH/Oleoresin

khi cố định nồng độ oleoresin 0,3 g/ml .......................................................... 87
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 88
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu oleoresin 0,3 g/ml sau khi xà phòng
hóa bằng KOH 5% w/v trong EtOH trong 1 h ở các nhiệt độ khác nhau ....... 91
Hình 3.20. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester 92
Hình 3.21. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu xà phòng hoá trong các khoảng thời
gian khác nhau ................................................................................................ 95


1
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 6
1. Lý do chọn đề tài ......................................................................................... 6
2. Mục đích của đề tài ..................................................................................... 8
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 8
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................. 9
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................... 10
1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN .................................................................... 10
1.1.1. Cấu trúc phân tử ................................................................................ 10
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein ............................................... 11
1.1.2.1. Tính chất vật lý ............................................................................ 11
1.1.2.2. Tính chất hóa học ........................................................................ 13
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein ........................................ 13
1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein ...................................................... 13
1.1.3.2. Ứng dụng của lutein .................................................................... 14
1.1.4. Các nguồn lutein quan trọng trong tự nhiên ...................................... 16
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC ........................................... 16
1.2.1. Khái niệm về phương pháp sắc ký .................................................... 16
1.2.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị HPLC .......................... 18

1.2.2.1. Bình đựng dung môi pha động .................................................... 18
1.2.2.2. Bộ phận khử khí ........................................................................... 19
1.2.2.3. Bơm cao áp .................................................................................. 19
1.2.2.4. Bộ phận tiêm mẫu ........................................................................ 19
1.2.2.5. Cột sắc ký .................................................................................... 19
1.2.2.6. Đầu dò ......................................................................................... 20


2
1.2.2.7. Bộ phận ghi tín hiệu .................................................................... 21
1.2.2.8. Thiết bị in dữ liệu ........................................................................ 21
1.2.3. Các đại lượng đặc trưng cơ bản trong HPLC .................................... 21
1.2.3.1. Thời gian lưu - Thời gian lưu thực .............................................. 21
1.2.3.2. Hệ số dung lượng ........................................................................ 22
1.2.3.3. Độ chọn lọc ................................................................................. 23
1.2.3.4. Số đĩa lý thuyết ............................................................................ 23
1.2.3.5. Độ phân giải ................................................................................ 24
1.2.4. Cách xây dựng một quy trình phân tích HPLC ................................. 25
1.2.4.1. Chọn kiểu sắc ký .......................................................................... 26
1.2.4.2. Chọn cột sắc ký............................................................................ 26
1.2.4.3. Chọn pha động ............................................................................ 27
1.2.4.4. Chọn chế độ rửa giải ................................................................... 28
1.2.5. Cách thẩm định một quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC
..................................................................................................................... 28
1.2.5.1. Tính thích hợp của hệ thống sắc ký ............................................. 29
1.2.5.2. Tính đặc hiệu (Specificity) ........................................................... 29
1.2.5.3. Độ đúng (Accuracy) .................................................................... 30
1.2.5.4. Độ chính xác (Precision) ............................................................. 30
1.2.5.5. Khoảng nồng độ tuyến tính (Range)............................................ 31
1.2.5.6. Giới hạn phát hiện (LOD: Detection Limit) ................................ 32

1.2.5.7. Độ thô (Robustness) .................................................................... 33
1.2.5.8. Khả năng áp dụng của phương pháp (Scope) ............................. 33
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
CARATENOID .............................................................................................. 33


3
1.3.1. Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo quang UV-Vis........... 33
1.3.1.1. Định lượng sản phẩm carotenoid tinh chế .................................. 33
1.3.1.2. Định lượng carotenoid trong các mẫu sinh học .......................... 34
1.3.2. Định lượng carotenoid bằng phương pháp HPLC ............................. 34
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ..................... 38
1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester ................................ 38
1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp
HPLC ........................................................................................................... 41
1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................. 41
1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................ 45
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 48
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 48
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 48
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................. 48
2.2. DỤNG CỤ - THIẾT BỊ ........................................................................... 49
2.2.1. Dụng cụ ............................................................................................. 49
2.2.2. Thiết bị............................................................................................... 49
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 50
2.3.1. Cải biến phương pháp HPLC định lượng lutein trong hỗn hợp với
lutein ester ................................................................................................... 50
2.3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch khảo sát điều kiện chạy HPLC ............. 50
2.3.1.2. Chọn thành phần pha động và chế độ rửa giải ........................... 51
2.3.1.3. Chọn tốc độ dòng ........................................................................ 53

2.3.1.4. Chọn thể tích bơm mẫu................................................................ 53
2.3.1.5. Dựng đường chuẩn lutein ............................................................ 54


4
2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng lutein.............................................. 56
2.3.2.1. Tính đặc hiệu ............................................................................... 56
2.3.2.2. Độ chụm (precision) .................................................................... 56
2.3.2.3. Độ tuyến tính của đường chuẩn – Khoảng nồng độ tuyến tính ... 57
2.3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) [41] .. 57
2.3.2.5. Độ đúng. ...................................................................................... 57
2.3.3. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định điều kiện thích hợp xà
phòng hóa lutein ester .................................................................................. 58
2.3.3.1. Phương pháp tổng quát xà phòng hóa lutein ester ..................... 58
2.3.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu suất xà phòng hóa lutein ester ....... 58
2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa lutein ester đến
đến hiệu suất xà phòng ............................................................................. 59
2.3.3.4. Thử nghiệm quy trình xà phòng hóa lutein ester......................... 60
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................. 61
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 62
3.1. CẢI BIẾN PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN TRONG
HỖN HỢP CHỨA LUTEIN ESTER ............................................................. 62
3.1.1. Chọn thành phần pha động ................................................................ 62
3.1.2. Chọn tốc độ dòng............................................................................... 66
3.1.3. Chọn thể tích bơm mẫu ..................................................................... 70
3.1.4. Kết luận về điều kiện phân tích hỗn hợp lutein và lutein ester ......... 73
3.2. DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN HPLC ĐỊNH LƯỢNG LUTEIN .................. 74
3.2.1. Xác định độ tinh khiết của mẩu lutein đối chứng .............................. 74
3.2.2. Kết quả dựng đường chuẩn lutein ..................................................... 74
3.3. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐÃ XÂY

DỰNG ............................................................................................................ 76


5
3.3.1. Tính đặc hiệu của phương pháp phân tích ......................................... 76
3.3.2. Độ lặp lại trong ngày (intra-day injection repeatability) ................... 78
3.3.3. Khoảng tuyến tính của đường chuẩn ................................................. 78
3.3.4. Xác định LOD và LOQ ..................................................................... 80
3.3.5. Xác định độ thu hồi ........................................................................... 80
3.3.6. Kết luận về việc thẩm định phương pháp HPLC đã xây dựng .......... 81
3.4. NHẬN BIẾT PEAK LUTEIN VÀ LUTEIN ESTER ............................. 82
3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐÃ THỬ NGHIỆM ĐỂ XÁC
ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP XÀ PHÒNG HOÁ LUTEIN ESTER
ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ HOA CÚC VẠN THỌ ....................................... 84
3.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ oleoresin ..................................................... 84
3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ KOH đến hiệu suất xà phòng hóa .............. 85
3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất xà phòng hóa .......... 88
3.5.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất xà phòng hóa......... 92
3.5.5. Kết luận về khảo sát điều kiện xà phòng hoá .................................... 96
3.6. THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH XÀ PHÒNG HOÁ .................................. 96
3.6.1. Thử nghiệm trên mẫu lớn .................................................................. 96
3.6.2. Thử nghiệm trên mẫu thêm chuẩn ..................................................... 97
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................... 98
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................. 98
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 100


6
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Lutein là một sắc tố carotenoid có màu vàng cam, là dẫn xuất 3,3’-diol
của b,e-caroten. Lutein có trong nhiều loài thực vật (cải bó xôi, bông cải xanh,
rau ngót, hoa, quả, rong, tảo…) và trong mô của một số loài động vật (lòng đỏ
trứng và da của gia cầm, da cá cảnh…) [1]. Lutein - cùng với đồng phân của
nó là zeaxanthin - là các sắc tố tập trung ở hoàng điểm của mắt người với hàm
lượng cao, có vai trò quan trọng trong việc xử lý hình ảnh, phát triển của thần
kinh thị giác và não bộ [2]. Nhiều nghiên cứu dịch tể học gần đây đã chứng
minh rằng lutein có khả năng bắt giữ oxy đơn và các gốc tự do, hấp thụ mạnh
tia tử ngoại. Nhờ đó, lutein có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi một số bệnh ung
thư, bệnh tim mạch, ngăn ngừa triệu chứng lão hóa và các bệnh về mắt ở
người cao tuổi (bệnh đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm) [3]. Do vậy,
lutein đang được quan tâm nghiên cứu khai thác từ các nguồn tự nhiên nhằm
ứng dụng trong trong công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm (làm
thuốc bổ mắt, vi chất dinh dưỡng, kem chống nắng, son dưỡng môi, chất màu
thực phẩm...) [4]
Hiện nay, nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu lutein nhất là hoa cúc vạn
thọ châu Mỹ (Tagetes erecta L.). Lutein tồn tại trong hoa cúc vạn thọ dưới
dạng monoester hay diester của các acid béo (acid myristic, palmitic…). Hàm
lượng carotenoid tổng số trong cánh hoa chiếm khoảng 0,1 – 0,2% (tính theo
trọng lượng khô), trong đó lutein chiếm trên 80% [5]. Theo các quy trình
truyền thống, lutein ester từ hoa cúc vạn thọ thường được chiết bằng hexan;
dịch chiết được cô đặc dưới áp suất thấp để thu được một dạng dầu sệt (gọi là
oleoresin), sau đó được xà phòng hóa bằng KOH trong alcol để chuyển thành
dạng lutein tự do – là dạng cơ thể người có thể hấp thụ. Một số quy trình xà
phòng hóa lutein ester đã được đề nghị như các quy trình của Ausich (1997)
[6], Kumar (2004) [7], Swaminathan (2009) [8], Sankar (2012) [9] … Các
quy trình trên chưa có sự nhất quán về điều kiện phản ứng (nồng độ oleoresin,
nồng độ KOH, nhiệt độ, thời gian) cũng như chưa có đầy đủ thông tin về hiệu
suất xà phòng hóa. Hơn nữa, công đoạn xà phòng hóa thường được tiến hành

7
ở nhiệt độ cao (50 – 600C hoặc 70 – 800C) và trong thời gian khá dài (3 giờ –
10 giờ); điều này có thể gây ra sự phân hủy đáng kể lutein do lutein là một
hợp chất kém bền nhiệt. Nguyên nhân là do các tác giả trên đã sử dụng các
phương pháp khác nhau (sắc ký bản mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao) để theo
dõi tiến trình phản ứng hoặc định lượng lutein trong hỗn hợp xà phòng hóa.
Thực tế này dẫn đến sự bối rối đối với người nghiên cứu trong việc chọn lựa
quy trình xà phòng hóa lutein ester ứng dụng cho các mục đích phân tích
lutein ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc nhằm thu nhận lutein tự do từ cao
chiết lutein ester ở quy mô công nghiệp. Để làm sáng tỏ vấn đề trên, cần khảo
sát đầy đủ và hệ thống hơn về ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu
suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó đưa ra quy trình thích
hợp cho phép xà phòng hóa lutein ester với hiệu suất cao và sản phẩm chất
lượng cao. Muốn vậy, cần sử dụng một phương pháp phân tích đáng tin cậy
cho phép định lượng lutein tự do trong hỗn hợp xà phòng hóa lutein ester
chiết tách từ hoa cúc vạn thọ.
Cho đến nay, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn
được xem là một phương pháp hiệu quả để phân tích hỗn hợp carotenoid [10].
Nhiều quy trình phân tích sử dụng phương pháp HPLC đã được xây dựng để
phân tích hỗn hợp carotenoid trên các đối tượng khác nhau, trong đó có thể sử
dụng cột sắc ký pha thường (cột silica, cột cyanopropyl...) hay pha đảo (cột
C18, C30) với đầu dò tử ngoại – khả kiến (UV-Vis), đầu dò dãy diode quang
(PDA), đầu dò khối phổ (MS), hoặc đầu dò cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
[10]. Trong số đó, phương pháp HPLC sử dụng cột silica là phương pháp đã
được JECFA sử dụng như là phương pháp tiêu chuẩn để định lượng lutein và
zeaxanthin trong các sản phẩm lutein tách chiết từ hoa cúc vạn thọ [11][12].
Tuy nhiên, ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút
ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động

chạy sắc ký, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại [13]. Đối với các cột pha đảo,
cột C30 có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp
carotenoid phức tạp nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường
được ưu tiên lựa chọn khi phân tích hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp.
Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu xây dựng phương pháp


8
HPLC định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau sử dụng cột C18
[14] nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng
thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành
phần pha động, …). Tại Việt Nam, rất ít nghiên cứu về định lượng carotenoid
bằng phương pháp HPLC. TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) đã sử dụng cột C18
(150 x 4,6 cm; 5 µm) với đầu dò PDA để xây dựng phương pháp RP-HPLC
khá hiệu quả và thuận tiện cho phép định lượng astaxanthin và hỗn hợp
carotenoid đi kèm (lutein, zeaxanthin, b-caroten, lycopen, astaxanthin ester)
trong đối tượng giáp xác thủy sản [13]. Trong nghiên cứu của Trương Ngọc
Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ đã xây dựng phương pháp phân tích b-carotene
trong một số loại ngũ cốc có màu bằng cách sử dụng cột C18 (150 x 4,6 cm,
5µm). Tuy nhiên, phòng thí nghiệm của chúng tôi hiện chỉ có cột pha đảo C18
(250 x 4,6 cm; 5 µm) và đối tượng nghiên cứu trong luận văn hướng tới
không phù hợp với các nghiên cứu trên. Do đó, việc cải biến phương pháp
HPLC định lượng carotenoid sẵn có sao cho phù hợp với điều kiện phòng thí
nghiệm và đối tượng phân tích cụ thể là vấn đề đặt ra đối với người làm công
tác phân tích. Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sẽ nghiên cứu cải biến
phương pháp HPLC nói trên để định lượng lutein và theo dõi quá trình xà
phòng hóa lutein ester.
2. Mục đích của đề tài
-

Cải biến phương pháp RP-HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm;

5µm) phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm, cho phép định lượng lutein
trong sự có mặt của hỗn hợp lutein ester.
Xác định điều kiện thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester
chiết tách từ hoa cúc vạn thọ dựa trên việc ứng dụng phương pháp HPLC đã
cải biến thông qua việc xác định hiệu suất xà phòng hoá và độ tinh khiết của
sản phẩm lutein tự do thu được.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. được
trồng trong dự án đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An.


9
Phạm vi nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi kế thừa một số
kết quả nghiên cứu trước đây của TS. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] và xây
dựng phương pháp HPLC phù hợp để định lượng lutein, từ đó ứng dụng kiểm
soát quá trình xà phòng hoá lutein ester.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện sắc ký đến khả
năng định lượng lutein khi có mặt hỗn hợp lutein ester bằng phương pháp
HPLC sử dụng cột C18 (250 x 4,6 cm; 5 µm).
- Cung cấp dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa
(nồng độ tác chất, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất xà phòng hóa lutein ester.
Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Cho phép định lượng lutein trong các mẫu thực tế có chứa lutein và
lutein ester bằng phương pháp HPLC với cột pha đảo C18 (250 x 4,6 cm; 5
µm).
- Góp phần hoàn thiện quy trình xà phòng hóa lutein ester ở quy mô

phòng thí nghiệm và ở quy mô công nghiệp.


10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ LUTEIN
1.1.1. Cấu trúc phân tử
Lutein là một sắc tố xanthophyll (tức oxycarotenoid) có nhiều ứng
dụng trong công nghiệp chất màu thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm nhờ có
màu vàng cam rất đẹp và tác dụng chống oxy hóa khá mạnh.
Lutein có công thức phân tử C40H56O2 (phân tử lượng 568,9), là dẫn
xuất 3,3’- diol của b,e-caroten và là một dạng tiền vitamin A [15]. Phân tử
lutein chứa bộ khung cấu trúc isoprenoid C40 điển hình của các carotenoid và
có 2 vòng 6 cạnh ở hai đầu mạch carbon. Chuỗi liên kết đôi liên hợp trong
lutein có thể tồn tại ở cấu hình cis hoặc trans, do đó tạo ra số lượng lớn đồng
phân mono-cis và poly-cis của lutein.
Trong tự nhiên lutein thường tồn tại ở dạng đồng phân hình học bền
nhất là dạng all-trans (hình 1.1) [15], [16].

Hình 1.1. Cấu tạo phân tử lutein (dạng đồng phân all-trans) [15]
Tuy nhiên, dưới tác dụng của bức xạ nhiệt hay ánh sáng, dạng all-trans
có thể bị chuyển hóa thành các dạng đồng phân cis, trong đó bền hơn cả là các
dạng 9-cis, 13-cis và 15-cis hay 9’-cis, 13’-cis, 15’-cis…(Hình 1.2.).


11

9

13

HO

HO

OH

OH

a) Đồng phân 9-cis- lutein

b) Đồng phân 13-cis- lutein
15

HO

OH

c) Đồng phân 15-cis- lutein
Hình 1.2. Một số dạng đồng phân cis thường gặp của lutein [15]
Ngoài ra, trong tự nhiên cũng tồn tại một dạng đồng phân vị trí khác
của lutein là zeaxanthin (Hình 1.3).
OH

HO

Hình 1.3. Cấu tạo phân tử của Zeaxanthin (b, b’-carotene - 3,3’-diol) [15]
1.1.2. Tính chất vật lý và hoá học của lutein
1.1.2.1. Tính chất vật lý
Lutein có thể tồn tại ở dạng bột chảy vô định hình hoặc kết tinh dạng

tinh thể hình kim, khối lăng trụ, đa diện hoặc dạng lá hình thoi [17]. Nhiệt độ
nóng chảy 1900C.
Lutein là chất ít phân cực nên không tan trong nước, kém tan trong các
dung môi hữu cơ phân cực (như methanol, ethanol…), nhưng tan tốt hơn


12
trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình (acetone, ethyl acetate,
dichloromethane, acetonitrile, tetrahydrofuran...) [17][18].
Phân tử lutein có 10 nối đôi liên hợp nên hấp thụ mạnh tia tử ngoại và
ánh sáng xanh (400 - 490 nm), do đó lutein ở dạng bột có màu đỏ cam và ở
dạng dung dịch có màu vàng cam rất đẹp. So với zeaxanthin (có 11 nối đôi
liên hợp), các cực đại hấp thụ (λmax) của lutein thấp hơn khoảng 4 - 6 nm. Nhờ
đó, có thể phân biệt khá dễ dàng lutein và zeaxanthin dựa vào phổ hấp thụ
UV-Vis của chúng (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Dữ kiện hấp thụ UV-Vis của lutein và zeaxanthin
Carotenoid

Lutein

Zeaxanthin

Dung môi

Cực đại hấp thụ

Hệ số hấp thụ

(λmax, nm)

1%
( A1cm
)

Chloroform

435

458

485

-

Ethanol

422

445

474

2550

Hexane

421

445

474

2480

Acetone

430

452

479

2340

Chloroform

433

462

493

-

Ethanol

428

450

478

2480 (2540)

Hexane

424

449

476

2348

Nguồn: “Britton (1995) and Davies (1976)” [19]
Sự chuyển hóa lutein từ dạng trans thành dạng đồng phân mono-cis dẫn
đến sự giảm cường độ hấp thụ và giảm λmax khoảng 2 - 6 nm, đồng thời làm
xuất hiện đám hấp thụ cis (gọi tắt là peak cis) ở vùng UV gần 320 - 380 nm.
Cường độ hấp thụ của peak cis càng lớn khi liên kết đôi có cấu hình cis càng
gần tâm phân tử. Do vậy, cường độ hấp thụ của peak cis- ở đồng phân 15-cis
mạnh nhất. Nhờ đó, có thể nhận biết các đồng phân cis- bằng phương pháp
HPLC với đầu dò PDA [20][21].


13
1.1.2.2. Tính chất hóa học
Lutein thuộc họ carotenoid, trong phân tử có chuỗi polyen liên hợp nên
rất nhạy cảm đối với acid, các ion kim loại, chất oxy hoá, ánh sáng, nhiệt…
Nhóm hydroxyl ở hai đầu phân tử làm cho lutein dễ dàng tham gia vào các
phản ứng oxy hóa. Nhờ đó, nó có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn một số

carotenoid khác (như lycopen, b-caroten…). Vì vậy, lutein dễ bị oxi hóa bởi
oxy không khí, hấp thụ mạnh các gốc tự do hoặc bị đồng phân hóa bởi nhiệt
và ánh sáng, dẫn đến sự nhạt màu hay mất màu. Do đó, lutein cần được bảo
quản trong môi trường khí trơ hay chân không dưới nhiệt độ thấp, tránh ánh
sáng mặt trời.
Lutein khá bền trong môi trường kiềm [22]. Trong môi trường kiềm,
lutein ester bị xà phòng hóa tạo thành lutein tự do. Để tránh sự oxy hóa lutein
bởi oxy không khí nên thực hiện phản ứng xà phòng hóa lutein ester dưới khí
trơ N2.
Trong các mô động - thực vật lutein có khả năng liên kết với các acid
béo, lipid, lipoprotein tạo thành các cấu trúc bền vững hơn so với dạng lutein
tự do [23].
1.1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của lutein
1.1.3.1. Hoạt tính sinh học của lutein
Phần lớn chức năng sinh học của chất màu lutein đều dựa trên khả năng
hấp thụ ánh sáng, khả năng dễ bị oxy hóa và khả năng bắt giữ các gốc tự do
của phân tử lutein.
Lutein có khả năng hấp thụ tia tử ngoại và ánh sáng xanh trong dải bức
xạ khả kiến, do đó có khả năng bảo vệ da, mắt khỏi tác hại của các bức xạ
này, ngăn ngừa ung thư da, thoái hóa điểm vàng [3], [24].
Người ta cho rằng các gốc tự do sinh ra trong tế bào và mô trong hoạt
động sống của con người có thể gây tác hại đến DNA, protein, carbohydrate
và lipid . Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng lutein có tác động loại trừ sự
xâm nhập của chất oxy hóa và gốc tự do qua màng tế bào, giúp ngăn chặn sự
oxy hóa lipid, hạn chế sự suy giảm khả năng miễn dịch đối với cơ thể, ngăn


14
ngừa những chứng bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim mạch, một số bệnh về
mắt (thoái hóa võng mạc do tuổi già, đục thủy tinh thể viêm màng bồ đào…)

[19]. Tác dụng này của lutein nhờ vào khả năng bắt giữ các chất oxy hóa và
các gốc tự do sinh ra trong tế bào [26]. Khả năng chống oxy hóa của lutein có
thể được giải thích bởi cấu trúc hóa học đặc biệt của nó với chuỗi polyen rất
dễ bị oxy hóa. Ngoài ra, hai nhóm hydroxyl ở 2 vòng sáu đầu mạch trong
phân tử lutein làm cho hoạt tính chống oxy hóa của lutein trở nên mạnh hơn
so với các carotenoid khác (như lycopene, b-carotene, …) [27].
1.1.3.2. Ứng dụng của lutein
Ø Trong công nghiệp thực phẩm
Nhờ có màu vàng rất đẹp lutein được phép sử dụng làm chất màu trong
chế biến thực phẩm (mã số E161b). Lutein ở dạng chế phẩm hòa tan trong
nước được sử dụng để nhuộm vỏ ngoài cho giò chả, các bán thành phẩm từ
thịt gà, sữa chua, bánh nướng, kẹo, nước giải khát, nước ép trái cây, ngũ cốc
điểm tâm, các sản phẩm từ sữa, trứng, thực phẩm cho trẻ sơ sinh và trẻ mới
biết đi, chất béo, dầu, nước thịt, nước sốt và súp hỗn hợp [28].Theo quy định
của EU, Canada, Úc, New Zealand … lutein có thể được sử dụng với mức 0,5
- 2 mg/ngày [29].
Ø Trong công nghiệp dược phẩm
Ngoài khả năng tạo màu, lutein còn có tác dụng chống oxy hóa, hấp thụ
gốc tự do và tia tử ngoại, làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch, giúp duy trì
sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư [24]. Lutein là carotenoid chủ yếu có
ở điểm vàng, giúp cải thiện khả năng truyền tin qua khe kết nối trong võng
mạc, rất cần thiết cho quá trình xử lý hình ảnh và sự phát triển của thần kinh
thị giác [31]. Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây của tập đoàn dinh dưỡng
hàng đầu thế giới là DSM (Thụy Sĩ) đã phát hiện lutein chiếm đến 66 - 77%
lượng carotenoid hình thành não bộ của người, có chức năng quan trọng trong
việc phát triển và kích thích khả năng học hỏi, sự hình thành cảm xúc và ghi
nhớ của trẻ em, cải thiện tình trạng suy giảm chức năng nhận thức ở người
cao tuổi [32]. Do vậy, lutein cũng đã được đưa vào trong thành phần của một

15
số thuốc bổ (liều dùng 2 - 330 mg/kg), trong sữa cho bé, trong thuốc bổ cho
người cao tuổi.
- Lutein là chất ức chế khối u: Lutein cũng đã được cho là có tác dụng
làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch và ngăn ngừa một số dạng ung thư
(như ung thư vú, cổ tử cung) do khả năng chống oxy hoá khá tốt. Một nghiên
cứu của Đại học Tufts (Boston, Massachusetts) và các nhà điều tra Hàn Quốc
cho thấy, phụ nữ có nồng độ lutein trong máu ở mức cao nhất thì khả năng
ung thư vú giảm 88% [8].
– Lutein là chất ức chế sự tắc nghẽn mạch máu, viêm khớp, thậm chí
có thể giúp giảm đau viêm xương khớp và tàn tật ở 16 triệu người Mỹ. Các
nhà nghiên cứu tại Viện Y học Quốc gia Hoa Kỳ gần đây đã phát hiện ra rằng
những người có nồng độ lutein cao trong máu (khoảng 70%) ít có khả năng bị
viêm khớp đầu gối và các mô liên kết khác [33].
– Lutein làm giảm các rối loạn mắt như thoái hóa điểm vàng, đục thủy
tinh thể. Ở người, lutein và zeaxanthin tập trung ở điểm vàng của mắt cũng
như ở da, vú và mô cổ tử cung. Lutein được coi là một vi chất dinh dưỡng cần
thiết cho thị lực bình thường [30][34]. Được sử dụng chủ yếu trong các sản
phẩm chăm sóc mắt để làm giảm mệt mỏi thị giác, giảm tỷ lệ mắc chứng thoái
hóa điểm vàng do tuổi già (AMD: Age-related macular degeneration), đục
thủy tinh thể, bệnh võng mạc…
Ø Trong công nghiệp mỹ phẩm
Lutein chủ yếu được sử dụng để chống nếp nhăn và bảo vệ da khỏi tác
hại của tia cực tím. Lutein và lutein ester có thể dễ dàng thâm nhập vào da và
cho hiệu quả chống nắng tốt [35]. Một số chế phẩm kem chống nắng công
thức thảo dược chứa lutein ester chiết suất từ Tagetes erecta L. đã được sản
xuất. [36].
Ø Trong chăn nuôi
Lutein được dùng để làm chất phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi cá
cảnh, thức ăn cho gia súc và gia cầm để tạo màu vàng cho da gà và lòng đỏ

trứng…