Nghiên cứu tạo vi nang Alginat Chitosan hướng bảo vệ và giải phóng Lactobacillus acidophilus trong môi trường tiêu hóa mô phỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ THÚY NGÂN

NGHIÊN CỨU TẠO VI NANG
ALGINAT – CHITOSAN HƯỚNG BẢO VỆ VÀ
GIẢI PHÓNG Lactobacillus acidophilus TRONG
MÔI TRƯỜNG TIÊU HÓA MÔ PHỎNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VÕ THỊ THÚY NGÂN

NGHIÊN CỨU TẠO VI NANG
ALGINAT – CHITOSAN HƯỚNG BẢO VỆ VÀ GIẢI
PHÓNG Lactobacillus acidophilus TRONG MÔI
TRƯỜNG TIÊU HÓA MÔ PHỎNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: Công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc
Mã chuyên ngành: 8720202

Người hướng dẫn khoa học
PGS. TS. Đàm Thanh Xuân

HÀ NỘI 2019


LỜI CẢM ƠN
Với sự kính trọng và lòng biết ơn, lời đầu tiên cho tôi được bày tỏ sự cảm ơn
chân thành nhất tới:
PGS. TS. Đàm Thanh Xuân
Cô đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn và truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm
quý báu, dành nhiều thời gian tận tâm, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược, bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lýHóa lý và bộ môn Thực vật dược đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất về
phương tiện để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin được cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau đại học cùng các thầy cô, cán bộ
nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình
học tập và nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn bố mẹ cùng toàn thể đại gia đình và bạn
bè đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi trong những giai đoạn khó khăn nhất.
Hà Nội, tháng 4 năm 2019


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về probiotic
1.1.1 Định nghĩa
1.1.2 Nguồn, phân lập và đặc tính của probiotic
1.1.3 Ý nghĩa lâm sàng và các chỉ định tiềm năng của probiotic
1.2 Loài Lactobacillus acidophilus
1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy L. acidophilus
1.2.2 Vai trò
1.3 Tổng quan về vi nang
1.3.1 Định nghĩa
1.3.2 Các nguyên liệu sử dụng để tạo vi nang
1.3.3 Các phương pháp tạo vi nang
1.4 Xu hướng phát triển một số nghiên cứu về tạo vi nang probiotic
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu
2.2 Nội dung nghiên cứu
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
2.3.3 Phương pháp tạo vi nang
2.3.4 Phương pháp đông khô
2.3.5 Phương pháp xác định hình ảnh, kích thước và phân bố kích
thước vi nang
2.3.6 Phương pháp xác định mức độ trương nở của vi nang trong môi
trường mô phỏng dịch dạ dày
2.3.7 Phương pháp định tính tinh bột bằng thuốc thử Lugol
2.3.8 Phương pháp đo hàm ẩm
2.3.9 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng vi sinh vật

2.3.10 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật của vi nang
trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày pH 1,2
2.3.11. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật của vi
nang trong môi trường tiêu hóa mô phỏng
2.3.12 Phương pháp xử lí kết quả
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Trang

1
2
2
2
3
5
8
8
9
10
10
11
14
18
22
22
25
25
25
25
26

29
29
31
31
32
32
33
34
36
37


3.1 Nghiên cứu các thông số của quá trình bao vi nang và bào chế
vi nang bao với tá dược alginat, chitosan
3.1.1 Khảo sát đặc tính của vi nang nhân alginat, alginat – chitosan
3.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố công thức đến chất lượng cảm quan màng
bao alginat
3.2 Nghiên cứu một số đặc tính của vi nang bao và đánh giá khả
năng bảo vệ, giải phóng VSV trong đường tiêu hóa mô phỏng của
vi nang bao
3.2.1 Khảo sát đặc tính và khả năng ổn định cấu trúc vủa vi nang bao
trong đường tiêu hóa mô phỏng
3.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ, giải phóng L. acidophilus của vi nang
nhân A và AC-1 bao alginat, chitosan trong môi trường tiêu hóa mô
phỏng
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1 Về các thông số của quá trình bao vi nang và bào chế vi nang
bao với tá dược alginat, chitosan
4.1.1 Về các đặc tính của vi nang nhân alginat, alginat – chitosan
4.1.2 Về ảnh hưởng của yếu tố công thức đến chất lượng cảm quan

màng bao alginat
4.2 Về một số đặc tính của vi nang bao và đánh giá khả năng bảo
vệ, giải phóng VSV trong đường tiêu hóa mô phỏng của vi nang
bao
4.2.1 Về đặc tính và khả năng ổn định cấu trúc vủa vi nang bao trong
đường tiêu hóa mô phỏng
4.2.2 Về khả năng bảo vệ, giải phóng L. acidophilus của vi nang nhân
A và AC-1 bao alginat, chitosan trong môi trường tiêu hóa mô phỏng
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

37
37
45
48
48
57
63
63
63
66
67
67
70
76
78


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ALG

ATCC
B. bifidum
B. longum
B. subtilis
CFU
CNS
DĐVN
E. coli
FAO
GIT
IBD
L.
LAB
MRS
MRSA
MT
NC
PPL
SCFA
SEM
SGF
SIF

Alginat
Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ
(American Type Culture Collection)
Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium longum
Bacillus subtilis
Số đơn vị khuẩn lạc

(Colony-Forming Units)
Hệ Thần kinh trung ương
(Central Nervous System)
Dược điển Việt Nam
Escherichia coli
Tổ chức Nông lương thế giới
(Food and Agriculture Organization)
Đường dạ dày – ruột
(Gastro-Intestinal Tract)
Bệnh viêm ruột
(Inflammatory bowel disease)
Lactobacillus
Nhóm vi khuẩn sinh acid lactic
(Lactic acid bacteria)
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
(De Man, Rogosa, Sharpe)
Môi trường nuôi cấy thạch (MRS Agar)
Môi trường
Nghiên cứu
Poly – L - Lysine
Những acid béo chuỗi ngắn
(Short-Chain Fatty Acids)
Kính hiển vi điện tử quét
(Scanning Electron Microscope)
Dịch dạ dày mô phỏng
(Simulated gastric fluid)
Dịch ruột mô phỏng
(Simulated intestinal fluid)

TC NSX
TCCS
TKHH
UTI
VK
VSV
WHO

Tiêu chuẩn nhà sản xuất
Tiêu chuẩn cơ sở
Tinh khiết hóa học
Nhiễm trùng đường tiết niệu
(Urinary tract infection)
Vi khuẩn
Vi sinh vật
Tổ chức Y tế thế giới
(World Health Organization)


DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng 1.1
Bảng 2.1
Bảng 2.2
Bảng 2.3
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5

Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10
Bảng 3.11
Bảng 3.12
Bảng 3.13

TÊN BẢNG
TRANG
So sánh các phương pháp tạo vi nang
18
Các nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu
22
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
23
Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
23
Kích thước đường kính các loại vi nang sau đông khô
41
Mức độ gia tăng kích thước khi tạo vi nang nhân alginat 42
chitosan
Hàm ẩm của các loại vi nang alginat, alginat-chitosan được
42
tạo theo 2 phương pháp sau khi đông khô
Mức độ trương nở của các loại vi nang nhân alginat,
alginat-chitosan tạo thành theo 2 phương pháp trong môi
43
trường SGF sau 120 phút

Hàm ẩm của các vi nang nhân và vi nang bao
51
Kích thước đường kính các vi nang nhân và vi nang bao sau
51
đông khô
Mức độ thay đổi kích thước của các vi nang bao so với vi
54
nang nhân
Độ trương nở của các vi nang nhân A, AC-1 không bao và
55
bao alginat không có hoặc có chitosan bên ngoài
Thời gian bắt đầu xuất hiện vết nứt và thời gian rã hoàn
56
toàn của các vi nang nhân và vi nang bao trong SIF
Mật độ L. acidophilus trong các vi nang sau đông khô
58
Số lượng L. acidophilus trong các loại vi nang sau 2h ủ
59
trong SGF
Số lượng L. acidophilus giải phóng ra môi trường tiêu hóa
60
mô phỏng
Tỷ lệ L. acidophilus giải phóng ra môi trường tiêu hóa mô
60
phỏng so với số lượng trong vi nang sau đông khô


DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Hình 1.1

Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6

TÊN HÌNH
TRANG
Biểu đồ các bước để xác định một họ vi khuẩn
3
Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
9
Các loại vi nang
10
Cấu trúc của alginat
11
Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat
12
Cấu trúc phân tử chitin và chitosan
13
Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp
Hình 1.7
15
phun sấy
Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp
Hình 1.8
16
đông tụ
Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp
Hình 1.9

17
nhũ tương hóa
Hình ảnh bên ngoài của các loại vi nang nhân alginat,
Hình 3.1
39
alginat-chitosan trước và sau khi đông khô
Hình ảnh các loại vi nang nhân alginat, alginat-chitosan
Hình 3.2
40
sau đông khô dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10X
Hình ảnh cắt lớp các loại vi nang nhân alginat, alginatHình 3.3 chitosan sau đông khô dưới kính lúp soi nổi có độ phóng
40
đại 10X
Đồ thị biểu diễn phân bố kích thước vi nang nhân alginat,
Hình 3.4
41
alginat-chitosan được tạo thành theo 2 phương pháp
Hình ảnh các loại vi nang nhân trước và sau khi ủ 120
Hình 3.5
43
phút trong dịch dạ dày mô phỏng
Kết quả định tính tinh bột sau khi ủ vi nang trong dịch
Hình 3.6
44
SGF 120 phút bằng thuốc thử Lugol
Hình ảnh dịch ly tâm môi trường mô phỏng dịch dạ dày
Hình 3.7
44
SGF sau khi ủ vi nang
Ảnh hưởng của việc khuấy trộn lên thể chất màng bao

Hình 3.8
46
alginat bên ngoài vi nang nhân alginat
Hình ảnh vi nang nhân alginat-tinh bột sau khi bao hỗn
Hình 3.9 hợp alginat và tinh bột với hàm lượng tinh bột 0% - 1% 47
10%
Hình ảnh vi nang alginat có nồng độ tinh bột 1% - 10%
Hình 3.10 trong bao alginat có nồng độ tinh bột 1% - 10% dưới kính
47
lúp soi nổi có độ phóng đại 10X
Hình ảnh các vi nang nhân và vi nang bao sau khi đông
Hình 3.11
50
khô dưới kính lúp soi nổi có độ phóng đại 10X


Hình 3.12
Hình 3.13
Hình 3.14
Hình 3.15
Hình 3.16
Hình 3.17
Hình 3.18
Hình 3.19

Hình ảnh cắt lớp vi nang nhân và vi nang bao dưới kính
hiển vi
Đồ thị biểu diễn phân bố kích thước các vi nang nhân và
vi nang bao sau đông khô
Sự thay đổi của vi nang trong môi trường tiêu hóa mô

phỏng
Định tính tinh bột trong dịch SGF sau khi ủ vi nang nhân
và vi nang bao
Kết quả định tính tinh bột trong dịch SIF sau khi ủ các vi
nang nhân và vi nang bao trong thời gian 3 giờ
Biểu đồ biểu diễn mật độ L. acidophilus trong các loại vi
nang sau đông khô
Biểu đồ biểu diễn khả năng bảo vệ VSV của các vi nang
trong SGF
Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ VSV giải phóng ra môi trường tiêu
hóa mô phỏng

50
52
55
56
56
58
59
61


ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), probiotic là những sinh vật sống,
khi dùng với lượng thích hợp sẽ mang lại nhiều lợi ích sức khoẻ cho vật chủ
[25]. Tuy nhiên khi dùng theo đường uống sẽ gặp phải hai vấn đề: i) tỷ lệ sống
sót thấp khi đi qua dạ dày và ii) số lượng VSV tiếp cận được đích tác dụng thấp
[26]. Liên quan đến vấn đề thứ nhất, nhiều nghiên cứu về tính hiệu quả của vi
nang bảo vệ probiotic trong những môi trường bất lợi đã được tiến hành. Hai
nguyên liệu được sử dụng phổ biến và có tính tiềm năng nhất là alginat [38],

và chitosan [21]. Để giải quyết cả hai vấn đề trên, hệ thống vi nang cố định vi
sinh vật được các nhà khoa học quan tâm hơn hết. Vi nang có khả năng bảo vệ
vi sinh vật probiotic đồng thời điều khiển sự giải phóng có kiểm soát [67].
Các đề tài nghiên cứu đã được tiến hành trong nước gần đây về vi nang
probiotic sử dụng nguyên liệu natri alginat, chitosan đều cho kết quả khả quan
về khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày đồng
thời giải phóng tốt vi sinh vật tại môi trường mô phỏng dịch ruột [7], [4], [6].
Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tạo vi nang alginat – chitosan hướng bảo vệ và giải phóng
Lactobacillus acidophilus trong môi trường tiêu hóa mô phỏng”
Trong đề tài này, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu sử dụng 2 nguyên liệu trên
(natri alginat và chitosan) nâng cao hiệu quả quá trình tạo vi nang, để phát triển
thêm lớp bao bên ngoài vi nang calci alginat với những mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu các thông số của quá trình bao vi nang và bào chế vi nang
bao với tá dược alginat, chitosan.
2. Nghiên cứu một số đặc tính của vi nang bao và đánh giá khả năng bảo
vệ, giải phóng VSV trong dịch tiêu hóa mô phỏng của vi nang bao.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về probiotic
1.1.1 Định nghĩa
Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic”
hay “biosis” xuất phát từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên
probiotic có thể hiểu là “thân thiện với đời sống con người”. Đầu những năm
1900, Metchnikoff đã đề cập đến probiotic là những vi khuẩn có lợi trong cơ
thể người, thay thế cho những vi khuẩn có hại [48]. Tuy nhiên, tiếng vang thực
sự là kết quả nghiên cứu của Henry Tissier năm 1906 khi công bố nồng độ của

một loại vi khuẩn đặc biệt trong phân của trẻ em bị tiêu chảy thấp hơn đáng kể
so với trẻ khoẻ mạnh, đồng thời ông đề xuất việc sử dụng các sinh vật sống
(bifidobacteria) cho bệnh nhân bị tiêu chảy nhằm phục hồi hệ vi sinh đường
ruột [70]. Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương
thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotic
như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một
lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ”. Probiotic có thể
được sử dụng cho cả người và động vật” [25].
Trong hai thập kỉ vừa qua, những nghiên cứu về chế phẩm sinh học đã tiến triển
đáng kể, đưa ra những bằng chứng khoa học xác thực về probiotic cũng như
những lợi ích của chúng đối với sức khoẻ con người.

2


1.1.2 Nguồn, phân lập và đặc tính của probiotic [57]

Hình 1.1: Biểu đồ các bước để xác định một họ vi khuẩn
a, Nguồn probiotic:
Có 3 nguồn cơ bản để phân lập các VSV là sữa, thực phẩm lên men và
hệ tiêu hóa.
- Sữa: Sữa và các sản phẩm từ sữa là một nguồn probiotic tiềm năng [44]. Trong

3


nhiều thế kỷ qua, vi khuẩn sinh acid lactics (LAB), vi khuẩn Bifido và các vi
sinh vật khác đã được phân lập từ sữa lên men. Những loại sữa lên men truyền
thống chứa các thành phần của loài LAB do đó được coi là một nguồn probiotic
hữu ích. Trong một nghiên cứu gần đây, 148 chủng LAB (trong đó L.

delbrueckii subsp bulgaricus và Streptococcus thermophilus chiếm ưu thế) đã
được phân lập từ Kurut – một loại sữa yak lên men tự nhiên truyền thống từ
Trung Quốc [65]. Sữa mẹ cũng là một nguồn vi khuẩn sinh acid lactic (LAB)
và Bifidobacterium rất tốt để đưa vào các công thức và thực phẩm dành cho trẻ
sơ sinh, trẻ sinh non hay sinh đủ tháng [13]. Ngoài ra, báo cáo chỉ ra rằng các
chủng LAB có trong sữa mẹ cũng được quan sát thấy có trong phân của trẻ sơ
sinh. Sữa mẹ bao gồm một số vi khuẩn như Staphylococci, Streptococci,
Micrococci, Lactobacilli, Enterococci, Lactococci và Bifidobacteria [63].
- Đồ lên men: Các sản phẩm lên men truyền thống là nguồn vi khuẩn sinh học
tự nhiên tiềm năng. Nói chung, hầu hết các vi sinh vật được phân lập từ các sản
phẩm lên men thuộc chi Lactobacillus [73].
- Hệ tiêu hoá: Hệ tiêu hoá của người trưởng thành có hơn 500 loại vi khuẩn
khác nhau, nhiều giống probiotic có thế được phân lập từ nguồn này như L.
gasseri và L. reuteri [57]. Nghiên cứu chỉ ra rằng, L. fermentum được phân lập
từ các loại sinh thiết niêm mạc đại tràng ở người, có tác dụng kháng khuẩn
chống lại mầm bệnh truyền qua thực phẩm [72]. Probiotic có thể phân lập từ
hệ tiêu hoá của nhiều loài động vật như lợn, chuột, thậm chí là gia cầm [55].
Gần đây, L. johnsonii CRL 1647 được phân lập từ hệ tiêu hoá của ong Apis
mellifera L. có hiệu quả lên đại tràng như mật ong [14].
b, Phương pháp phân lập:
Bước đầu tiên trong việc phân lập vi khuẩn là duy trì trong điều kiện
thích hợp trước khi ủ trong môi trường chọn lọc. Hầu hết các probiotic đều là
kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý; do đó phải được đặt ngay lập tức trong điều kiện yếm

4


khí và xử lý càng sớm càng tốt (trong vòng 3 giờ). Các loại vi khuẩn nên được
đồng nhất hóa nhanh chóng, pha loãng và nuôi cấy trong môi trường chọn lọc.
Nghiên cứu phát triển môi trường chọn lọc để phân lập Lactobacillus và

Bifidobacterium từ miệng và phân, sử dụng thạch Columbia có bổ sung thêm
acid propionic [29]. Độ pH thấp của môi trường này, được dung nạp bởi
lactobacilli và bifidobacteria, ức chế sự phát triển của các sinh vật chiếm ưu
thế khác trong phân người, như các Bacteroides và Eubacterium.
Các chủng này được ủ ở 37oC trong 48 - 72 h trong môi trường yếm khí sau đó,
các khuẩn lạc được phân lập và chuyển sang đĩa thạch mới [57].
c, Đặc tính:
Các loài thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium là một trong những
loài quan trọng nhất của men vi sinh. Khi ăn vào, đủ số lượng vi khuẩn hoạt
động trao đổi chất phải tiếp cận được đường dạ dày – ruột (GIT – Gastrointestinal tract) và tồn tại tạm thời trong GIT để phát huy tác dụng có lợi của
chúng. Đặc tính này rất quan trọng. Tuy nhiên, để sống sót trong môi trường
tiêu hoá là một thách thức đối với probiotic, cần phải chịu đựng độ pH cực thấp
(1,5 – 3,0), men dạ dày, muối mật và các enzyme đường ruột khác [46].
1.1.3 Ý nghĩa lâm sàng và các chỉ định tiềm năng của probiotic [57]
Những bằng chứng khoa học về lợi ích mà probiotic mang lại cho sức
khoẻ con người vẫn đang là một lĩnh vực nghiên cứu được quan tâm trên thế
giới hiện nay.
Một trong những đặc tính nổi trội của probiotic là: chống lại tác nhân
gây bệnh, chống béo phì, chống viêm nhiễm, chống ung thư, chống dị ứng, tác
động lên các hoạt động mạch máu, ảnh hướng đến não bộ và thần kinh trung
ương (CNS – Central nervous system).
Chống lại tác nhân gây bệnh: Probiotic ức chế mầm bệnh bằng cách sản
xuất những acid béo chuỗi ngắn (SCFA – Short-chain fatty acids) như acid
acetic , acid propionic. SCFA giúp duy trì độ pH trong lòng đại tràng; tạo điều
5


kiện thuận lợi cho sự hoạt động của enzym vi khuẩn; giúp chuyển hoá các hợp
chất có hại, gây ung thư trong lòng ruột [35]. Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng,
probiotic sản xuất ra những hợp chất chống mầm bệnh như bacteriocin

(Bacteriocin là độc tố protein hoặc peptid do vi khuẩn sản xuất để ức chế sự
phát triển của chủng vi khuẩn tương tự hoặc liên quan chặt chẽ), ethanol, acid
hữu cơ, diacetyl, acetaldehyd, hydro peroxide (H2O2) [31]. Trong số các chất
này, các peptid và bacteriocin làm tăng tính thấm tế bào đích, gây khử cực dẫn
đến chết tế bào [60].
Chăm sóc sức khoẻ đường tiết niệu – sinh dục: Mất cân bằng hệ vi sinh
âm đạo và đường niệu tiềm ẩn nguy cơ nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI –
Urinary tract infection) và âm đạo. Bổ sung Lactobacillus sp. thông qua việc
bổ sung probiotic có thể cải thiện tình trạng này [74].
Chống béo phì: Phản ứng sinh nhiệt và phân huỷ chất béo thông qua
kích thích hệ thống thần kinh giao cảm dẫn đến giảm cân [36]. Các chủng
Probiotic, Lactobacillus gasseri BNR17 đã cho thấy tính chất ức chế sự gia
tăng của mô mỡ là nguồn chính của leptin và adiponectin và do đó, hạn chế sự
tiết leptin. Các vi khuẩn sinh học khác như L. casei, Lactobacillus acidophilus
và Bifidobacterium longum cũng đã được báo cáo là có tác dụng hạ mỡ máu
[36].
Chống viêm nhiễm: Bệnh viêm ruột (IBD – Inflammatory bowel
disease) bao gồm hai loại bệnh là viêm loét đại tràng và bệnh Crohn [30].
Nghiên cứu chỉ ra rằng sự mất cân bằng trong hệ vi sinh đường ruột là một
trong những nguyên nhân dẫn đến IBD, bổ sung probiotic có thể cải thiện được
tình trạng này. SCFA giúp duy trì môi trường trong đại tràng, IBD có mối liên
quan chặt chẽ với SCFA. Probiotic sản xuất SCFA, cải thiện chức năng đại
tràng, tăng cường chức năng chống viêm. Hiện nay, tiến bộ trong lĩnh vực này
chủ yếu liên quan đến việc phát triển các chủng probiotic biến đổi gen có khả
năng sản xuất và tiết các chất miễn dịch, như interleukin-10, các yếu tố phá hủy
6


(các sản phẩm nhỏ gọn được biểu hiện với chất nhầy trong đường tiêu hoá),
hoặc axit lipoteichoic (một thành phần chính của thành tế bào của vi khuẩn

gram dương) có thể tác động đến hệ thống miễn dịch của vật chủ. Lactobacillus,
Bifidobacterium, Enterobacter và E. coli là những chế phẩm sinh học được sử
dụng rộng rãi nhất trong thực phẩm [28].
Chống ung thư: Các nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng các chủng
vi khuẩn Lactobacillus fermentum NCIMB-5221 và -8829 có tác dụng mạnh
trong việc ức chế tế bào ung thư đại trực tràng và thúc đẩy tăng trưởng tế bào
biểu mô bình thường thông qua việc sản xuất SCFAs (axit ferulic). Khả năng
này cũng được so sánh với các chế phẩm sinh học khác là L. acidophilus ATCC
314 và L. rhamnosus ATCC 51303 cả hai đều đã được chứng minh có khả năng
tác động lên hoạt động của bệnh ung thư [32]. Hai chủng vi khuẩn sinh học
khác nhau là L. acidophilus LA102 và L. casei LC 232 được công bố là có các
hoạt động chống lại hai dòng tế bào ung thư đại trực tràng (Caco-2 và HRT18) [15]. Mặc dù probiotic có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc vô
hiệu hóa ung thư, song các nghiên cứu chỉ giới hạn trong các thử nghiệm in
vitro. Do đó, tiềm năng chống ung thư của probiotic phải được chứng minh trên
các mô hình in vivo và tiến hành thử nghiệm lâm sàng trên động vật.
Chống dị ứng: Trong thời gian gần đây, vai trò có lợi của probiotic trong
việc bảo vệ và quản lý các bệnh dị ứng đã nâng cao sự hiểu biết về nguyên nhân
và cách phòng ngừa của chúng. Nghiên cứu in vitro trên những probiotic nhất
định, như Lactobacillus plantarum L67, đã cho thấy khả năng ngăn ngừa các
rối loạn liên quan đến dị ứng với việc sản xuất interleukin-12 và interferon
trong vật chủ. Trong một nghiên cứu khác, L. plantarum 06CC2 làm giảm đáng
kể các triệu chứng dị ứng và làm giảm nồng độ immunoglobulin E và histamine
trong huyết thanh của chuột. Trong các tế bào lá lách của chuột, L. plantarum
06CC2 được cho là có tác dụng tăng cường đáng kể sự tiết của interferon và
interleukin-4, làm giảm bớt các triệu chứng dị ứng [66].
7


Tác động lên các hoạt động mạch máu: Sự hình thành mạch là một hiện
tượng quan trọng và cần thiết cho quá trình chữa lành vết thương thông qua các

phản ứng tế bào nhằm tái tạo các mô bị tổn thương. Quá trình tạo mạch bao
gồm một loạt các phản ứng tế bào được sắp xếp có chủ ý trong đó mạch mới
phát sinh từ các tế bào đã tồn tại từ trước bằng cách thúc đẩy thu hút các tế bào
viêm và sản xuất các cytokine. Cơ chế của probiotic trong quá trình tạo mạch
có thể bao gồm thay đổi cấu hình cytokine gây viêm, điều chỉnh giảm các dòng
tiền viêm hoặc khởi phát các cơ chế điều tiết theo cách đặc hiệu của chủng,
tăng cường chức năng hàng rào biểu mô, giảm mẫn cảm nội tạng, giảm lưu
lượng nội tạng [18].
Tác động lên bộ não và thần kinh trung ương: Trục vi khuẩn – tiêu hoá –
não bộ là một phản ứng hai chiều, tương tác được thiết lập bằng cách trao đổi
các tín hiệu giữa đường tiêu hoá và thần kinh trung ương [47]. Tác dụng của
probiotic đối với hệ thần kinh trung tương đã được nghiên cứu trong các thử
nghiệm lâm sàng, trong đó rõ ràng là hệ vi sinh đường ruột có ảnh hưởng đến
chức năng phát triển não bộ của con người [69]. Ở những trẻ em rối loạn phổ
tự kỷ, bổ sung L. plantarum WCFS1 (4,5 x 1010 CFU/ngày) giúp các em cải
thiện kết quả học tập, hứng thú với đồ ăn hơn [71]. Sử dụng chủng L. casei làm
giảm các triệu chứng lo âu ở các bệnh nhân mắc hội chứng mệt mỏi mãn tính
[56].
1.2 Loài Lactobacillus acidophilus
1.2.1 Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy L. acidophilus
Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus,
nhóm vi khuẩn sinh acid lactic (LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của
người và động vật, được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm probiotic [2].
Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, Gram dương, kích thước
thường là 0,6-0,9 × 1,5-6,0 𝜇𝑚, tồn tại đơn lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn,
không sinh bào tử, không di động, kị khí không bắt buộc, phản ứng catalase âm
8


tính. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển là 37ºC, tối đa trong khoảng 43-48ºC,

không phát triển trong khoảng 20-22ºC, có khả năng chịu được điều kiện pH
khoảng 5,0 đến 6,0 trong 24-36 giờ, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo
ra sản phẩm L (+) lactic [2].

Hình 1.2: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
Khả năng sống sót của L. acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
nhiệt độ, pH, nồng độ acid lactic và acid acetic, nồng độ oxy hòa tan (khuếch
tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản). Trong đó, nồng độ oxy hòa
tan có vai trò đáng kể trong việc hạn chế khả năng sống sót của L. acidophilus.
Nhược điểm này khiến số lượng L. acidophilus sống sót bị giảm đáng kể sau
một thời gian bảo quản [22].
1.2.2 Vai trò [23]
Lactobacillus acidophilus đem lại nhiều tác động có lợi đối với sức khỏe
giống như những probiotic khác:
- Cạnh tranh vị trí, làm giảm số lượng vi sinh vật hoặc nấm gây hại ở ruột
non, có khả năng sinh lactase - một enzym quan trọng liên quan quá trình
chuyển hóa sữa.
- Tạo môi trường acid thuận lợi cho hệ lên men đường ruột và đồng thời
ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh Gram (-).
- Tổng hợp các vitamin, ngoài ra còn có khả năng sản xuất acid lactic và
các chất diệt khuẩn như Lactocidin, Bacteriocin.
- Điều trị các bệnh đường tiêu hóa như táo bón, tiêu chảy....
9


- Giảm sinh tổng hợp cholesterol.
- Ức chế các vi khuẩn đường ruột chuyển đổi tiền chất gây ung thư thành
chất gây ung thư.
- Chủng L. acidophilus LA -5 có tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng
cytokine tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể.

1.3 Tổng quan về vi nang
1.3.1 Định nghĩa
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác
định, kích thước từ 0,1 µm đến 5mm (thông thường từ 100 - 500 µm) bên trong
chứa hoạt chất dạng lỏng hoặc rắn, còn bên ngoài được bao bằng màng mỏng
polyme liên tục [52].
Hợp chất vi nang hoá thường được gọi là nguyên liệu lõi, tác nhân hoạt
động, tác nhân làm đầu, pha nội hay pha tải. Hợp chất dùng làm vi nang gọi là
màng bao, bao, chất mang, pha ngoại hay ma-trix. Với những kĩ thuật phức tạp
như phun sấy, hợp chất dùng để làm vi nang còn gọi là chất chống lạnh [43].
Có nhiều loại vi nang khác nhau: hệ chứa, ma-trix và bao ma-trix. Hệ chứa bao
gồm một lớp bao quanh lõi. Ma-trix gồm pha nội phân tán trên chất mang và
có thể tìm thấy ở trên bề mặt. Vi nang thứ 3 – bao ma-trix: phối hợp giữa 2 loại
vi nang trên pha nội là một vi nang được bao thêm bởi một lớp bên ngoài [41].

Hệ chứa

Ma-trix

Bao ma-trix

Hình 1.3: Các loại vi nang
Thiết bị kính hiển vi điện tử giúp xác định phạm vi kích thước của vi
nang chứa vi khuẩn và vi nang placebo, vi nang cấu trúc ma-trix hay vi khuẩn
10


bị “bẫy” trong ma-trix bởi bất cứ nguyên nhân nào. Thiết bị kính hiển vi điện
tử quét (SEM) giúp xác định cấu trúc, cấu hình, phân bố kích thước vi nang,
xác định vi nang có chứa vi sinh vật hay không. Thiết bị kính hiển vi điện tử

truyền qua (TEM) giúp xác định cấu trúc ma trận với độ phân giải tốt hơn: về
độ xốp của vi nang cũng như sự có mặt của vi khuẩn trong vi nang [9].
1.3.2 Các nguyên liệu sử dụng để tạo vi nang
a,Polysaccharid
Agar, natri alginat, carrageenan - nhóm các polysaccharid mạch thẳng
sulfat hóa, gôm arabic, chitosan, dextrans, tinh bột và cellulose (ethyl –
cellulose, acetyl – cellulose, methyl – cellulose, carboxymethyl – cellulose,
nitrocellulose) là những nguyên liệu bao cơ bản được dùng trong vi nang [43].
Alginat
Natri alginat là nguyên liệu phổ biến nhất, thích hợp với phương pháp vi
nang hoá, và thường dùng chung với những hợp chất khác.
Nó là một chất đồng trùng hợp vô định hình tuyến tính, không phân nhánh gồm
axit β-D- manuronic (M) và axit α-L-guluronic (G) được nối với nhau bằng liên
kết 1-4-glycosid.

Hình 1.4: Cấu trúc của alginat
Thành phần hóa học và phân phối của một chuỗi alginat natri phụ thuộc
vào loài và các bộ phận của tảo được sử dụng trong chiết xuất. Alginat có tỷ lệ
khối G cao (tỷ số M/G thấp) tạo gel cứng hơn. Ngược lại, alginat chủ yếu là
khối M thì gel hình thành mềm hơn và đàn hồi hơn [54].

11


Natri alginat được sử dụng rộng rãi như một chất keo, do khả năng tạo
hydrogel với các cation hóa trị hai, như Ca+2, Ba+2, Sr+2. Hydrogel được hình
thành do các khối của axit guluronic liên kết với các cation, dẫn đến một mạng
lưới ba chiều của các sợi alginat được giữ cùng với các tương tác ion.

Hình 1.5: Sự hình thành và cấu trúc của calci alginat

Mô hình mô tả đúng nhất về mạng này là "mô hình hộp trứng". Natri alginat ở
nồng độ 20 g/L kết hợp với whey protein sữa ở mức 10 g/L để tạo vi nang chứa
L. plantarum 299v, L. plantarum 800 và L. plantarum CIP A159 bằng phương
pháp đông khô [61].
Ưu điểm của vi nang calci alginat: (1) calci alginat không độc khi sử
dụng theo đường uống và có tác dụng bảo vệ niêm mạc của đường tiêu hóa
trên; (2) cấu trúc của calci alginat là màng gel bán thẩm thấu, lớp màng có độ
ổn định cao, giúp làm lá chắn chống lại các tác nhân bất lợi bên ngoài môi
trường và giải phóng vi sinh vật một cách có kiểm soát; (3) sự trương nở của
calci alginat phụ thuộc vào pH, do đó có thể bảo vệ vi sinh vật khỏi tác động
của acid dạ dày; (4) quá trình vi nang hóa VK bằng alginat thực hiện dễ dàng,
đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến VK sống
[27]. Nhờ những ưu điểm trên, alginat là một trong những nguyên liệu phù hợp
trong việc bào chế vi nang.

12


Tinh bột
Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, có tính tương hợp sinh học. Tinh
bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch, được sử dụng làm tá dược độn
phổ biến, giá rẻ và có thể được phân hủy bởi α-amylase [58].
Tinh bột là một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm
giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào trong loại [51]. Khi tạo vi nang
calci alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện
thể chất của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng
sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản [8].
Chitosan
Chitosan là một polyaminosaccharid sinh học tự nhiên thu được từ phản
ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của Nacetylglucosamin và dẫn xuất đường glucose. Khi mức độ deacetyl hóa của

chitin đạt khoảng 50% (tùy thuộc vào nguồn gốc của polyme), nó có khả năng
tan được trong dung dịch có tính acid và được gọi là chitosan [45].

Hình 1.6: Cấu trúc phân tử chitin và chitosan
Chitosan có tính nhớt. Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng lên khi tăng
nồng độ chitosan, giảm nhiệt độ và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của
chitosan. Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu, thấm nước, tan
trong hầu hết các dung dịch acid hữu cơ ở pH ˂ 6,5 do trong môi trường acid,
những nhóm amin (các tiểu đơn vị glucosamin) của chitosan nhận proton tạo

13


thành dạng polysaccharid tích điện dương tan được. Chitosan không tan trong
môi trường trung tính và kiềm [45].
Với ưu điểm là độc tính thấp, tương hợp sinh học cao với tế bào vi khuẩn
và tự phân hủy được nên chitosan thường được dùng làm chất mang trong công
nghệ dược phẩm.
Trong quá trình tạo vi nang probiotic, chitosan có vai trò cung cấp một
lớp bao phủ hiệu quả, hạn chế các tác động bất lợi của acid dạ dày, đảm bảo
VSV có thể đi qua đường tiêu hóa đến ruột già mà vẫn đủ số lượng VSV cần
thiết phát huy tác dụng [11].
Sử dụng chitosan với nồng độ 1% kl/tt để “bẫy” các chủng Lactobacillus
acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994 và L. casei 01, đã mang
lại khả năng sống sót cao hơn cho các tế bào L. acidophilus [40].
b, Oligosaccharid
Si-rô ngô, sucrose và maltodextrin là những oligosaccharid được dùng
phổ biến. Khi phối hợp maltodextrin với trehalose làm chất mang L. paracasei
trong kỹ thuật sấy lạnh hoặc đông khô giúp giữ được tỷ lệ vi khuẩn sống sót
cao. Tăng hàm lượng trehalose giúp tăng tỷ lệ VSV sống sót do đặc tính áp

suấp thấm lọc cao [42].
c, Lipid
Sáp, parafin, diglycerid, monoglycerid, chất béo, acid stearic, triestearin
và các loại dầu thường được sử dụng. Sử dụng dầu trong vi nang Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus bằng phương pháp nhũ hoá tăng tỷ lệ VSV sống
sót lên 5,4% so với tế bào tự do ở điều kiện lạnh. Trong điều kiện tiêu hoá, tỷ
lệ VSV sống sót cũng cải thiện hơn [43].
1.3.3 Các phương pháp tạo vi nang
a, Phun sấy
Phun sấy là một công nghệ ứng dụng sản xuất vi nang có kích thước lớn.
Một chất lỏng được phân tán trong một thùng chứa sử dụng vòi hoặc đĩa, chất
14


lỏng hoà tan bay hơi sau khi tiếp xúc với khí nóng. Công nghệ này được cân
nhắc ứng dụng với vi nang chứa Lactobacillus app. và Bifidobacterium [42].

Hình 1.7: Mô tả quá trình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp phun sấy
[43]
Các thông số quá trình [43]:
- Dòng khí: cùng chiều hoặc ngược chiều
- Sự tương thích giữa nguyên liệu chất mang và chủng giống
- Nguyên liệu chất mang: độ nhớt thấp cho dòng chảy dễ dàng, không có hương
vị, độ hoà tan cao
- Nhiệt độ sấy: số lượng vi sinh vật giảm tuyến tính theo nhiệt độ không khí đầu
ra. Nhiệt độ tối ưu phải thấp nhất có thể và nhiệt độ đầu vào khoảng 150 –
170oC.
- Thời gian sấy: thời gian sấy ngắn giúp cải thiện tỷ lệ sống sót của vi sinh vật
- Điều kiện bảo quản: hoạt độ nước thấp (<0,25) và nhiệt độ thấp (4oC). Sử dụng
sữa chua tăng độ ổn định trong quá bảo quản. Nhiệt độ khoảng 19 – 25oC đã

được sử dụng để đánh giá khả năng sống sót của vi khuẩn trong vi nang điều
kiện môi trường bất lợi.

15